Name: propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-08-13T14:00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

我们要感谢斯宾塞·布兰肯希普在蚊子饲养方面的帮助。我们还感谢詹姆斯·拉德尔和多米尼克·马吉斯特拉多对手稿的有益反馈。

1. 第 0 天
<ol><li>将 1升（DI） 水放入幼虫饲养托盘中，将蛋类蛋与 E.aedis 感染。加入50毫克的鱼食。 注：在出版时 ，E.aedis的实验室 菌株只能从积极研究寄生虫的实验室获得， 因为E.aedis 不能长期储存，受感染的卵子目前不储存在储存库中。有兴趣与 E.aedis合作的研究人员 可以联系相应的作者，请求受感染的卵子。 注：通常不需要孵化大量受感染的鸡蛋; 10个E.aedis 感染的 E.aegypti 幼虫足以给1000≥剂量。 注：对于本协议的所有部分，我们在以下条件下安置蚊子：14 小时/10 小时光/暗循环、27 °C 温度和 80% 相对湿度。</li>
</ol>2. 第 1 天
<ol><li>孵化后，将幼虫密度降低至每托盘+100幼虫，必要时制作新托盘（也用1升DI水）。</li>
	<li>在每个托盘中加入一块干猫粮。耗尽食物后补充食物，但不提供过量的食物。每三天一块猫粮（约200毫克）就足够了。 注：根据特定的饲养条件调整食物量（即，如果水变得浑浊或幼虫死亡，减少食物;如果幼虫发育严重延迟，则减少食物）。可以使用此处建议的其他喂养方案和/或饲养条件，但可能需要调整此标准协议的时间安排。</li>
</ol>3. 第 4 天\u20125
<ol><li>当受感染的幼虫是3~4星时，在一个新的托盘中孵化出健康/未受感染的Ee.aegypti卵子。</li>
	<li>后方的密度， 使健康的 Ae. aegypti 达到2 + 3第 三星在 48 - 72 小时。在我们手中，这可以通过密度200\u2012300幼虫每1升水与 副利比 图姆获得食物。多日孵化一批健康卵子可以保证幼虫在需要的时候处于正确的阶段。</li>
</ol>4. 第 7 天\u20128： 水平传输
注：在感染幼虫中，在单核孢子数量高（1 x 104 = 1 x 106 6，每个幼虫）中，不能对健康的幼虫进行对健康的幼虫的给给。这发生在第4星阶段的后期（图2）。
<ol><li>收获和量化单核孢子。<ol>
<li>使用转移移液器（可能需要将尖端切到更宽的直径）将 10 个受感染的幼虫移动到 1.5 mL 微离心管。</li>
		<li>用转移移液去除育种水，加入±1 mL的清洁DI水洗一次。用移液去除洗涤水，在10个幼虫中加入500μL的清洁DI水，并使用害虫和机械均质器均质化。</li>
		<li>使用血细胞计以 400 倍的放大倍率量化孢子。 注：核糖孢子可以通过其独特的火种形状（即梨形）来识别;图2A）。</li>
	</ol>
</li>
	<li>剂量 健康 Ae. aegypti 幼虫与 E. aedis.
	<ol>
<li>混合1.2克肝粉、0.8克啤酒酵母和100 mL水，制作新鲜的幼虫食品浆料。 注：如果食物被自动保存并储存在4°C，直到使用，就不需要新鲜。</li>
		<li>将 1002 – 3第 3 个星健康 Ae. aegypti 幼虫转移到 150 mL 烧杯或标本杯中。</li>
		<li>剂量每个烧杯100幼虫与5 x 104 × 1 x 105 孢子。</li>
		<li>将 2 mL 的幼虫食物浆料和 DI 水加入到 100 mL 的最终体积中。</li>
	</ol>
</li>
	<li>在12~24小时暴露后，按照标准的饲养方案16将暴露的幼虫转移到饲养托盘和成年后。</li>
</ol>5. 监测和垂直传输
<ol><li>监测被点幼虫的幼崽，并在它们发育到笼子里出现杯时，将幼虫转移到它们。糖饲料成人广告（根据16，17）。与成人接触的成人将被感染。</li>
	<li>血液喂养成人（根据16，17）和收集鸡蛋。E. aedis 的垂直传输在此步骤中发生。 注：如果一旦卵巢完成就提供额外的血餐，女性在成人遭受（通常是突然）高死亡率之前，至少可以多产一组卵子。</li>
	<li>使用这些 感染 E. aedis 的 Ae. aegypti 卵子 ，从本协议的第 1 步开始继续繁殖。 注：鸡蛋在适当条件下可储存2~3个月。</li>
	<li>用 10% 漂白剂和高压灭灭（如果可能）清洁所有与 E. aedis 接触的材料，以防止污染。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yellow fever. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever</a> (2019)</li><li>Dengue and severe dengue. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue</a> (2020)</li><li>Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+and+prevention+of+urban+arbovirus+epidemics+:+A+challenge+for+the+global+virology+community.">Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community.</a> Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).</li><li>Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Control+Strategies+to+Counter+Dengue+Virus+Infection.">Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection.</a> Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).</li><li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Amblysporidae)+as+a+biocontrol+agent+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , 20-24 (1990).</li><li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Culicosporidae)+on+a+seminatural+population+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).</li><li>Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Edhazardia+aedis+(Kudo,+1930)+N.+G.,+N.+Comb.+(Microsporida:+Amblyosporidae)+in+the+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Hembree, S. C., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+vertical+transmission+of+a+new+microsporidian+pathogen+of+Aedes+aegypti+from+Thailand.">Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand.</a> Mosquito News. 42, 49-54 (1982).</li><li>Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sporulation+sequence+in+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Culicosporidae),+a+parasite+of+the+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).</li><li>Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edhazardia+aedis+(Microspora:+Culicosporidae)+effects+on+the+reproductive+capacity+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).</li><li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+host+range+and+specificity+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Culicosporidae).">Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae).</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).</li><li>Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+tests+with+Edhazardia+aedis+(Microsporida:+Culicosporidae)+against+northern+Nearctic+mosquitoes.">Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).</li><li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Amblyosporidae)+for+nontarget+aquatic+organisms.">Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).</li><li>Undeen, A. H., Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+germination+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Amblyosporidae)+spores.">Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores.</a> Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).</li><li>Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.">T.</a> Automated mass rearing system for insect larvae. , (2018).</li><li>Methods in Aedes Research. BEI Resources Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf">https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf</a> (2016)</li><li>Methods in Anopheles Research. BEI Resources Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf">https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf</a> (2014)</li><li>Desjardins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+host-pathogen+interactions+and+genome+evolution+in+two+generalist+and+specialist+microsporidian+pathogens+of+mosquitoes.">Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).</li><li>Hembree, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Report+of+some+mosquito+pathogens+from+Thailand.">Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand.</a> Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).</li><li>Solter, L. F., Becnel, J. J., V&#225;vra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+methods+for+entomopathogenic+microsporidia+and+other+protists.">Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 329-371 (2012).</li><li>Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temperature+on+developmental+parameters+of+the+parasite/host+System+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Amblyosporidae)+and+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).</li></ol>

作者没有什么可透露的。

我们在这里介绍最初在亨布里和瑞安中描述的方法，1982年8月8日，在艾艾普提蚊子中饲养E.aedis微孢子。 本研究中使用的E.aedis菌株来源于1979年19月19日斯蒂芬·亨布里在泰国的原始现场收集。该方法利用水平传播，这自然发生在E.aedis7的传输周期，以受控的方式传播寄生虫。对于不熟悉孢子外观、幼虫感染症状或成功完成多阶段饲养/给法协议所需的协调的新人，此方法可能具有挑战性。我们希望，伴随该协议的视觉辅助工具将减少研究人员的进入障碍，他们希望培养E.aedis。
我们如上文所述在艾吉普提传播了E.aedis，并量化了孝顺一代寄生虫的成功。简言之，我们孵化了E.aedis感染的E.aegypti卵子，把它们饲养到第4个星，从受感染的幼虫中收集了单核E.aedis孢子。然后，我们通过口服摄入用这些孢子水平感染健康幼虫，并饲养水平感染的幼虫到成年。我们用血喂养受感染的成年人（父母一代），并采集卵子（孝生一代），我们假设这些卵子会垂直感染E.aedis寄生虫。我们从孝感一代孵化出卵子，在幼崽是第4个星时，采集并同化了一部分幼虫。我们量化了感染E.aedis的幼虫百分比和所有感染者的总孢子数。我们发现绝大多数（96%）被感染者，被感染幼虫平均孢子负荷为+105。我们的结论是，我们的饲养协议在艾吉普提蚊子中非常成功地传播了E.aedis。 
此协议有多个方面对未启动的用户可能特别具有挑战性。我们提供以下一些可能提供帮助的其他信息。对于一般蚊子饲养的问题，Ae. aegypti菌落维护的完整指南超出了本协议的范围。然而，许多常见问题可以通过来自生物防御和新兴感染研究资源库16，17的资源可以解决，包括卵子孵化，一般饮食需求，住房和环境条件，以及血液喂养。关于感染的时间表，从受感染的卵子中孵化的幼虫直到4号星期后期才出现感染迹象。在1~2天中，核糖孢子迅速出现。幼虫在孵化后6天可能看起来几乎未感染，但在第7天或第8天孵化后感染高度。此外，在均质样品中可视化孢子可能具有挑战性，因为整个蚊子同质质中存在许多其他微生物，包括与E. aedis单核孢子大小相类似的其他真核单细胞生物（例如酵母）。E.aedis孢子的独特形状（图2A）是一种高度可靠的识别方法，有助于将E.aedis与同质质的其他微生物区分开来。虽然不需要进行鉴定或定量，但如果需要孢子纯化，可以通过胶体二氧化硅密度梯度离心实现，从而允许将E.aedis孢子与同质质的其他污染元素分离。这个过程在Salter等人20中详细描述了。
在饲养实践中使用的温度和饮食在实验室之间通常有所不同，但变异仍可能产生成功的寄生虫传播。幼虫食物类型的细微差异不会干扰成功感染，尽管我们没有明确测试此协议中不同的食物类型。温度对感染的影响已经过测试，在21日的广泛温度下，发现 E.aedis 感染是健壮的。最大孢子产量发生在30.8 °C，但在饲养温度低至20°C时仍然强劲。 孢子计数在较高的饲养温度（36°C）下显著减少，因此本协议应避免这些温度。
在使用寄生虫时，污染始终是一个问题。 E. aedis 是 Ae. aegypti 的一种成功的寄生虫 ，因此必须与未受感染的实验室菌落分开以防止污染。如果可能，我们建议将受感染的蚊子储存在单独的孵化器中。我们还建议，用于微孢子工作的材料（如幼虫托盘、转移移液管、笼子、鸡蛋收集杯）指定用于微孢子工作，而不是在整个昆虫中更广泛地使用。所有饲养材料应在使用后用 10% 漂白剂消毒，并可用于补充漂白剂灭菌。

伊蚊是多种病毒（如登革热、寨卡、黄热病）的蚊媒，估计每年可导致数亿例疾病病例，12人死亡3万多人。这些病原体引起的疾病的治疗仅限于支持性护理，而且未来3日可能会出现更多的病毒。因此，控制蚊媒是首要的，因为它有效地防止了当前和新出现的病原体的传播。传统上，病媒控制战略主要使用化学杀虫剂，但对许多常用杀虫剂的抗药性推动了对病媒控制新方法的需求。一个潜在的代理，已被探索的生物控制性质对艾吉普提是寄生虫Edhazardia aedis5，6。
E.aedis，1930年由库多首次确定为诺塞玛伊迪斯，是一种微型寄生虫，是7种阿吉普提蚊子的微生物寄生虫。 E.aedis的开发和繁殖是比较复杂的，其生命周期可以以多种方式进行7、8、9。一个常见的发育周期在贝克内尔等人，1989年7日深入描述，并用于实验室传播（图1）8。简言之，当Ae.aegypti卵子垂直感染E.aedis孵化成受感染的幼虫时，这个周期就开始了，幼虫体内会形成单核孢子，通常以幼虫或幼虫死亡。从死幼虫中释放的核孢子污染了栖息地，并由健康的Ae. aegypti 幼虫摄入。这些孢子主要在消化道发芽，感染暴露的幼虫的消化组织，导致水平传播。水平感染的幼虫发育成成人（父母生成），在那里形成双核孢子。在女性中，这些双核糖孢子侵入生殖道，其相关的孢子体感染发育中的卵细胞。这些卵子然后孵化成受感染的幼虫（孝长），导致寄生虫的垂直传播和循环的延续，如上所述。
多项研究已经调查了E.aedis在生物控制方面的潜力。感染E.aedis已经证明会导致10岁女性繁殖能力下降。此外，在半场实验中，E.aedis的淹没释放导致完全消灭了保存在筛选的外壳6中的一个测试Ae. aegypti 种群。虽然E.aedis能够在多种蚊子中经历一些发展阶段，但只在E.aegypti中垂直传播，表明宿主特异性11，12。同样，在实验室评估与E.aedis相关的潜在环境风险时，微孢子寄生虫未能感染非目标水生动物，包括摄入感染E.aedis13的食肉动物。这些结果突出了E.aedis在针对自然Ae. aegypti 种群的生物控制策略中使用的潜力。
尽管E. aedis 在矢量控制中显示出了使用的希望，但大规模培养和部署它却面临挑战。E. aedis孢子在低温（即5°C）下不到一天就会失去感染性。即使在温暖的温度（即25°C）下，孢子在三周14日之间迅速失去感染力。此外，必须培养活的艾吉普提蚊子和控制给健康的幼虫蚊子给，以确保完成生命周期，并防止用于培养8的人口崩溃。体内培养的要求提出了挑战;然而，最近蚊子大规模饲养和机器人技术（如马萨罗等人15）的进步可能允许大规模生成E.aedis孢子。我们预计，这种方法的可视化将增加对E.aedis饲养协议的可访问性，并允许更多的研究人员研究该系统的基本生物学和应用潜力。我们还预计，这将促进与工程师、机器人学家和更广泛的技术部门加强合作，从而有助于改善E.aedis的大规模饲养。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig01v2.jpg"> 图1：E.aedis在艾吉普提的传播。 E.aedis 的传播始于孵化E. aedis 感染的卵子。受感染的幼虫被饲养到第4个星，E.aedis孢子从这些幼虫中分离出来，孢子用于口头感染健康的2/3第三星幼虫，这些幼虫从未受感染的卵子（水平传输）中饲养。这些口头感染的幼虫然后被饲养到成年（父母一代），并产卵感染E.aedis（垂直传播）。受感染的卵子（孝生代）然后孵化，以继续感染周期和寄生虫培养。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig01large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120 mL Specimen cup</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>911759</td>
			<td>Inexpensive alternative to beaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL beakers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-950</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz round glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10862-502</td>
			<td>Bottle for 10% sucrose in adult cages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 oz. emergence cup</td>
			<td>Henry-Schein</td>
			<td>1201502</td>
			<td>For transfer of pupae to cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult mosquito cages</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1462 or 1450ASV</td>
			<td>For adult housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewer&#8217;s yeast</td>
			<td>Solgar</td>
			<td></td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled rearing chamber</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-MP-47L</td>
			<td>Inexpensive small rearing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton roll</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470161-446</td>
			<td>Wick for sugar bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated rabbit blood</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50863762</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium ATP, crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209-5G</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry cat food</td>
			<td>9Lives</td>
			<td>Indoor Complete</td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food flakes</td>
			<td>TetraMin</td>
			<td></td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>267110</td>
			<td>For counting spores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer/mixer motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing trays</td>
			<td>Sterillite</td>
			<td>1961</td>
			<td>Overall dimensions are 11&#34; x 6 5/8&#34; x 2 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver powder</td>
			<td>NOW foods</td>
			<td>2450</td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-962</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-048</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-446</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystalline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15503022</td>
			<td>For adult feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-033</td>
			<td>For larval transfer, must trim ends</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes

Edhazardia aedis是伊蚊的微孢子寄生虫，伊蚊是一种传播多种病毒的病媒，每年导致数百万例疾病病例。E. aedis导致蚊媒的死亡和繁殖能力下降，并已被探索其作为生物控制剂的潜力。我们为培养E.aedis而呈现的协议基于其自然感染周期，它涉及蚊子宿主不同生命阶段的水平和垂直传播。ae. aegypti蚊子在幼虫阶段暴露在孢子中。这些受感染的幼虫然后成熟成成人，并将寄生虫垂直传至后代。然后，受感染的后代被用作孢子的来源，用于未来的水平传播。鉴于寄生虫的生命周期的复杂性，培养E.aedis对未启动者可能具有挑战性，该协议提供了详细的指导和视觉辅助工具，用于澄清。

E. aedis感染了Ae. aegypti利物浦 （LVP1b12） 鸡蛋孵化，如上述协议所述。在第4个星形阶段，可以观察到感染的视觉迹象，包括整个受感染幼虫的脂肪体中的白孢子囊肿（图2B所示）。核糖孢子是在500μL DI水中均质10幼虫，从第4个星体幼虫中收获的。这些孢子是火种（梨形），在400倍时很容易看到（图2A）。使用血细胞计计算孢子计数为4.05 x 103孢子/μL。100个健康的Ee.aegypti幼虫随后在100 mL水中水平感染50，000个孢子，最终剂量为500个孢子/幼虫。幼虫被饲养到成年（父母一代）和血液喂养使用除颤的兔血加上1%（v/v）100 mM腺苷三磷酸盐。垂直感染的卵子被收集（孝代）和孵化，以继续E.aedis繁殖和量化感染成功。
在孵化后7天，25个孝感代幼虫被转移到单独的1.5 mL微离心管中，用DI水洗涤一次。在250μL的DI水和感染状态中，个体幼虫均质化，使用血细胞计评估E.aedis负载。发现孝感代E.aedis的垂直感染率为96%，孵化后7天感染者平均孢子负荷为3.31×105（范围：3.25×104 ~1.47×106;图3.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig02v2.jpg"> 图2：Ae.aegypti蚊子的E.aedis感染的可视化。（A ） E. aedis单核状孢子.10个E.aedis感染的第4个星幼虫在孵化后大约7天在500μL的DI水中均质化。10 μL 的均质被加载到血细胞计上，以 400 倍的速度查看。红色箭头表示具有代表性的单核E. aedis孢子。（B） E.aedis感染第4个星体幼虫在其脂肪体中形成独特的白色孢子囊肿18。他们通常也有畸形和扩张的腹部部分。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig02large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig03.jpg"> 图3：文化协议导致孝感 代有效 感染。孝感代的 Ae. aegypti 幼虫 （n = 25） 在 250 μL DI 水中单独均质，10 μL 的均质被加载到血细胞计上。单核孢子的存在表明感染呈阳性，孢子被量化为所有阳性样本。（A） 孝感幼虫感染的流行率。灰色对应于未感染的幼虫，黑色对应于感染。每个段上显示的数字给出每个组中个人的绝对计数。（B） 每个感染者的孢子负载。黑点表示每个幼虫的日志 10 转化的单核孢子计数。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig03large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本。</a>

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Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

培养微孢子寄生虫Edhazardia aedis的规程。寄生虫从一代伊蚊通过幼虫阶段的水平转移传递到下一代，随后在成人阶段垂直传播。活的精子在受感染的卵子中长期存活。

在伊蚊中传播微孢子寄生虫Edhazardia aedis

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Edhazardia aedis 是一种微孢子寄生虫，专门感染伊蚊。由于寄生虫的生命周期的复杂性，饲养这种寄生虫对新的研究人员来说可能具有挑战性。该协议为饲养E.aedis提供了分步指导，包括如何正确时间测量程序的步骤，识别传染性孢子，以及传播下一代寄生虫。此协议的准确计时可能具有挑战性，可能需要一些试验和错误。识别孢子也可能很困难。此协议中的视觉辅助工具应提供帮助。首先，孵化感染E.aedis的 A.aegypti 蛋，用一升去电化水将其放入幼虫饲养托盘中，并加入 50 毫克的鱼食。蚊子在27摄氏度和80%的相对湿度下，有14小时光，10小时黑暗循环。孵化后，将幼虫的密度降低至每托盘约100幼虫，使新的托盘。必要时。在每个托盘中加入一块干猫粮。耗尽食物后补充食物，但不提供多余的食物。每三天吃一块200毫克的猫粮就足够了。当受感染的幼虫是第三至第四星时，将未受感染的 A.aegypti 卵子孵化成一个新的托盘。以密度将蚊子后部，使健康的 A.aegypti 在 48 到 72 小时内达到第二至第三星。多日孵化一批健康卵子可以保证幼虫在需要的时候处于正确的阶段。要收获和量化单核孢子，请使用转移移液器将10个受感染的第四个星体幼虫移动到1.5毫升微离心管。用转移移液器去除育种水，通过加入大约一毫升清洁的去ionde水清洗幼虫一次。去除洗涤水，在10个幼虫中加入500微升清洁脱水，并使用害虫和机械均质器将其均质化。将 10 微升的均质在血细胞计上，以 400 倍的放大倍率量化孢子。混合1.2克肝粉、0.8克布鲁尔酵母和100毫升水，制作新鲜的幼虫食品浆料。将 100 秒至第三星健康 A.aegypti 幼虫转移到 150 毫升烧杯或标本杯中，并添加 5 倍 10 至 4 至 1 倍至第五孢子到每个杯子中加移液器。加入两毫升幼虫食物泥浆和去维化水，最终体积为100毫升。12 至 24 小时后，将幼虫转移到饲养托盘中。添加食物，并把它们养大成。监测被点幼虫的幼崽，将幼崽转移到笼子里的出现杯中。糖饲料成人 ad libitum 。根据 BEI 资源提供的标准协议为成人提供血液。从用血喂养的成年人那里收集鸡蛋。E.aedis 的垂直传输在此步骤中发生。完成后，用 10% 漂白剂和高压灭灭清洁所有与 E.aedis 接触的材料，以防止污染。该协议演示了在 A.aegypti 蚊子中传播 E.aedis 所需的完整程序。感染E.aedis的E.aegypti卵子被孵化，幼虫被饲养到第四个星期。在第四个星体阶段，可以观察到感染的视觉迹象，如在受感染的幼虫的脂肪体中出现白色孢子。核糖孢子是在第四个星体幼虫中收获的，在500微升的去维化水中使10个幼虫均质化。这些孢子是皮里形的，在400倍的放大倍率下很容易看到。计算了每微升4，050个孢子的孢子，这些孢子被用来通过水平传播感染健康的幼虫。在孵化后7天评估了25个孝感代幼虫的感染状态和E.aedis负载。发现孝感代E.aedis的垂直感染率为96%，孵化后7天感染者平均孢子负荷为3.31倍，为10至5。为了正确协调幼虫分期，建议考虑饲养时间中的一些变异性。此外，孢子数迅速增加，因此如果您未检测到孢子，请第二天再试一次。祝你好运。

Research

JoVE Journal

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