Name: propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-08-13T14:00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Wir danken Spencer Blankenship für die Hilfe bei der Mückenzucht. Wir danken auch James N. Radl und M. Dominique Magistrado für das hilfreiche Feedback zum Manuskript.

1. Tag 0
<ol><li>Hatch Ae. aegypti Eier mit E. aedis infiziert durch Dielegen in Larvenzuchttablett mit 1 L deionisiertem (DI) Wasser. 50 mg Fischfutter hinzufügen. HINWEIS: Zum Zeitpunkt der Veröffentlichung ist ein Laborstamm von E. aedis nur von Laboratorien verfügbar, die aktiv den Parasiten erforschen, da E. aedis nicht für eine langfristige Lagerung zugänglich ist und infizierte Eier derzeit nicht in Endlagern gelagert werden. Forscher, die an der Arbeit mit E. aedis interessiert sind, können sich an den entsprechenden Autor wenden, um infizierte Eier anzufordern. ANMERKUNG: Das Schlüpfen einer großen Anzahl infizierter Eier ist in der Regel nicht erforderlich; zehn E. aedis infizierte Ae. aegypti Larven sind ausreichend, um ≥ 1000 gesunden Larven zu dosieren. HINWEIS: Für alle Teile dieses Protokolls haben wir Mücken unter folgenden Bedingungen untergebracht: 14 h/10 h Licht/Dunkel-Zyklus, 27 °C Temperatur und 80% relative Luftfeuchtigkeit.</li>
</ol>2. Tag 1
<ol><li>Nach dem Schlüpfen die Larvendichte auf 100 Larven pro Tablett reduzieren, je nach Bedarf neue Schalen (auch mit 1 L DI-Wasser) herstellen.</li>
	<li>Fügen Sie jedem Tablett ein Stück trockenes Katzenfutter hinzu. Füllen Sie Lebensmittel auf, wenn sie erschöpft sind, aber liefern Sie keinen Überschuss an Nahrung. Ein Stück Katzenfutter (ca. 200 mg) alle drei Tage ist ausreichend. HINWEIS: Passen Sie die Futtermenge in Abhängigkeit von den spezifischen Aufzuchtbedingungen an (d. h. reduzieren Sie Nahrung, wenn Wasser trüb wird oder Larven absterben, erhöhen Sie die Nahrung, wenn Larven in der Entwicklung stark verzögert werden). Andere Fütterungsschemas und/oder Aufzuchtbedingungen als die hier vorgeschlagenen können verwendet werden, aber Anpassungen des Zeitplans dieses Standardprotokolls können erforderlich sein.</li>
</ol>3. Tage 4-u20125
<ol><li>Wenn infizierte Larven sind 3rd – 4th instars, schlüpfen gesunde /uninfizierte Ae. aegypti Eier in einem neuen Tablett.</li>
	<li>Hinten an dichten, so dass gesunde Ae. aegypti erreichen 2nd –3. instar in 48-72 h. In unseren Händen kann dies mit Dichten von 200-u2012300 Larven pro 1 L Wasser mit ad libitum Zugang zu Lebensmitteln erreicht werden. Brutchargen von gesunden Eiern über mehrere Tage können garantieren, dass Larven im richtigen Stadium sind, wenn nötig.</li>
</ol>4. Tage 7-20128: Horizontale Übertragung
HINWEIS: Die Einstreu gesunder Larven mit E. aedis kann erst durchgeführt werden, wenn uninukleate Sporen in infizierten Larven (1 x 104 – 1 x 106 pro Larve) eine hohe Anzahl haben. Dies geschieht spät in der4. Instar-Stufe (Abbildung 2).
<ol><li>Ernten und quantifizieren Sie uninukleate Sporen.<ol>
<li>Verwenden Sie eine Transferpipette (man muss die Spitze möglicherweise auf einen breiteren Durchmesser schneiden), um 10 infizierte Larven in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenrohr zu bewegen.</li>
		<li>Entfernen Sie Zuchtwasser mit einer Transferpipette und waschen Sie einmal, indem Sie 1 ml sauberes DI-Wasser hinzufügen. Entfernen Sie das Waschwasser mit einer Pipte, fügen Sie 500 l sauberes DI-Wasser zu den 10 Larven hinzu und homogenisieren Sie es mit einem Stößel und einem mechanischen Homogenisator.</li>
		<li>Quantifizieren Sie Sporen mit einem Hämozytometer bei 400-facher Vergrößerung. ANMERKUNG: Uninukleate Sporen können durch ihre ausgeprägte pyriforme Form (d. h. Birnenform; Abbildung 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dosis gesunde Ae. aegypti Larven mit E. aedis.
	<ol>
<li>Machen Sie frische Larvenfutter Gülle durch Mischen 1,2 g Leberpulver, 0,8 g Bierhefe und 100 ml Wasser. HINWEIS: Lebensmittel müssen nicht frisch sein, wenn sie autoklaviert und bei 4 °C bis zur Verwendung gelagert werden.</li>
		<li>100 2nd – 3rd instar gesund Ae. aegypti larvae in 150 ml Becher oder Probebecher übertragen.</li>
		<li>Dosieren Sie jeden Becher mit 100 Larven mit 5 x 104 – 1 x 105 Sporen.</li>
		<li>2 ml Larvenfutterschlämme und DI-Wasser zu einem Endvolumen von 100 ml geben.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach 12-24 h Exposition, übertragen ausgesetzte Larven in aufzuchtschalen und nach einem Standard-Aufzuchtprotokoll16ins Erwachsenenalter.</li>
</ol>5. Überwachung und vertikale Übertragung
<ol><li>Überwachen Sie dosierte Larven für die Verpupation und übertragen Sie Pupas, während sie sich zu einer Emergence Cup in einem Käfig entwickeln. Zuckerfutter Erwachsene ad libitum (gemäß16,17). Eclosing Erwachsene werden von E. aedisinfiziert werden.</li>
	<li>Blut füttern Erwachsene (gemäß16,17) und sammeln Eier. Die vertikale Übertragung von E. aedis erfolgt in diesem Schritt. HINWEIS: Wenn zusätzliche Blutmahlzeiten zur Verfügung gestellt werden, sobald die Eiiflage abgeschlossen ist, können Weibchen mindestens eine zusätzliche Gelege von Eiern legen, bevor Erwachsene (oft plötzlich) eine hohe Sterblichkeit erleiden.</li>
	<li>Verwenden Sie diese mit E. aedis infizierten Ae. aegypti-Eier, um die Vermehrung ab Schritt 1 dieses Protokolls fortzusetzen. HINWEIS: Eier können für 2 – 3 Monate unter geeigneten Bedingungen gelagert werden16.</li>
	<li>Reinigen Sie alle Materialien, die mit E. aedis in Kontakt kamen, mit 10% Bleichmittel und Autoklavieren (wenn möglich), um eine Kontamination zu verhindern.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yellow fever. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever</a> (2019)</li><li>Dengue and severe dengue. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue</a> (2020)</li><li>Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+and+prevention+of+urban+arbovirus+epidemics+:+A+challenge+for+the+global+virology+community.">Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community.</a> Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).</li><li>Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. 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H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temperature+on+developmental+parameters+of+the+parasite/host+System+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Amblyosporidae)+and+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Wir präsentieren hier die methode ursprünglich beschrieben in Hembree und Ryan, 19828 für die Aufzucht E. aedis microsporidia in Ae. aegypti Mücken. Der stamme von E. aedis, der in dieser Studie verwendet wurde, wurde aus der ursprünglichen Feldsammlung von Stephen Hembree in Thailand im Jahr 197919abgeleitet. Die Methode wird auf horizontale Übertragung, die natürlicherweise im Übertragungszyklus von E. aedis7auftritt, um den Parasiten in kontrollierter Weisezu vermehren. Diese Methode kann für Neulinge, die nicht mit Sporenaussehen, Symptomen einer Infektion bei Larven oder der Koordination erforderlich, um erfolgreich das mehrstufige Aufzucht/Dosierungsprotokoll abzuschließen, eine Herausforderung darstellen. Wir hoffen, dass die visuellen Hilfsmittel, die dieses Protokoll begleiten, die Zugangsbarrieren für Forscher verringern werden, die E. aedis kulturieren möchten.
Wir propagierten E. aedis in Ae. aegypti, wie oben beschrieben, und quantifizierten den Erfolg des Parasitismus in der kindlichen Generation. Kurz, wir schlüpften E. aedis infiziert Ae. aegypti Eier, zog sie auf 4th instar, und sammelte uninucleate E. aedis sporen von den infizierten Larven. Wir infizierten dann horizontal gesunde Larven mit diesen Sporen durch orale Einnahme und züchteten die horizontal infizierten Larven bis ins Erwachsenenalter. Wir bluten die infizierten Erwachsenen (Elterngeneration) und sammelten Eier (kindliche Generation), von denen wir vermuteten, dass sie vertikal mit dem E. aedis-Parasiten infiziert wären. Wir schlüpften Eier aus der kindlichen Generation und sammelten und homogenisierten eine Teilmenge der Larven, als sie 4th instars waren. Wir quantifizierten den Prozentsatz der Larven, die mit E. aedis infiziert waren, und die Gesamtzahl der Sporen bei allen infizierten Personen. Wir stellten fest, dass die überwiegende Mehrheit (96%) von Einzelpersonen infiziert waren und die durchschnittliche Sporenbelastung der infizierten Larven betrug105. Wir kommen zu dem Schluss, dass unser Aufzuchtprotokoll zu einer sehr erfolgreichen Vermehrung von E. aedis in Ae. aegypti-Mücken geführt hat.
Es gibt mehrere Aspekte dieses Protokolls, die für den nicht initiierten Benutzer besonders schwierig sein können. Wir bieten im Folgenden einige zusätzliche Informationen, die helfen können. Für Fragen zur allgemeinen Mückenzucht ist ein vollständiger Leitfaden zur Erhaltung der Ae. aegypti-Kolonie außerhalb des Rahmens dieses Protokolls. Jedoch, viele häufige Fragen können durch Ressourcen aus der Biodefense und Emerging Infections Research Resources Repository16,17 einschließlich Eibrühe, allgemeine Ernährungsbedürfnisse, Gehäuse und Umweltbedingungen, und Blutfütterung behandelt werden. In Bezug auf den Zeitplan der Infektion, Larven aus infizierten Eiern geschlüpft zeigen keine Anzeichen einer Infektion bis spät in der4. Instar-Phase. Uninuleate Sporen erscheinen schnell, im Laufe von 1-2 Tagen. Larven können praktisch uninfiziert erscheinen an 6 Tagen nach dem Schlüpfen, aber hoch infiziert durch Tag 7 oder 8 nach dem Schlüpfen. Darüber hinaus kann es schwierig sein, Sporen in homogenisierten Proben zu visualisieren, da es viele andere Mikroben gibt, die in ganzen Mückenhomogenaten vorhanden sind, einschließlich anderer eukaryotischer einzelliger Organismen (z. B. Hefe) ähnlicher Größe wie die E. aedis uninucleate Sporen. Die unterscheidungskräftige Form von E. aedis sporen (Abbildung 2A) ist eine sehr zuverlässige Methode zur Identifizierung und wird dazu beitragen, E. aedis von anderen Mikroben im Homogenat zu unterscheiden. Obwohl es für die Identifizierung oder Quantifizierung nicht notwendig ist, kann, wenn sporenreinigung gewünscht wird, durch kolloidale Kieselsäuredichte Gradientzentrifugation erreicht werden, die eine Trennung von E. aedis Sporen von anderen kontaminierenden Elementen im Homogenat ermöglicht. Dieser Prozess wird ausführlich in Solter et al.20beschrieben.
Temperatur und Ernährung, die in Deraufzuchtpraktiken verwendet werden, unterscheiden sich häufig zwischen den Laboratorien, aber Variationen werden wahrscheinlich immer noch zu einer erfolgreichen Parasitenausbreitung führen. Geringfügige Unterschiede in der Larvenfutterart stören die erfolgreiche Infektion nicht, obwohl wir in diesem Protokoll nicht explizit verschiedene Lebensmitteltypen getestet haben. Die Auswirkungen der Temperatur auf die Infektion wurde getestet und E. aedis Infektion wurde festgestellt, dass robust bei einem breiten Bereich von Temperaturen21. Die maximale Sporenproduktion erfolgte bei 30,8 °C, war aber bei Aufzuchttemperaturen von bis zu 20 °C immer noch robust. Die Sporenzahl wurde bei höheren Aufzuchttemperaturen (36 °C) drastisch reduziert, daher sollten diese Temperaturen für dieses Protokoll vermieden werden.
Kontamination ist immer ein Problem bei der Arbeit mit Parasiten. E. aedis ist ein erfolgreicher Parasit von Ae. aegypti und muss daher von nicht infizierten Laborkolonien getrennt gehalten werden, um eine Kontamination zu verhindern. Wir empfehlen, infizierte Mücken nach Möglichkeit in einem separaten Inkubator zu lagern. Wir empfehlen auch, dass Materialien, die für Mikrosporidien verwendet werden (z. B. Larvenschalen, Transferpipetten, Käfige, Eiersammelbecher), für Mikrosporidien-Arbeiten bestimmt sind und nicht im gesamten Insektaum breiter verwendet werden. Alle Aufzuchtmaterialien sollten nach Gebrauch mit 10% Bleichmittel sterilisiert werden und Autoklavieren können verwendet werden, um die Bleichsterilisation zu ergänzen.

Aedes aegypti ist der Mückenvektor mehrerer Arboviren (z.B. Dengue, Zika, Gelbfieber), die zusammen schätzungsweise Hunderte von Millionen von Krankheitsfällen pro Jahr und mehr als 30.000 Todesfälle1,2ausmachen. Die Behandlung von Krankheiten, die durch diese Krankheitserreger verursacht werden, beschränkt sich auf die unterstützende Versorgung und es ist wahrscheinlich, dass in Zukunft zusätzliche Arboviren entstehen werden3. Die Kontrolle des Mückenvektors ist daher von primärer Bedeutung, da er die Übertragung aktueller und neu auftretender Krankheitserreger effektiv verhindert4. Traditionell nutzen Vektorkontrollstrategien in erster Linie chemische Insektizide, aber die Resistenz gegen viele häufig verwendete Insektizide hat die Nachfrage nach neuartigen Methoden der Vektorkontrolle angetrieben. Ein potentieller Wirkstoff, der für seine biokontrollischen Eigenschaften gegen Ae. aegypti erforscht wurde, ist der Parasit Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, erstmals 1930 von Kudo als Nosema aedis identifiziert, ist ein mikrosporidischer Parasit von Ae. aegypti mosquitoes7. Die Entwicklung und Reproduktion von E. aedis ist relativ komplex und sein Lebenszyklus kannaufverschiedene Weise 7,8,9. Ein gemeinsamer Entwicklungszyklus wird in Becnel et al., 19897, ausführlich beschrieben und für die Laborvermehrung verwendet (Abbildung 1)8. Kurz gesagt, der Zyklus beginnt, wenn Ae. aegypti Eier vertikal mit E. aedis infiziert schlüpfen in infizierte Larven, die uninukleate Sporen im Fettkörper entwickeln, und in der Regel als Larven oder Pupae sterben. Uninucleate Sporen, die von toten Larven freigesetzt werden, verunreinigen den Lebensraum und werden von gesunden Ae. aegypti Larven aufgenommen. Diese Sporen keimen hauptsächlich im Verdauungstrakt und infizieren das Verdauungsgewebe der exponierten Larven, was zu einer horizontalen Übertragung führt. Horizontal infizierte Larven entwickeln sich zu Erwachsenen (Elterngeneration), wo Sich Binucleatsporen bilden. Beim Weibchen dringen diese Binucleatsporen in den Fortpflanzungstrakt ein und das damit verbundene Sporoplasma infiziert sich entwickelnde Eizellen. Diese Eier schlüpfen dann in infizierte Larven (kindliche Generation), was zu einer vertikalen Übertragung des Parasiten und fortsetzung des Zyklus wie oben beschrieben führt.
Mehrere Studien haben das Potenzial von E. aedis für die Biokontrolle untersucht. Eine Infektion mit E. aedis hat gezeigt, dass sie zu einer verminderten Fortpflanzungsfähigkeit von Ae. aegypti Weibchen10führt. Darüber hinaus führte die unundative Freisetzung von E. aedis in einem Halbfeldexperiment zur vollständigen Ausrottung eines Tests Ae. aegypti Population, die in einem abgeschirmten Gehäuse gehalten wurde6. Während in der Lage, einige Stadien der Entwicklung in einer Vielzahl von Mückenarten zu durchlaufen, E. aedis wird nur vertikal in Ae. aegyptiübertragen, was auf einen hohen Grad an Wirtsspezifität11,12hinweist. Ebenso konnte der mikrosporidische Parasit bei einer Laborbewertung des potenziellen Umweltrisikos im Zusammenhang mit E. aedisdie nicht zielorientierte Wasserfauna nicht infizieren, einschließlich der Raubtiere, die Ae. aegypti Larven aufgenommen haben, die mit E. aedis13infiziert sind. Diese Ergebnisse verdeutlichen das Potenzial von E. aedis, in biologischen Kontrollstrategien für natürliche Ae. aegypti-Populationen verwendet zu werden.
Trotz der Tatsache, dass E. aedis verspricht, in der Vektorkontrolle eingesetzt zu werden, gibt es Herausforderungen, sie auf breiter Ebene zu kultivieren und einzusetzen. E. Aedis sporen verlieren an weniger als einem Tag bei kalten Temperaturen (d. h. 5 °C) ihre Infektiosität. Auch bei wärmeren Temperaturen (d.h. 25 °C) verlieren Sporen im Laufe von drei Wochen schnell an Infektiosität14. Darüber hinaus muss E. aedis in lebenden Ae. aegypti Mücken kultiviert werden und kontrollierte Dosing von gesunden Larvenmücken ist notwendig, um die Vollendung des Lebenszyklus zu gewährleisten und den Zusammenbruch der Bevölkerung für Kultur zu verhindern8. Die Anforderung der In-vivo-Kultivierung stellt eine Herausforderung dar; Die jüngsten Fortschritte in der Mückenmassenaufzucht und Robotik (z. B. Massaro et al.15) könnten jedoch eine großflächige Erzeugung von E. aedis Sporen ermöglichen. Wir gehen davon aus, dass die Visualisierung dieser Methodik den Zugang zum E. aedis-Aufzuchtprotokoll verbessern und es mehr Forschern ermöglichen wird, die grundlegende Biologie und das angewandte Potenzial dieses Systems zu untersuchen. Wir gehen auch davon aus, dass dies eine verstärkte Zusammenarbeit mit Ingenieuren, Robotisten und dem breiteren Technologiesektor erleichtern wird, was dazu beitragen könnte, die Massenaufzucht von E. aediszu verbessern.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig01v2.jpg"> Abbildung 1: E. aedis propagation in Ae. aegypti. Die Vermehrung von E. aedis beginnt mit dem Schlüpfen von E. aedis infizierten Eiern. Infizierte Larven werden auf 4th instar aufgezogen, E. aedis sporen sind von diesen Larven isoliert, und die Sporen werden verwendet, um gesunde 2nd/3rd instar Larven, die aus einer nicht infizierten Gelege von Eiern aufgezogen werden, oral zu infizieren (horizontale Übertragung). Diese oral infizierten Larven werden dann bis ins Erwachsenenalter aufgezogen (Elterngeneration) und legen mit E. aedis infizierte Eier (vertikale Übertragung) ab. Infizierte Eier (kindliche Generation) werden dann geschlüpft, um den Infektionszyklus und die Parasitenkultur fortzusetzen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120 mL Specimen cup</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>911759</td>
			<td>Inexpensive alternative to beaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL beakers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-950</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz round glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10862-502</td>
			<td>Bottle for 10% sucrose in adult cages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 oz. emergence cup</td>
			<td>Henry-Schein</td>
			<td>1201502</td>
			<td>For transfer of pupae to cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult mosquito cages</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1462 or 1450ASV</td>
			<td>For adult housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewer&#8217;s yeast</td>
			<td>Solgar</td>
			<td></td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled rearing chamber</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-MP-47L</td>
			<td>Inexpensive small rearing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton roll</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470161-446</td>
			<td>Wick for sugar bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated rabbit blood</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50863762</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium ATP, crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209-5G</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry cat food</td>
			<td>9Lives</td>
			<td>Indoor Complete</td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food flakes</td>
			<td>TetraMin</td>
			<td></td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>267110</td>
			<td>For counting spores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer/mixer motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing trays</td>
			<td>Sterillite</td>
			<td>1961</td>
			<td>Overall dimensions are 11&#34; x 6 5/8&#34; x 2 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver powder</td>
			<td>NOW foods</td>
			<td>2450</td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-962</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-048</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-446</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystalline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15503022</td>
			<td>For adult feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-033</td>
			<td>For larval transfer, must trim ends</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes

Edhazardia aedis ist ein mikrosporidischer Parasit von Aedes aegypti-Mücken, einem Krankheitsvektor, der mehrere Arboviren überträgt, die jedes Jahr Millionen von Krankheitsfällen verursachen. E. aedis verursacht Sterblichkeit und verminderte Reproduktivität im Mückenvektor und wurde auf sein Potenzial als Biokontrollmittel untersucht. Das Protokoll, das wir zur Kultivierung von E. aedis vorlegen, basiert auf seinem natürlichen Infektionszyklus, der sowohl eine horizontale als auch vertikale Übertragung in verschiedenen Lebensstadien des Mückenwirts umfasst. Ae. aegypti Mücken sind Sporen im Larvenstadium ausgesetzt. Diese infizierten Larven reifen dann zu Erwachsenen und übertragen den Parasiten vertikal auf ihre Nachkommen. Infizierte Nachkommen werden dann als Sporenquelle für die zukünftige horizontale Übertragung verwendet. Die Kultivierung von E. aedis kann angesichts der Komplexität des Lebenszyklus des Parasiten eine Herausforderung für Uneingeweihte sein, und dieses Protokoll bietet detaillierte Anleitungen und visuelle Hilfsmittel zur Klärung.

E. aedis infiziert Ee. aegypti Liverpool (LVP1b12) Eier wurden geschlüpft, wie im Protokoll oben beschrieben. Im4. Insternstadium konnten visuelle Anzeichen einer Infektion beobachtet werden, einschließlich weißer Sporenzysten in den Fettkörpern infizierter Larven (ein Beispiel für diesen Phänotyp ist in Abbildung 2Bdargestellt). Uninucleate Sporen wurden aus4. Instar Larven geerntet, indem 10 Larven in 500 l DI-Wasser homogenisiert wurden. Diese Sporen waren pyriform (birnenförmig) und leicht sichtbar bei 400x (Abbildung 2A). Mit Hilfe eines Hämozytometers wurde eine Sporenzahl von 4,05 x 103 Sporen/L berechnet. Einhundert gesunde Ae. aegypti Larven wurden dann horizontal mit 50.000 Spornen in 100 ml Wasser für eine Enddosis von 500 Sporen/Larven infiziert. Larven wurden bis ins Erwachsenenalter aufgezogen (Elterngeneration) und mit defibriniertem Kaninchenblut plus 1% (v/v) 100 mM Adenosintriphosphat gefüttert. Vertikal infizierte Eier wurden gesammelt (Filialgeneration) und geschlüpft, um die E. aedis-Vermehrung fortzusetzen und den Infektionserfolg zu quantifizieren.
Nach sieben Tagen nach dem Schlüpfen wurden 25 Larven der kindlichen Generation in einzelne 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre überführt und einmal mit DI-Wasser gewaschen. Einzelne Larven wurden in 250 l DI-Wasser und Infektionsstatus homogenisiert und E. aedis-Lasten wurden mit einem Hämozytometer bewertet. Die vertikale Infektionsrate von E. aedis in der kindlichen Generation betrug 96 %, und die durchschnittliche Sporenbelastung infizierter Personen bei sieben Tagen nach dem Schlüpfen betrug 3,31 x 105 (Bereich: 3,25 x 104 – 1,47 x 106; Abbildung 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig02v2.jpg"> Abbildung 2: Visualisierung der E. aedis-Infektion bei Ae. aegypti-Mücken.  (A) E. aedis uninucleate pyriform spores. Zehn E. aedis infizierte4. Insternlarven wurden etwa sieben Tage nach dem Schlüpfen in 500 l DI-Wasser homogenisiert. 10 L des Homogenats wurden auf ein Hämozytometer geladen und bei 400X betrachtet. Rote Pfeile zeigen repräsentative uninukleate E. aedis sporen. (B) E. aedis infiziert4. Instar Larven entwickeln unverwechselbare weiße Sporenzysten im gesamten Fettkörper18. Sie haben auch häufig missgebildete und distended Bauchsegmente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig03.jpg"> Abbildung 3: Kulturprotokoll führt zu einer effektiven E. aedis-Infektion bei der kindlichen Erzeugung.  Ae. aegypti Larven (n = 25) aus der Filialgeneration wurden einzeln in 250 l DI-Wasser homogenisiert und 10 l des Homogenats auf ein Hämozytometer geladen. Das Vorhandensein von nicht inuukleaten Sporen deutete auf eine positive Infektion hin und Sporen wurden für alle positiven Proben quantifiziert. (A) Prävalenz der Infektion unter Filiallarven. Grau entspricht nicht infizierten Larven und Schwarz zu infizierten. Zahlen, die in jedem Segment angezeigt werden, geben die absolute Anzahl der Personen in jeder Gruppe an. (B) Sporenbelastung für jede infizierte Person. Schwarze Punkte stellen die log10 transformierte uninucleate Sporenzahl für jede Larve dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>

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Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Ein Protokoll zur Kultur des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis. Der Parasit wird von einer Generation von Aedes aegypti-Mücken zur nächsten durch horizontale Übertragung im Larvenstadium geleitet, gefolgt von vertikaler Übertragung im Erwachsenenstadium. Lebende Sporoplasmen überleben langfristig in infizierten Eiern.

Ausbreitung des mikrosporiden Parasiten Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Edhazardia aedis ist ein mikrosporidischer Parasit, der speziell Aedes aegypti Mücken infiziert. Die Aufzucht dieses Parasiten kann für neue Forscher aufgrund der Komplexität des Lebenszyklus des Parasiten eine Herausforderung sein. Dieses Protokoll enthält schrittweise Anweisungen für die Aufzucht von E.aedis, einschließlich der richtigen Zeit der Schritte zum Verfahren, der Identifizierung infektiöser Sporen und der Verbreitung der nächsten Generation von Parasiten.Das genaue Timing dieses Protokolls kann eine Herausforderung darstellen und einige Versuchs- und Fehler erfordern. Die Identifizierung von Sporen kann auch schwierig sein. Die visuellen Hilfsmittel in diesem Protokoll sollten Hilfe stellung nehmen.Zu Beginn schlüpfen A.Aegypti Eier mit E.aedis infiziert, indem sie in einem Larvenzuchttablett mit einem Liter entionisiertem Wasser und Hinzufügen von 50 Milligramm Fischfutter. Beherbergen Sie die Mücken bei 27 Grad Celsius und 80% relative Luftfeuchtigkeit mit einem 14-Stunden-Licht, 10-Stunden-Dunkelzyklus. Nach dem Schlüpfen die Larvendichte auf ca. 100 Larven pro Tablett reduzieren, so dass bei Bedarf neue Schalen entstehen.Fügen Sie jedem Tablett ein Stück trockenes Katzenfutter hinzu. Füllen Sie die Nahrung auf, wenn sie erschöpft sind, aber liefern Sie keine überschüssige Nahrung. Ein 200 Milligramm Katzenfutter alle drei Tage ist ausreichend.Wenn die infizierten Larven die dritte bis vierte Insterne sind, schlüpfen sie nicht infizierte A.aegypti-Eier in ein neues Tablett. Die Mücken an dichten aufziehen, so dass gesunde A.aegypti in 48 bis 72 Stunden den zweiten bis dritten Platz erreichen. Brutchargen von gesunden Eiern über mehrere Tage können garantieren, dass Larven im richtigen Stadium sind, wenn nötig.Um uninukleate Sporen zu ernten und zu quantifizieren, verwenden Sie eine Transferpipette, um 10 infizierte vierte Instar-Larven in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr zu bewegen. Entfernen Sie das Zuchtwasser mit einer Transferpipette und waschen Sie die Larven einmal, indem Sie etwa einen Milliliter sauberes entionisiertes Wasser hinzufügen. Entfernen Sie das Waschwasser und fügen Sie 500 Mikroliter sauberes deionisiertes Wasser zu den 10 Larven hinzu und homogenisieren Sie sie mit einem Stößel und einem mechanischen Homogenisator.10 Mikroliter Homogenat auf ein Hämozytometer laden und die Sporen bei 400-facher Vergrößerung quantifizieren. Machen Sie eine frische Larvenfutter Gülle durch Mischen 1,2 Gramm Leberpulver, 0,8 Gramm Bierhefe, und 100 Milliliter Wasser. 100 Sekunden bis dritte inStern gesunde A.aegypti Larven in 150 Milliliter Becher oder Probenbecher übertragen und fügen Sie fünfmal 10 bis vier mal 10 zu den fünften Sporen zu jeder Tasse mit einer Pipette.Fügen Sie zwei Milliliter Larvenfuttergülle und entionisiertes Wasser für ein Endvolumen von 100 Milliliter hinzu. Nach 12 bis 24 Stunden Belichtungszeit die Larven in Aufzuchtschalen übertragen. Fügen Sie Nahrung hinzu und erziehen Sie sie zum Erwachsenenalter.Überwachen Sie die dosierten Larven für die Verpupation und übertragen Sie Pupas in einen Aufnahmebecher in einem Käfig. Zucker futter Erwachsene ad libitum. Blutfütterung Von Erwachsenen nach Standardprotokollen, die über BEI Resources verfügbar sind.Sammeln Sie Eier von blutgefütterten Erwachsenen. Die vertikale Übertragung von E.aedis erfolgt in diesem Schritt. Reinigen Sie nach fertigstellungen Materialien alle Materialien, die mit E.aedis in Berührung kamen, mit 10% Bleichmittel und Autoklavieren, um eine Kontamination zu verhindern.Dieses Protokoll zeigt das vollständige Verfahren, das erforderlich ist, um E.aedis bei A.aegypti-Mücken zu verbreiten. A.aegypti Eier mit E.aedis infiziert wurden geschlüpft und Larven wurden bis zum vierten instar Stufe aufgezogen. Im vierten Instar-Stadium konnten visuelle Anzeichen einer Infektion beobachtet werden, wie weiße Sporozysten in den Fettkörpern infizierter Larven.Uninucleate Sporen wurden von vierten Instar Larven geerntet, indem 10 Larven in 500 Mikroliter entionisiertem Wasser homogenisiert wurden. Diese Sporen waren piriform und bei 400X Vergrößerung gut sichtbar. Es wurde eine Sporenzahl von 4.050 Sporen pro Mikroliter berechnet, die verwendet wurden, um gesunde Larven über eine horizontale Übertragung zu infizieren.Der Infektionsstatus und E.aedis-Ladungen von 25 Larven der filialen Generation wurden nach dem Schlüpfen an sieben Tagen untersucht. Die vertikale Infektionsrate von E.aedis in der kindlichen Generation betrug 96%, und die durchschnittliche Sporenbelastung infizierter Personen bei sieben Tagen nach dem Schlüpfen betrug 3,31 mal 10 bis fünf. Um die Larveninszenierung richtig zu koordinieren, ist es ratsam, eine gewisse Variabilität in der Aufzuchtzeit zu berücksichtigen.Darüber hinaus nehmen die Sporenzahlen schnell zu, wenn Sie keine Sporen erkennen, versuchen Sie es einfach am nächsten Tag erneut. Viel Glück.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Ein Calcium Biolumineszenzassay für die funktionelle Analyse von Mosquito ( Aedes aegypti) Und Tick ( Rhipicephalus microplus) G-Protein gekoppelten Rezeptoren

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

Forschung

Immunologie und Infektion

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Ein Protokoll für die Erfassung und Färbung Blutzellen aus dem Gelbfiebermücke Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Nachweis von infektiösen Viren aus Field-gesammelt Moskitos von Vero Cell Culture Assay

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Intravitalmikroskopie der Milz: Quantitative Analyse von Parasite Mobility und die Durchblutung

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Parasite Induced Genetisch Angetrieben Autoimmune Chagas-Herz-Krankheit in der Hähnchen-Modell

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluoreszierend<em&gt; In situ</em&gt; Hybridisierung auf mitotischen Chromosomen der Moskitos

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

2D und 3D Chromosom Malerei in Malaria-Mücken

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Der Anbau von<em&gt; Heligmosomoides polygyrus:</em&gt; Eine immunmodulatorische Nematode Parasite und seine Secreted Produkte

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Influenza Virus Vermehrung in embryonierten Hühnereiern

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

Messung der Pulsausbreitungsgeschwindigkeit, Distensibilität und Dehnung in einem Abdominal Aortenaneurysm Mausmodell

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...