Name: propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-08-13T14:00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

ברצוננו להודות לספנסר בלנקנשיפ על העזרה בהתנודות יתושים. אנו מודים גם לג'יימס נ. ראדל ומ. דומיניק מגיסטראדו על המשוב המועיל על כתב היד.

1. יום 0
<ol><li>הצוהר Ae. aegypti ביצים נגוע E. aedis על ידי הצבת מגש גידול זחל עם 1 L deionized (DI) מים. מוסיפים 50 מ"ג מזון דגים. הערה: בזמן הפרסום, זן מעבדה של E. aedis זמין רק ממעבדות לחקור באופן פעיל את הטפיל, כמו E. aedis אינו מרוצה אחסון לטווח ארוך וביצים נגועות אינם מאוחסנים כיום במאגרים. חוקרים המעוניינים לעבוד עם E. aedis יכולים ליצור קשר עם המחבר המתאים כדי לבקש ביצים נגועות. הערה: בקיעת מספר גדול של ביצים נגועות בדרך כלל אינה הכרחית; עשרה E. aedis נגוע Ae. זחלי aegypti מספיקים כדי ≥ 1000 זחלים בריאים. הערה: עבור כל חלקי פרוטוקול זה, איכלנו יתושים בתנאים הבאים: 14 שעות/10 שעות אור / מחזור כהה, טמפרטורה של 27 °C ו-80% לחות יחסית.</li>
</ol>2. יום 1
<ol><li>לאחר הבקיעה, להפחית את צפיפות הזחלים ~ 100 זחלים לכל מגש, ביצוע מגשים חדשים לפי הצורך (גם עם 1 L DI מים).</li>
	<li>מוסיפים חתיכת מזון חתולים יבש לכל מגש. לחדש את המזון כאשר מרוקן, אבל לא לספק עודף של מזון. חתיכה אחת של מזון חתולים (כ 200 מ"ג) כל שלושה ימים מספיקה. הערה: התאם את כמות המזון בהתאם לתנאי הגידול הספציפיים (כלומר, להפחית מזון אם מים הופכים סוערים או זחלים מתים, להגדיל את המזון אם זחלים מתעכבים קשות בפיתוח). ניתן להשתמש במשטרי האכלה אחרים ו/או בתנאי גידול אחרים מאלה המוצעים כאן, אך ייתכן שיהיה צורך בהתאמות לתזמון של פרוטוקול סטנדרטי זה.</li>
</ol>3. ימים 4\u20125
<ol><li>כאשר זחלים נגועים הם 3rd –4 instars, בוקעים בריא / נגוע Ae. aegypti ביצים במגש חדש.</li>
	<li>מאחור בצפיפות כזו בריא Ae. aegypti להגיע 2- 3rd instar ב 48-72 שעות. בידיים שלנו, זה יכול להיות מושגת באמצעות צפיפויות של 200\u2012300 זחלים לכל 1 L של מים עם גישה למזון אד libitum. בקיעת אצוות של ביצים בריאות על פני מספר ימים יכול להבטיח כי זחלים נמצאים בשלב הנכון בעת הצורך.</li>
</ol>4. ימים 7\u20128: שידור אופקי
הערה: מנון של זחלים בריאים עם E. aedis לא ניתן לבצע עד נבגים לא מדוקים הם במספרים גבוהים בזחלים נגועים (1 x 104 – 1 x 106 לכל זחל). מצב זה מתרחש בשלב 4אינסטאר (איור 2).
<ol><li>קציר וכמת נבגים לא מרוקנים.<ol>
<li>השתמש פיפטה העברה (ייתכן שיהיה יהיה להם לחתוך את הקצה לקוטר רחב יותר) כדי להעביר 10 זחלים נגועים לצינור microcentrifuge 1.5 מ"ל.</li>
		<li>הסר מי רבייה עם צינור העברה ולשטוף פעם אחת על ידי הוספת ~ 1 מ"ל של מים DI נקיים. הסר את מי השטיפה עם צינור, להוסיף 500 μL של מי DI נקיים 10 זחלים, ו homogenize באמצעות הומוגניזר עלי ומכאני.</li>
		<li>לכמת נבגים באמצעות hemocytometer בהגדלה 400x. הערה: נבגים לא מדוקים ניתנים לזהות על-ידי צורת הפיריפורם הייחודית שלהם (כלומר, צורת אגס; איור 2א).</li>
	</ol>
</li>
	<li>מינון בריא Ae. aegypti זחלים עם E. אדיס.
	<ol>
<li>להכין מזון זחל טרי slurry על ידי ערבוב 1.2 גרם של אבקת כבד, 0.8 גרם שמרים של מבשלת בירה 100 מ"ל של מים. הערה: מזון לא צריך להיות טרי אם הוא משועבד אוטומטית ומאוחסן ב- 4 °C עד לשימוש.</li>
		<li>להעביר 100 2nd – 3rd instar בריא Ae. aegypti זחלים לתוך 150 מ"ל כוסות או כוסות דגימה.</li>
		<li>מינון כל 100 זחלים עם 5 x 104 – 1 x 105 נבגים.</li>
		<li>להוסיף 2 מ"ל של זחל מזון slurry ומי DI לנפח הסופי של 100 מ"ל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר 12-24 שעות של חשיפה, מעבירים זחלים חשופים למגשי גידול ואחורית לבגרות בעקבות פרוטוקול גידולסטנדרטי 16.</li>
</ol>5. ניטור והעבר אנכי
<ol><li>לפקח על זחלים מנונים עבור גורים ולהעביר גלמים כפי שהם מתפתחים לגביע התגלות בכלוב. סוכר להאכיל מבוגרים אד libitum (לפי16,17). מבוגרים נדבקו על ידי א. אדיס.</li>
	<li>דם להאכיל מבוגרים(לפי 16,17)ולאסוף ביצים. שידור אנכי של E. aedis מתרחש בשלב זה. הערה: אם ארוחות דם נוספות מסופקות ברגע שהתווסת, הנקבות יכולות להטיל לפחות מצמד אחד נוסף של ביצים לפני שמבוגרים סובלים (לעתים קרובות פתאומיים) מרמות גבוהות של תמותה.</li>
	<li>השתמש אלה Ae. aegypti ביצים נגוע E. aedis להמשיך התפשטות החל שלב 1 של פרוטוקול זה. הערה: ניתן לאחסן ביצים למשך 2-3 חודשים בתנאים המתאימים16.</li>
	<li>נקה את כל החומרים שבאו במגע עם E. aedis עם 10% אקונומיקה ו autoclaving (אם אפשר) כדי למנוע זיהום.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yellow fever. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever</a> (2019)</li><li>Dengue and severe dengue. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue</a> (2020)</li><li>Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+and+prevention+of+urban+arbovirus+epidemics+:+A+challenge+for+the+global+virology+community.">Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community.</a> Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).</li><li>Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Control+Strategies+to+Counter+Dengue+Virus+Infection.">Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection.</a> Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).</li><li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Amblysporidae)+as+a+biocontrol+agent+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , 20-24 (1990).</li><li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Culicosporidae)+on+a+seminatural+population+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).</li><li>Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Edhazardia+aedis+(Kudo,+1930)+N.+G.,+N.+Comb.+(Microsporida:+Amblyosporidae)+in+the+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Hembree, S. C., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+vertical+transmission+of+a+new+microsporidian+pathogen+of+Aedes+aegypti+from+Thailand.">Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand.</a> Mosquito News. 42, 49-54 (1982).</li><li>Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sporulation+sequence+in+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Culicosporidae),+a+parasite+of+the+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).</li><li>Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edhazardia+aedis+(Microspora:+Culicosporidae)+effects+on+the+reproductive+capacity+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).</li><li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+host+range+and+specificity+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Culicosporidae).">Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae).</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).</li><li>Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+tests+with+Edhazardia+aedis+(Microsporida:+Culicosporidae)+against+northern+Nearctic+mosquitoes.">Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).</li><li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Amblyosporidae)+for+nontarget+aquatic+organisms.">Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).</li><li>Undeen, A. H., Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+germination+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Amblyosporidae)+spores.">Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores.</a> Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).</li><li>Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.">T.</a> Automated mass rearing system for insect larvae. , (2018).</li><li>Methods in Aedes Research. BEI Resources Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf">https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf</a> (2016)</li><li>Methods in Anopheles Research. BEI Resources Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf">https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf</a> (2014)</li><li>Desjardins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+host-pathogen+interactions+and+genome+evolution+in+two+generalist+and+specialist+microsporidian+pathogens+of+mosquitoes.">Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).</li><li>Hembree, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Report+of+some+mosquito+pathogens+from+Thailand.">Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand.</a> Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).</li><li>Solter, L. F., Becnel, J. J., V&#225;vra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+methods+for+entomopathogenic+microsporidia+and+other+protists.">Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 329-371 (2012).</li><li>Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temperature+on+developmental+parameters+of+the+parasite/host+System+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Amblyosporidae)+and+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

אנו מציגים כאן את השיטה המתוארת במקור בהמברי וריאן, 19828 לגידול E. aedis microsporidia ב Ae. יתושים aegypti. הזן של E. aedis בשימוש במחקר זה נגזר אוסף השדה המקורי על ידי סטיבן Hembree בתאילנד ב 197919. השיטה מנצלת את השידור האופקי, המתרחש באופן טבעי במחזור השידור של E. aedis7, כדילהפיץאת הטפיל באופן מבוקר. שיטה זו יכולה להיות מאתגרת למצטרפים חדשים שאינם מכירים את מראה נבוב, סימפטומים של זיהום בזחלים, או הקואורדינציה הנדרשת כדי להשלים בהצלחה את פרוטוקול גידול מרובה שלמים / מנון. התקווה שלנו היא כי עזרים חזותיים המלווים פרוטוקול זה יפחיתו את המחסומים לכניסה עבור חוקרים המעוניינים תרבות E. aedis.
הפצנו את א. אדיס ב-Ae. aegypti כמתואר לעיל וכמתנו את הצלחת הטפיליזם בדור הפילי. בקצרה, בקענו את ביצי א.א. לאחר מכן הדבקנו אופקית זחלים בריאים עם נבגים אלה באמצעות בליעה אוראלית, וטיפסנו את הזחלים הנגועים אופקית לבגרות. האכלתי את המבוגרים הנגועים (דור ההורים) ואספנו ביצים (דור פילים), שהשערנו שנדבקנו אנכית לטפיל אי אדיס. בקענו ביצים מדור הפיליאל, אספנו והגנו תת-קבוצה של הזחליםכשהם היו 4 כוכבים. כימתנו את אחוז הזחלים שנדבקו באדיס ואת ספירת נבובי הדם הכוללת בכל הנדבקים. מצאנו כי הרוב המכריע (96%) של אנשים נדבקו ועומס נבט ממוצע של זחלים נגועים היה ~ 105. אנו מסיקים כי פרוטוקול ההתעדורות שלנו הביא להפצה מוצלחת ביותר של E. aedis ב Ae. יתושים aegypti.
ישנם היבטים מרובים של פרוטוקול זה שעשויים להיות מאתגרים במיוחד עבור המשתמש הלא-נכון. אנו מציעים להלן מידע נוסף שעשוי להיות של סיוע. לשאלות לגבי גידול יתושים כללי, מדריך מלא Ae. aegypti תחזוקת מושבה הוא מעבר להיקף של פרוטוקול זה. עם זאת, שאלות נפוצות רבות ניתן לטפל על ידי משאבים ממאגר משאבי מחקר זיהומים ביו-הגנה וזיהומיםמתעוררים 16, 17כוללבקיעתביצים, צרכים תזונתיים כלליים, דיור ותנאים סביבתיים, והאכלה בדם. לגבי ציר הזמן של זיהום, זחלים בקעו מביצים נגועות לא מראים סימנים של זיהום עד מאוחר בשלב4 instar. נבגים לא מדוקים מופיעים במהירות, במהלך 1-2 ימים. זחלים עשויים להיראות כמעט לא נגועים ב6 ימים לאחר הבקיעה אבל נגוע מאוד ביום 7 או 8 לאחר הבקיעה. בנוסף, זה יכול להיות מאתגר לדמיין נבגים בדגימות הומוגניות כי ישנם חיידקים רבים אחרים נוכחים הומוגניטים יתושים שלמים, כולל אורגניזמים חד-תאיים אאוקריוטיים אחרים (למשל, שמרים) בגודל דומה כמו E. aedis נבגים לא מופקרים. הצורה הייחודית של נבגים E. aedis (איור 2A)היא שיטה אמינה מאוד לזיהוי ותעזור להבדיל E. aedis מחיידקים אחרים בהומוגנאט. למרות שאין צורך בזיהוי או כימות, אם טיהור נבגים רצוי, זה יכול להיות מושגת באמצעות צנטריפוגה הדרגתית צפיפות סיליקה colloidal אשר יאפשר הפרדה של E. aedis נבגים מאלמנטים מזהמים אחרים בהומוגנאט. תהליך זה מתואר בפירוט בסולטר ואח'20.
טמפרטורה ותזונה המשמשים בשיטות גידול שונות בדרך כלל בין מעבדות, אבל וריאציות סביר עדיין להניב התפשטות טפיל מוצלח. הבדלים קלים בסוג המזון זחל אינם מפריעים זיהום מוצלח, למרות שאנחנו לא במפורש לבדוק סוגי מזון שונים בפרוטוקול זה. השפעת הטמפרטורה על זיהום נבדקה וזיהום E. aedis נמצא חזק במגוון רחב של טמפרטורות21. ייצור נבובים מרבי התרחש ב 30.8 ° C אבל עדיין היה חזק בטמפרטורות גידול נמוך כמו 20 מעלות צלזיוס. ספירת נבובים הופחתה באופן דרמטי בטמפרטורות גידול גבוהות יותר (36 °C), ולכן יש להימנע מטמפרטורות אלה עבור פרוטוקול זה.
זיהום הוא תמיד דאגה בעת עבודה עם טפילים. א. אדיס הוא טפיל מוצלח של Ae. aegypti ולכן יש לשמור בנפרד ממושבות מעבדה נגועות כדי למנוע זיהום. אנו ממליצים על אחסון יתושים נגועים באינקובטור נפרד במידת האפשר. כמו כן, המלצנו כי חומרים המשמשים לעבודת מיקרוספרודיה (למשל, מגשי זחל, צינורות העברה, כלובים, כוסות איסוף ביצים) מיועדים לעבודת מיקרוספרידיה ולא בשימוש רחב יותר לאורך כל החרקים. כל חומרי גידול צריך להיות עיקור עם 10% אקונומיקה לאחר השימוש autoclaving יכול לשמש כדי להשלים חיטוי אקונומיקה.

Aedes aegypti הוא וקטור היתוש של arboviruses מרובים (למשל, דנגה, זיקה, קדחת צהובה) כי יחד מוערכים להסביר מאות מיליוני מקרי מחלה בכל שנה יותר מ 30,000מקרי מוות 1,2. טיפול במחלות הנגרמות על ידי פתוגנים אלה מוגבל לטיפול תומך וסביר להניח כי arboviruses נוספים יצוצובעתיד 3. שליטה של וקטור היתוש הוא ולכן בעל חשיבות עיקרית, כפי שהוא מונע ביעילות שידור של פתוגנים נוכחיים ומתפתחים4. באופן מסורתי, אסטרטגיות שליטה וקטורית משתמשות בעיקר בקוטלי חרקים כימיים, אך התנגדות לקוטלי חרקים רבים הנפוץ הניעה את הביקוש לשיטות חדשניות של שליטה וקטורית. סוכן פוטנציאלי אחד שנחקר על תכונות החברה הביו-תחום נגד Ae. aegypti הוא הטפיל אדהאזרדיה aedis5,6.
א. אדיס (באנגלית: E. aedis)הוא טפילמיקרו-ספרידי של יתושים א-אדיס על ידי קודו. הפיתוח והרבייה של א. אדיס מורכבים יחסית ומחזור החיים שלה יכול להמשיך במספרדרכים 7,8,9. מחזור התפתחותי נפוץ אחד מתואר לעומק Becnel ואח ', 19897 והוא מנוצל עבור הפצת מעבדה (איור 1)8. בקצרה, המחזור מתחיל כאשר Ae. aegypti ביצים נגועות אנכית E. aedis בוקעים לתוך זחלים נגועים אשר מפתחים נבגים לא מדוקים בגוף השומן, ובדרך כלל למות כמו זחלים או גלמים. נבגים לא מדוקים ששוחררו מזחלים מתים מזהמים את בית הגידול ונבלעים על ידי זחלים בריאים של א.א. נבגים אלה לנבט בעיקר במערכת העיכול, להדביק רקמת העיכול של הזחלים החשופים, וכתוצאה מכך שידור אופקי. זחלים נגועים אופקית להתפתח למבוגרים (דור הורים) שבו נבגים binucleate נוצרים. בנקבות, נבגים binucleate אלה לפלוש למערכת הרבייה וporoplasm הקשורים שלהם מדביק תאי ביצה מתפתחים. ביצים אלה בוקעות לאחר מכן לתוך זחלים נגועים (דור פילים), וכתוצאה מכך שידור אנכי של הטפיל והמשך המחזור כמתואר לעיל.
מחקרים רבים חקרו את הפוטנציאל של E. aedis עבור biocontrol. זיהום עם E. aedis הוכח לגרום לירידה ביכולת הרבייה של Ae. aegypti נקבות 10. יתר על כן, בניסוי חצי שדה, שחרור בלתי צפוי של E. aedis הביא להכחדה מוחלטת של מבחן Ae. aegypti האוכלוסייה נשמר בתוך מארזמוקרן 6. בעוד מסוגל לעבור כמה שלבים של פיתוח ב קבוצה מגוונת של מינים יתושים, E. aedis מועבר רק אנכית Ae. aegypti, המציין רמה גבוהה שלספציפיות מארח 11,12. כמו כן, בהערכת מעבדה של הסיכון הסביבתי הפוטנציאלי הקשור לאדיס, הטפיל המיקרו-ספרידי לא הצליח להדביק בעלי חיים ימיים שאינם מטרה, כולל טורפים ים נבלעו Ae. aegypti זחלים נגועים E. aedis13. תוצאות אלה מדגישות את הפוטנציאל של E. aedis לשמש באסטרטגיות בקרה ביולוגית מיקוד טבעי Ae. aegypti אוכלוסיות.
למרות העובדה כי E. aedis מראה הבטחה לשימוש בשליטה וקטורית, יש אתגרים culturing ופריסה זה בקנה מידה רחב. E. הנבגים אדיס לאבד זיהומים בפחות מיום אחד בטמפרטורות קרות (כלומר, 5 מעלות צלזיוס). גם בטמפרטורות חמות יותר (כלומר, 25 °C), נבגים מאבדים במהירות זיהומים במהלך שלושהשבועות 14. בנוסף, E. aedis חייב להיות תרבותי חיים Ae. יתושים aegypti מינון מבוקר של יתושי זחל בריאים יש צורך להבטיח את השלמת מחזור החיים כדי למנוע קריסה של האוכלוסייה המשמשת לתרבות8. הדרישה של vivo culturing מציבה אתגר; עם זאת, ההתקדמות האחרונה בהתרודות מסת יתושים ורובוטיקה (למשל, מסארו ואח'15)יכולה לאפשר דור בקנה מידה גדול של נבגים אדיס. אנו צופים כי הדמיה של מתודולוגיה זו תגביר את הנגישות לפרוטוקול גידול E. aedis ותאפשר לחוקרים נוספים לחקור את הביולוגיה הבסיסית ואת הפוטנציאל המיושם של מערכת זו. כמו כן, אנו צופים כי היא תקל על שיתופי פעולה מוגברים עם מהנדסים, רובוטיקה, ומגזר הטכנולוגיה הרחב יותר, אשר עשוי לשמש לשיפור גידול המוני של E. aedis.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig01v2.jpg"> איור 1: א. אדיס התפשטות ב Ae. aegypti. ההתפשטות של א. אדיס מתחילה בביצים נגועות בקעה של א. אדיס. הזחלים הנגועים גדליםל-4 אינסטאר, נבגים של אדיס מבודדים מהזחלים האלה, ונבגים משמשים להדבקה דרך-דרךית בזחלים בריאים של 2/3rd instar שנוגדו ממצמד לא נגוע של ביצים (שידור אופקי). זחלים אלה נגועים דרך הדם לאחר מכן גדלים לבגרות (דור הורים) ולהטיל ביצים נגועות E. aedis (שידור אנכי). ביצים נגועות (דור פילים) בקעו לאחר מכן כדי להמשיך את מחזור הזיהום ותרבות הטפילים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120 mL Specimen cup</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>911759</td>
			<td>Inexpensive alternative to beaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL beakers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-950</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz round glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10862-502</td>
			<td>Bottle for 10% sucrose in adult cages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 oz. emergence cup</td>
			<td>Henry-Schein</td>
			<td>1201502</td>
			<td>For transfer of pupae to cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult mosquito cages</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1462 or 1450ASV</td>
			<td>For adult housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewer&#8217;s yeast</td>
			<td>Solgar</td>
			<td></td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled rearing chamber</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-MP-47L</td>
			<td>Inexpensive small rearing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton roll</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470161-446</td>
			<td>Wick for sugar bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated rabbit blood</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50863762</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium ATP, crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209-5G</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry cat food</td>
			<td>9Lives</td>
			<td>Indoor Complete</td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food flakes</td>
			<td>TetraMin</td>
			<td></td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>267110</td>
			<td>For counting spores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer/mixer motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing trays</td>
			<td>Sterillite</td>
			<td>1961</td>
			<td>Overall dimensions are 11&#34; x 6 5/8&#34; x 2 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver powder</td>
			<td>NOW foods</td>
			<td>2450</td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-962</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-048</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-446</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystalline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15503022</td>
			<td>For adult feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-033</td>
			<td>For larval transfer, must trim ends</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes

אדהאזרדיה aedis הוא טפיל מיקרוספרידי של יתושי Aedes aegypti, וקטור מחלה המעביר ארבווירוסים מרובים הגורמים למיליוני מקרי מחלה בכל שנה. א. אדיס גורמת לתמותה וכושר רבייה מופחת בוקטור היתושים ונחקרה בשל הפוטנציאל שלה כסוכן בתחום הביו-תחום. הפרוטוקול שאנו מציגים עבור culturing E. aedis מבוסס על מחזור הזיהום הטבעי שלה, אשר כרוך הן שידור אופקי ואנכי בשלבי חיים שונים של המארח יתוש. יתושי ae. aegypti נחשפים נבגים בשלב הזחל. זחלים נגועים אלה לאחר מכן להבשיל למבוגרים ולשדר את הטפיל אנכית לצאצאיהם. צאצאים נגועים משמשים לאחר מכן כמקור של נבגים להעברה אופקית עתידית. Culturing E. aedis יכול להיות מאתגר לבלתי יזמים בהתחשב במורכבות מחזור החיים של הטפיל, ופרוטוקול זה מספק הדרכה מפורטת וע עזרים חזותיים להבהרה.

E. aedis נגוע Ae. aegypti ליברפול (LVP1b12)ביצים בקעו כמתואר בפרוטוקול לעיל. בשלב 4instar, סימנים חזותיים של זיהום ניתן לצפות, כולל ציסטות נבוב לבן בכל הגוף השומן של זחלים נגועים (דוגמה של פנוטיפ זה מוצג איור 2B). נבגים לא מדוקים נקטפומזחלי כוכב 4 על ידי homogenizing 10 זחלים ב 500 μL DI מים. נבגים אלה היו pyriform (בצורת אגס) וגלוי ב 400x (איור 2A). באמצעות מד המוצית, מחושב ספירת נבגים של 4.05 x10 3 נבגים/μL. מאה בריא Ae. aegypti זחלים היו אז נגועים אופקית עם ~ 50,000 נבגים ב 100 מ"ל מים למנה הסופית של ~ 500 נבגים / זחלים. זחלים גדלו לבגרות (דור הורים) ודם ניזון באמצעות דם ארנב דפיברין בתוספת 1% (v/v) 100 mM אדנוזין טריפוספט. ביצים נגועות אנכית נאספו (דור פילים) ובקעו כדי להמשיך את ההתפשטות של א. אדיס ולכימת את הצלחת הזיהום.
בשבעה ימים לאחר הבקיעה, 25 זחלי דור filial הועברו לצינורות מיקרוצנטריפוגה בודדים 1.5 מ"ל ונשטפו פעם אחת עם מי DI. זחלים בודדים היו homogenized ב 250 μL של מים DI ומצב זיהום וE. aedis המון הוערכו באמצעות המוציטומטר. שיעור הזיהום האנכי של E. aedis בדור filial נמצא 96% ועומס נזל ממוצע של נדבקים בשבעה ימים לאחר הבקיעה היה 3.31 x 105 (טווח: 3.25 x 104 – 1.47 x 106; איור 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig02v2.jpg"> איור 2: הדמיה של זיהום אדיס Ae. יתושים aegypti. (א) אדיס נבגים פיריפורם לא מדוקים. עשרה E. aedis נגוע 4זחלים instar היו homogenized ב 500 μL של מי DI כשבעה ימים לאחר הבקיעה. 10 μL של הומוגנט הועמס על מד המוציט ונצפה ב 400X. חצים אדומים מצביעים על נבגים של א. אדיס לא מדוקים. (ב) E. aedis נגוע 4זחלים instar לפתח ציסטות נבוב לבן ייחודי בכל הגוף השומן שלהם18. הם גם בדרך כלל יש מפוצלי בטן מעוותים ומנוים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig03.jpg"> איור 3: פרוטוקול תרבות מוביל לזיהום יעיל של א.אדיס בדור הפילי.  Ae. aegypti זחלים (n = 25) מדור filial היו homogenized בנפרד 250 μL DI מים 10 μL של הומוגנט הועמסו על המוציטומטר. נוכחות של נבגים לא מדוקדקים הצביעה על זיהום חיובי ונבגים היו מכמתים עבור כל הדגימות החיוביות. (א)שכיחות של זיהום בקרב זחלי פיל. גריי מתאימה לזחלים לא נגועים, ושחור לנגוע. מספרים המוצגים בכל מקטע נותנים את הספירה המוחלטת של אנשים בכל קבוצה. (ב)עומס נבוב עבור כל אדם נגוע. נקודות שחורות מייצגות אתיומן הרישום 10 שהפך לספירת נבובים לא-תכלית עבור כל זחל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

פרוטוקול לתרבות הטפיל המיקרו-ספיורידיאן אדהאזרדיה אדיס. הטפיל הוא מעבר מדור אחד של יתושי Aedes aegypti למשנהו באמצעות העברה אופקית בשלב הזחל ואחריו שידור אנכי בשלב המבוגר. נבגים חיים שורדים לטווח ארוך בביצים נגועות.

התפשטות הטפיל המיקרו-ספורידיאן אדהאזרדיה אדיס ב-Aedes aegypti יתושים

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

אדהזרדיה אדיס הוא טפיל מיקרו-ספורידיאני שמדביק במיוחד יתושים Aedes aegypti. גידול טפיל זה יכול להיות מאתגר עבור חוקרים חדשים בשל המורכבות של מחזור החיים של הטפיל. פרוטוקול זה מספק הוראות צעד חכם לגידול E.aedis, כולל כיצד כראוי לתזמן את השלבים להליך, לזהות נבגים זיהומיות, ולהפיץ את הדור הבא של טפילים.תזמון מדויק של פרוטוקול זה עשוי להיות מאתגר ועשוי לדרוש ניסוי וטעייה מסוימים. זיהוי נבגים יכול להיות גם קשה. העזרים החזותיים בפרוטוקול זה אמורים לספק סיוע.כדי להתחיל, לבקוע ביצי A.Aegypti נגוע E.aedis על ידי הצבת אותם במגש גידול זחל עם ליטר אחד של מים deionized והוספת 50 מיליגרם של מזון דגים. שכן את היתושים בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס ו-80% לחות יחסית עם מחזור חושך של 14 שעות. לאחר הבקיעה, להפחית את צפיפות הזחלים כ 100 זחלים למגש, מה שהופך מגשים חדשים לפי הצורך.מוסיפים חתיכת מזון חתולים יבש לכל מגש. לחדש את המזון כאשר מדולדל אבל לא מספקים כל מזון עודף. חתיכה אחת של 200 מיליגרם של מזון לחתול כל שלושה ימים מספיקה.כאשר הזחלים הנגועים הם כוכבים שלישיים עד רביעיים, בוקעים ביצי A.aegypti לא נגועות למגש חדש. הרם את היתושים בצפיפות כך ש- A.aegypti בריא יגיע למקום השני והשלישי ב-48 עד 72 שעות. בוקע קבוצות של ביצים בריאות במשך מספר ימים יכול להבטיח כי הזחלים נמצאים בשלב הנכון בעת הצורך.כדי לקצור ולכרות נבגים לא משכילים, השתמש בפיפטת העברה כדי להעביר 10 זחלי אינץ' נגועים לצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר. הסר את מי הרבייה עם פיפטה העברה ולשטוף את הזחלים פעם אחת על ידי הוספת כמיליליטר אחד של מים deionized נקי. הסר את מי הכביסה והוסף 500 מיקרוליטרים של מים deionized נקי 10 זחלים הומוגנית אותם באמצעות עלה homogenizer מכני.לטעון 10 microliters של הומוגניט על המוציטומטר לכמת את הנבגים בהגדלה 400X. הפוך תרחיף מזון זחל טרי על ידי ערבוב 1.2 גרם של אבקת כבד, 0.8 גרם של שמרי ברואר, ו 100 מיליליטר של מים. מעבירים 100 שני לשלישי בזחלי A.aegypti בריאים לתוך 150 כוסות מיליליטר או כוסות דגימה ומוסיפים חמש פעמים 10 לרביעית עד פעם אחת 10 לנבגים החמישיים לכל עם פיפטה.הוסף שני מיליליטר של תרחיף מזון זחל ומים deionized עבור נפח סופי של 100 מיליליטר. לאחר 12 עד 24 שעות של חשיפה, מעבירים את הזחלים למגשי גידול. מוסיפים אוכל ומגרים אותם לבגרות.לפקח על הזחלים מנונים עבור גור ולהעביר גלמים לגביע הופעה בכלוב. סוכר להאכיל מבוגרים עד ליביום. מבוגרים הזנת דם על פי פרוטוקולים סטנדרטיים זמינים באמצעות משאבי BEI.לאסוף ביצים ממבוגרים שניזונו מדם. שידור אנכי של E.aedis מתרחש בשלב זה. בסיום, נקו את כל החומרים שבאו במגע עם E.aedis עם 10% אקונומיקה ו autoclaving כדי למנוע זיהום.פרוטוקול זה מדגים את ההליך המלא הדרוש להפצת E.aedis יתושים A.aegypti. ביצי A.aegypti נגועות ב- E.aedis בקעו וזחלים גודלו לשלב הרביעי של כוכב. בשלב instar הרביעי, סימנים חזותיים של זיהום ניתן לראות כגון sporocysts לבן בכל גופי השומן של זחלים נגועים.נבגים לא משכילים נקצרו מזחלי instar הרביעי על ידי הומוגניזציה 10 זחלים ב 500 microliters של מים deionized. נבגים אלה היו פיריפורם וגלויים בקלות בהגדלה של פי 400. ספירת נבגים של 4, 050 נבגים למיקרוליטר חושבה ונבגים אלה שימשו להדביק זחלים בריאים באמצעות שידור אופקי.מצב ההדבקה והמון זחלים של דור ה-E.aedis הוערכו בשבעה ימים לאחר הבקיעה. שיעור ההדבקה האנכי של E.aedis בדור filial נמצאה להיות 96%ואת העומס הנבג הממוצע של אנשים נגועים בשבעה ימים לאחר הבקיעה היה 3.31 פעמים 10 לחמישי. כדי לתאם כראוי היערכות זחל, מומלץ להסביר כמה שונות בזמן גידול.בנוסף, מספרי הנבגים גדלים במהירות כך שאם אינך מזהה נבגים, פשוט נסה שוב למחרת. בהצלחה.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

פליטת אור סידן Assay עבור ניתוח פונקציונלי של יתוש ( Aedes aegypti) ו טיק ( Rhipicephalus microplus) G-חלבון בשילוב רצפטורים

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

פרוטוקול איסוף מכתים Hemocytes מן יתוש הקדחת הצהובה Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

איתור של וירוסים זיהומיות מהשטח, שנאספו על ידי יתושים Assay תרבות Vero Cell

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

מיקרוסקופית Intravital של הטחול: ניתוח כמותי של ניידות טפיל ואת זרימת הדם

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

טפיל מושרה מונע גנטית אוטואימונית מחלות לב Chagas דגם עוף

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

ציור כרומוזום דו מימדי ותלות מימדי אצל יתושים מלריה

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

רביה וירוס השפעת בembryonated עוף ביצים

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

מדידה של מהירות הפצת הדופק, Distensibility והזן במודל מפרצת של אבי העורקים הבטני

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...