Name: propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes
Uploaded: 2020-08-13T14:00:00
Duration: 5 min 29 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Spencer Blankenship'e sivrisinek yetiştiriciliğinde yardım ları için teşekkür ederiz. Ayrıca James N. Radl ve M. Dominique Magistrado'ya el yazması hakkında yararlı geri bildirimler için teşekkür ederiz.

1. Gün 0
<ol><li>Hatch Ae. aegypti yumurta larva yetiştirme tepsisi yerleştirerek E. aedis ile enfekte 1 L deiyonized (DI) su. Balık gıda 50 mg ekleyin. NOT: Yayın sırasında, E. aedis'in laboratuvar türü sadece paraziti aktif olarak araştıran laboratuvarlardan temin edilebilir, çünkü E. aedis uzun süreli depolamaya elverişli değildir ve enfekte yumurtalar şu anda depolarda depolanmamaktadır. E. aedis ile çalışmak isteyen araştırmacılar enfekte yumurta istemek için ilgili yazarla iletişime geçebilirler. NOT: Çok sayıda enfekte yumurtanın yumurtadan çıkması genellikle gerekli değildir; on E. aedis enfekte Ae. aegypti larvaları 1000 sağlıklı larva≥ doz için yeterlidir. NOT: Bu protokolün tüm bölümleri için sivrisinekleri aşağıdaki koşullarda barındırdık: 14 saat/10 h ışık/karanlık döngü, 27 °C sıcaklık ve %80 bağıl nem.</li>
</ol>2. Gün 1
<ol><li>Yumurtadan çıktıktan sonra larva yoğunluğunu tepsi başına ~100 larvaya düşürün ve gerektiğinde yeni tepsiler yapın (ayrıca 1 L DI su ile).</li>
	<li>Her tepsiye bir parça kuru kedi maması ekleyin. Tükenmiş gıda doldurmak, ancak gıda fazlalığı sağlamaz. Her üç günde bir bir parça kedi maması (~200 mg) yeterlidir. NOT: Belirli yetiştirme koşullarına bağlı olarak gıda miktarını ayarlayın (örneğin, su bulanıklaşırsa veya larvalar ölüyorsa gıdayı azaltın, larvalar gelişmede ciddi şekilde gecikirse gıdayı artırın). Burada önerilenlerden daha diğer besleme rejimleri ve/veya yetiştirme koşulları kullanılabilir, ancak bu standart protokolün zamanlamasında ayarlamalar gerekebilir.</li>
</ol>3. Gün 4\u20125
<ol><li>Enfekte larvalar 3 -4 yıldız olduğunda, yeni bir tepside sağlıklı/enfekte olmamış Ae. aegypti yumurtaları yumurtadan çıkar.</li>
	<li>Sağlıklı Ae. aegypti ulaşmak gibi yoğunluklarda arka 48-72 h2 -3 instar ulaşmak. Elimizde, bu gıda reklam libitum erişimi ile su 1 L başına 200\u2012300 larva yoğunlukları kullanılarak elde edilebilir. Birden fazla gün boyunca sağlıklı yumurta kuluçka parti rırvaları gerektiğinde doğru aşamada olduğunu garanti edebilir.</li>
</ol>4. Gün 7\u20128: Yatay iletim
NOT: Sağlıklı larvaların E. aedis ile dosing iması, tek nükleoz sporları enfekte larvalarda yüksek sayılarda (larva başına 1 x 104 – 1 x 106) yüksek sayılarda bulunana kadar yapılamaz. Bu 4instar aşamasında geç oluşur (Şekil 2).
<ol><li>Uninucleate sporlarını hasat edin ve ölçün.<ol>
<li>10 enfekte larvayı 1,5 mL mikrosantrifüj tüpe taşımak için transfer pipeti (ucu daha geniş çapa kadar kesmek gerekebilir) kullanın.</li>
		<li>Bir transfer pipet ile ıslah suyu çıkarın ve temiz DI su ~ 1 mL ekleyerek bir kez yıkayın. Yıkama suyunu bir pipetle çıkarın, 10 larvaya 500 μL temiz DI suyu ekleyin ve bir havaneli ve mekanik homogenizer kullanarak homojenize edin.</li>
		<li>400x büyütme de bir hemositometre kullanarak sporları ölçmek. NOT: Uninucleate sporlar farklı piriform şekli (yani, armut şekli; Şekil 2A).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Doz sağlıklı Ae. E. aedis ile aegypti larvaları.
	<ol>
<li>1,2 g karaciğer tozu, 0,8 g bira mayası ve 100 mL su karıştırarak taze larva gıda bulamacı yapın. NOT: Gıdaların otoklavlaved ve kullanıma kadar 4 °C'de saklanmış ise taze olması gerekmez.</li>
		<li>Transfer 100 2- 3 instar sağlıklı Ae. aegypti larvaları içine 150 mL beaers veya örnek bardak.</li>
		<li>Doz 5 x 104 ile 100 larva her kabı - 1 x 105 sporlar.</li>
		<li>100 mL'lik son hacmine 2 mL larva gıda bulamacı ve DI su ekleyin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pozlama 12-24 saat sonra, standart bir yetiştirme protokolü16aşağıdaki yetiştirme tepsileri içine maruz larva ve yetişkinlik arka transfer .</li>
</ol>5. İzleme ve dikey iletim
<ol><li>Onlar bir kafeste bir ortaya çıkma fincan geliştirmek gibi yavru ve transfer pupa için monitör dosed larvaları. Şeker yem yetişkin reklam libitum (16 başına,17). Eclosing yetişkinler E. aedistarafından enfekte olacak.</li>
	<li>Kan besleme yetişkin (16başına ,17) ve yumurta toplamak. E. aedis'in dikey iletimi bu adımda gerçekleşir. NOT: Oviposition tamamlanır tamamlanmaz ek kan öğünleri sağlanırsa, dişiler yetişkinler (genellikle ani) yüksek mortalite düzeyleri ne kadar acı çekmeden önce en az bir debriyaj daha yumurta yatırabilirler.</li>
	<li>Bu protokolün 1. NOT: Yumurtalar uygun koşullarda 2 - 3 ay saklanabilir16.</li>
	<li>Kontaminasyonu önlemek için E. aedis ile temas eden tüm malzemeleri %10 çamaşır suyu ve otoklavlama (mümkünse) ile temizleyin.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Yellow fever. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/yellow-fever</a> (2019)</li><li>Dengue and severe dengue. World Health Organization Available from: <a target="_blank" href="https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue">https://www.who.int/en/news-room/fact-sheets/detail/dengue-and-severe-dengue</a> (2020)</li><li>Weaver, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+and+prevention+of+urban+arbovirus+epidemics+:+A+challenge+for+the+global+virology+community.">Prediction and prevention of urban arbovirus epidemics : A challenge for the global virology community.</a> Antiviral Research. 156, 80-84 (2018).</li><li>Rather, I. A., Parray, H. A., Lone, J. B., Paek, W. K., Lim, J., Bajpai, V. K., Park, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prevention+and+Control+Strategies+to+Counter+Dengue+Virus+Infection.">Prevention and Control Strategies to Counter Dengue Virus Infection.</a> Frontiers In Cellular and Infection Microbiology. 7, 336 (2017).</li><li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Amblysporidae)+as+a+biocontrol+agent+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblysporidae) as a biocontrol agent of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Proceedings and abstracts, Vth International Colloquium on Invertebrate Pathology and Microbial Control. , 20-24 (1990).</li><li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Culicosporidae)+on+a+seminatural+population+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Impact of Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae) on a seminatural population of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Biological Control. 18 (1), 39-48 (2000).</li><li>Becnel, J. J., Sprague, V., Fukuda, T., Hazard, E. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+Edhazardia+aedis+(Kudo,+1930)+N.+G.,+N.+Comb.+(Microsporida:+Amblyosporidae)+in+the+mosquito+Aedes+aegypti+(L.)+(Diptera:+Culicidae).">Development of Edhazardia aedis (Kudo, 1930) N. G., N. Comb. (Microsporida: Amblyosporidae) in the mosquito Aedes aegypti (L.) (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Protozoology. 36, 119-130 (1989).</li><li>Hembree, S. C., Ryan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Observations+on+the+vertical+transmission+of+a+new+microsporidian+pathogen+of+Aedes+aegypti+from+Thailand.">Observations on the vertical transmission of a new microsporidian pathogen of Aedes aegypti from Thailand.</a> Mosquito News. 42, 49-54 (1982).</li><li>Johnson, M. A., Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+sporulation+sequence+in+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Culicosporidae),+a+parasite+of+the+mosquito+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">A new sporulation sequence in Edhazardia aedis (Microsporidia: Culicosporidae), a parasite of the mosquito Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 70 (1), 69-75 (1997).</li><li>Becnel, J. J., Garcia, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Edhazardia+aedis+(Microspora:+Culicosporidae)+effects+on+the+reproductive+capacity+of+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae) effects on the reproductive capacity of Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Medical Entomology. 32 (4), 549-553 (1995).</li><li>Becnel, J. J., Johnson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosquito+host+range+and+specificity+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Culicosporidae).">Mosquito host range and specificity of Edhazardia aedis (Microspora: Culicosporidae).</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 9 (3), 269-274 (1993).</li><li>Andreadis, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+range+tests+with+Edhazardia+aedis+(Microsporida:+Culicosporidae)+against+northern+Nearctic+mosquitoes.">Host range tests with Edhazardia aedis (Microsporida: Culicosporidae) against northern Nearctic mosquitoes.</a> Journal of Invertebrate Pathology. 64 (1), 46-51 (1994).</li><li>Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Amblyosporidae)+for+nontarget+aquatic+organisms.">Safety of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) for nontarget aquatic organisms.</a> Journal of the American Mosquito Control Association. 8 (3), 256-260 (1992).</li><li>Undeen, A. H., Becnel, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Longevity+and+germination+of+Edhazardia+aedis+(Microspora:+Amblyosporidae)+spores.">Longevity and germination of Edhazardia aedis (Microspora: Amblyosporidae) spores.</a> Biocontrol Science and Technology. 2, 247-256 (1992).</li><li>Massaro, P., Sobecki, R., Behling, C., Criswell, V., Zha, T., Devenzengo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=T.">T.</a> Automated mass rearing system for insect larvae. , (2018).</li><li>Methods in Aedes Research. BEI Resources Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf">https://www.beiresources.org/Portals/2/VectorResources/Methods_20in_20Aedes_20Research_202016.pdf</a> (2016)</li><li>Methods in Anopheles Research. BEI Resources Available from: <a target="_blank" href="https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf">https://www.beiresources.org/portals/2/MR4/MR4_Publications/Methods_20in_20Anopheles_20Research_202014/2014MethodsinAnophelesResearchManualFullVersionv2tso.pdf</a> (2014)</li><li>Desjardins, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contrasting+host-pathogen+interactions+and+genome+evolution+in+two+generalist+and+specialist+microsporidian+pathogens+of+mosquitoes.">Contrasting host-pathogen interactions and genome evolution in two generalist and specialist microsporidian pathogens of mosquitoes.</a> Nature Communications. 6 (1), 1-12 (2015).</li><li>Hembree, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preliminary+Report+of+some+mosquito+pathogens+from+Thailand.">Preliminary Report of some mosquito pathogens from Thailand.</a> Mosquito News. 39 (3), 575-582 (1979).</li><li>Solter, L. F., Becnel, J. J., V&#225;vra, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Research+methods+for+entomopathogenic+microsporidia+and+other+protists.">Research methods for entomopathogenic microsporidia and other protists.</a> Manual of Techniques in Invertebrate Pathology. , 329-371 (2012).</li><li>Becnel, J. J., Undeen, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+temperature+on+developmental+parameters+of+the+parasite/host+System+Edhazardia+aedis+(Microsporidia:+Amblyosporidae)+and+Aedes+aegypti+(Diptera:+Culicidae).">Influence of temperature on developmental parameters of the parasite/host System Edhazardia aedis (Microsporidia: Amblyosporidae) and Aedes aegypti (Diptera: Culicidae).</a> Journal of Invertebrate Pathology. 60, 299-303 (1992).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Burada yöntem aslında Hembree ve Ryan, 19828 Ae. aegypti sivrisinek E. aedis microsporidia yetiştirme için açıklanan sunuyoruz. Bu çalışmada kullanılan E. aedis suş 1979 yılında Tayland Stephen Hembree tarafından orijinal alan koleksiyonundan türetilmiştir 197919. Yöntem, paraziti kontrollü bir şekilde yaymakiçin doğal olarak E. aedis7iletim döngüsünde oluşan yatay iletimden yararlanılır. Bu yöntem spor görünümü, larvaenfeksiyon belirtileri, ya da başarıyla çok aşamalı yetiştirme / dosing protokolü tamamlamak için gerekli koordinasyon aşina olmayan yeni gelenler için zor olabilir. Umudumuz, bu protokole eşlik eden görsel yardımların E. aedis kültürünü isteyen araştırmacıların giriş engellerini azaltmasıdır.
Yukarıda açıklandığı gibi Ae. aegypti'de E. aedis'i yaydık ve filial jenerasyonda parazitizmin başarısını ölçtün. Kısaca, E. aedis enfekte Ae. aegypti yumurta,4 instar onları yetiştirilen ve enfekte larvalar uninucleate E. aedis sporları toplandı. Daha sonra yatay oral yutma yoluyla bu sporlar ile sağlıklı larva enfekte, ve yetişkinlik için yatay enfekte larva yetiştirilen. Biz kan enfekte yetişkinler (ebeveyn nesil) beslenen ve yumurta (filial nesil), biz varsayımsal yumurta, dikey E. aedis parazit ile enfekte olacağını. Filial neslinden yumurtalar çıkarmış ve larvaların bir alt kümesini toplayıp homojenize ettik. E. aedis ile enfekte olan larvaların yüzdesini ve tüm enfekte bireylerdeki toplam spor sayısını ölçtük. Biz büyük çoğunluğu (%96) bulundu bireylerin enfekte edildi ve enfekte larvaortalama spor yükü ~ 105oldu. Yetiştirme protokolümüzün Ae. aegypti sivrisineklerinde E. aedis'in son derece başarılı bir şekilde yayılmasıyla sonuçlandığı sonucuna varıyoruz.
Bu protokolün, özellikle başlatılmamış kullanıcı için zor olabilecek birden çok yönü vardır. Aşağıda yardımcı olabilecek bazı ek bilgiler sunuyoruz. Genel sivrisinek yetiştirme ile ilgili sorular için, Ae. aegypti koloni bakım için tam bir rehber bu protokolün kapsamı dışındadır. Ancak, birçok ortak sorular Biyosavunma ve Gelişmekte Olan Enfeksiyonlar Araştırma Kaynakları Deposu16,17 yumurtadan, genel diyet ihtiyaçları, konut ve çevre koşulları ve kan besleme de dahil olmak üzere kaynaklar tarafından ele alınabilir. Enfeksiyon zaman çizelgesi ile ilgili olarak, enfekte yumurtadan larvalar4 instar aşamasında geç kadar enfeksiyon belirtisi göstermez. Uninucleate sporlar hızla görünür, 1-2 gün boyunca. Larvalar 6 gün sonra kuluçkadan sonra neredeyse enfekte olmamış görünebilir ler ancak 7 veya 8 gün sonra çok enfekte olmuş olabilirler. Ayrıca, homojenize örneklerde sporları görselleştirmek zor olabilir, çünkü tüm sivrisinek homojenatlarında bulunan diğer birçok mikrop vardır, buna E. aedis uninucleate sporlar gibi benzer boyuttaki diğer ökaryotik tek hücreli organizmalar (örneğin, maya) da dahildir. E. aedis sporlarının ayırt edici şekli(Şekil 2A)tanımlama için son derece güvenilir bir yöntemdir ve E. aedis'in homojendeki diğer mikroplardan ayırt edilmesine yardımcı olur. Tanımlama veya niceleme için gerekli olmasa da, spor arınması isteniyorsa, E. aedis sporlarının homojendeki diğer kirletici elementlerden ayrılmasına olanak sağlayacak kolloidal silika yoğunluk gradyan santrifüj ile elde edilebilir. Bu süreç Solter ve ark.20'deayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Yetiştirme uygulamalarında kullanılan sıcaklık ve diyet genellikle laboratuvarlar arasında farklılık gösterir, ancak varyasyonlar büyük olasılıkla hala başarılı parazit yayılımı sağlayacaktır. Larva gıda tipindeki küçük farklılıklar başarılı enfeksiyona engel değildir, ancak bu protokolde farklı gıda türlerini açıkça test etmedik. Sıcaklık enfeksiyonu üzerindeki etkisi test edilmiştir ve E. aedis enfeksiyonu21sıcaklık geniş bir yelpazede sağlam olduğu bulunmuştur. Maksimum spor üretimi 30.8 °C'de meydana geldi ancak 20 °C'ye kadar düşük yetiştirme sıcaklıklarında hala sağlamdı. Spor sayısı yüksek yetiştirme sıcaklıklarında (36 °C) önemli ölçüde azalmıştır, bu nedenle bu protokol için bu sıcaklıklardan kaçınılmalıdır.
Parazitlerle çalışırken kontaminasyon her zaman bir sorundur. E. aedis Ae. aegypti başarılı bir parazit ve bu nedenle kontaminasyonu önlemek için enfekte olmayan laboratuvar kolonileri ayrı tutulmalıdır. Mümkünse enfekte sivrisineklerin ayrı bir kuvözde depolanmasını öneriyoruz. Ayrıca mikrosporidia çalışması için kullanılan malzemelerin (örneğin, larva tepsileri, transfer pipetleri, kafesler, yumurta toplama kapları) mikrosporidia çalışmaları için belirlenmesini ve böcek boyunca daha geniş bir şekilde kullanılmaması önerilir. Tüm yetiştirme malzemeleri kullanımdan sonra %10 çamaşır suyu ile sterilize edilmelidir ve otoklavlama çamaşır suyu sterilizasyonunu tamamlamak için kullanılabilir.

Aedes aegypti birden fazla arboviruses sivrisinek vektörüdür (örneğin, dang, Zika, sarı humma) birlikte her yıl hastalık vakalarıyüzmilyonlarca ve 30.000 'den fazla ölüm1,2hesap tahmin edilmektedir . Bu patojenlerin neden olduğu hastalıkların tedavisi destekleyici bakım ile sınırlıdır ve gelecekte ek arbovirüslerin ortaya çıkması muhtemeldir3. Bu nedenle sivrisinek vektörünün kontrolü birincil öneme sahiptir, çünkü mevcut ve gelişmekte olan patojenlerin bulaşmasını etkin bir şekilde önler4. Geleneksel olarak, vektör kontrol stratejileri öncelikle kimyasal insektisitler kullanmak, ancak birçok yaygın olarak kullanılan insektisitler direnç vektör kontrolü yeni yöntemler için talep tahrik etmiştir. Ae. aegypti karşı biyokontrol özellikleri için araştırılmış olan bir potansiyel ajan parazit Edhazardia aedis5,6.
E. aedis, ilk olarak 1930 yılında Kudo tarafından Nosema aedis olarak tanımlanan, Ae. aegypti sivrisinek7bir mikrosporidian parazit . E. aedis gelişimi ve üreme nispeten karmaşık ve yaşam döngüsü birden fazla şekilde devam edebilirsiniz7,8,9. Becnel ve ark., 19897'de derinlemesine açıklanan yaygın bir gelişim döngüsü (Şekil 1)8. Kısaca, döngüsü ne zaman Ae. aegypti yumurta dikey E. aedis ile enfekte yağ vücudunda uninucleate sporları geliştirmek enfekte larvaiçine yumurtadan başlar, ve genellikle larva veya pupa olarak ölmek. Ölü larvalardan salınan uninucleate sporlar yaşam alanını kirletir ve sağlıklı Ae. aegypti larvaları tarafından yutulmaktadır. Bu sporlar öncelikle sindirim sisteminde çimlenir, maruz kalan larvaların sindirim dokusunu enfekte ederek yatay iletimle sonuçlanır. Yatay enfekte larvalar, binükleat sporlarının oluştuğu yetişkinlere (ebeveyn nesli) dönüşür. Dişide, bu binükleat sporları üreme sistemi işgal ve ilişkili sporoplazm gelişmekte olan yumurta hücrelerini enfekte. Bu yumurtalar daha sonra enfekte larvalar içine yumurtadan (filial nesil), parazit dikey iletimi ve yukarıda açıklandığı gibi döngüsünün devamı ile sonuçlanan.
Birçok çalışma biyokontrol için E. aedis potansiyelini araştırdık. E. aedis enfeksiyonua neden olduğu gösterilmiştir Ae. aegypti dişilerin üreme kapasitesi azalmıştır10. Ayrıca, bir yarı alan deneyde, E. aedis inundative sürümü bir test Ae. aegypti popülasyon taramalı muhafaza içinde tutulan toplam eradikasyon sonuçlandı6. Sivrisinek türlerinin çeşitli bir dizi geliştirme bazı aşamalarında geçmesi mümkün iken, E. aedis sadece dikey Ae. aegyptiiletilir , ev sahibi özgüllük yüksek derecede gösteren11,12. Aynı şekilde, E. aedisile ilişkili potansiyel çevresel riskin bir laboratuvar değerlendirmesinde, mikrosporidian parazit E. aedis13ile enfekte Ae. aegypti larvaları yutulan yırtıcılar da dahil olmak üzere, hedef olmayan sucul fauna, enfekte başarısız oldu. Bu sonuçlar, Doğal Ae. aegypti popülasyonlarını hedefleyen biyolojik kontrol stratejilerinde E. aedis'in kullanılma potansiyelini vurgulamaktadır.
E. aedis vektör kontrolünde kullanım için umut vaat etmesine rağmen, onu daha geniş bir ölçekte dağıtmak ve katmanlamak için zorluklar vardır. E. aedis sporları soğuk sıcaklıklarda (yani 5 °C) bir günden daha kısa sürede enfektiflik kaybederler. Daha sıcak sıcaklıklarda bile (yani, 25 °C), sporlar üç hafta boyunca hızla enfekteliğinikaybederler 14. Ayrıca, E. aedis canlı Ae. aegypti sivrisinek kültürlü olmalı ve sağlıklı larva sivrisinek kontrollü dosing yaşam döngüsünün tamamlanmasını sağlamak ve kültür için kullanılan nüfusun çöküşünü önlemek için gereklidir8. In vivo culturing gereksinimi bir meydan okuma sunuyor; ancak, sivrisinek kütle yetiştirme ve robotik (örneğin, Massaro ve ark.15)son gelişmeler E. aedis sporların büyük ölçekli nesil için izin verebilir. Bu metodolojinin görselleştirilmesinin E. aedis yetiştirme protokolüne erişilebilirliği artıracağını ve daha fazla araştırmacının bu sistemin temel biyolojisini ve uygulama potansiyelini araştırmasına olanak sağlayacağını öngörüyoruz. Ayrıca mühendisler, robotikçiler ve E. aedis'inkitlesel yetiştirilmesine hizmet edecek daha geniş teknoloji sektörü ile artan işbirliklerini kolaylaştıracağını tahmin ediyoruz.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig01v2.jpg"> Şekil 1: Ae. aegypti'de E. aedis yayılımı.  E. aedis'in yayılması yumurtadan çıkma ile başlar E. aedis enfekte yumurta. Enfekte larvalar4 instar, E. aedis sporları bu larvalar izole edilir ve sporlar ağızdan sağlıklı enfekte etmek için kullanılır 2nd/3 yumurta bir enfekte debriyaj (yatay iletim). Bu sözlü enfekte larvalar daha sonra yetişkinlik (ebeveyn nesil) yetiştirilen ve Yumurtlama Yumurtlama E. aedis (dikey iletim) ile enfekte. Enfekte yumurta (filial nesil) daha sonra enfeksiyon döngüsü ve parazit kültürü devam etmek için yumurtadan vardır. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>120 mL Specimen cup</td>
			<td>McKesson</td>
			<td>911759</td>
			<td>Inexpensive alternative to beaker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>150 mL beakers</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10754-950</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 oz round glass bottle</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10862-502</td>
			<td>Bottle for 10% sucrose in adult cages</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 oz. emergence cup</td>
			<td>Henry-Schein</td>
			<td>1201502</td>
			<td>For transfer of pupae to cage</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adult mosquito cages</td>
			<td>Bioquip</td>
			<td>1462 or 1450ASV</td>
			<td>For adult housing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclave</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bleach</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>For sterilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brewer&#8217;s yeast</td>
			<td>Solgar</td>
			<td></td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Controlled rearing chamber</td>
			<td>Tritech</td>
			<td>DT2-MP-47L</td>
			<td>Inexpensive small rearing chamber</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton roll</td>
			<td>VWR</td>
			<td>470161-446</td>
			<td>Wick for sugar bottles</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Defibrinated rabbit blood</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>50863762</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disodium ATP, crystalline</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A26209-5G</td>
			<td>For blood feeding adults</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dry cat food</td>
			<td>9Lives</td>
			<td>Indoor Complete</td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fish food flakes</td>
			<td>TetraMin</td>
			<td></td>
			<td>For general larval rearing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemocytometer</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>267110</td>
			<td>For counting spores</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer/mixer motor</td>
			<td>VWR</td>
			<td>47747-370</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Larval rearing trays</td>
			<td>Sterillite</td>
			<td>1961</td>
			<td>Overall dimensions are 11&#34; x 6 5/8&#34; x 2 3/4&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liver powder</td>
			<td>NOW foods</td>
			<td>2450</td>
			<td>For feeding larvae during dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-962</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89079-974</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 1 - 10&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-042</td>
			<td>For larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipette tips 100 - 1000&#181;L</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10017-048</td>
			<td>For food during larval dosing</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic pestles</td>
			<td>VWR</td>
			<td>89093-446</td>
			<td>For homogenizing infected larvae</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sucrose, crystalline</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>15503022</td>
			<td>For adult feeding</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transfer pipet</td>
			<td>VWR</td>
			<td>414004-033</td>
			<td>For larval transfer, must trim ends</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

propagation of the microsporidian parasite edhazardia aedis in aedes aegypti mosquitoes

Edhazardia aedis Aedes aegypti sivrisinekbir mikrosporidian parazit, her yıl hastalık vakaları milyonlarca neden birden fazla arboviruses ileten bir hastalık vektörüdür. E. aedis sivrisinek vektöründe mortalite ve azalmış üreme uygunluğuna neden olur ve biyokontrol ajanı olarak potansiyeli araştırılmıştır. E. aedis'in kültüre atımı için sunduğumuz protokol, sivrisinek konakının farklı yaşam evrelerinde hem yatay hem de dikey iletimi içeren doğal enfeksiyon döngüsüne dayanmaktadır. Ae. aegypti sivrisinekler larva aşamasında sporlara maruz kalmaktadır. Bu enfekte larvalar daha sonra yetişkinlere olgunlaşır ve paraziti yavrularına dikey olarak iletirler. Enfekte yavrular daha sonra gelecekteki yatay iletim için sporkaynağı olarak kullanılır. Culturing E. aedis parazityaşam döngüsünün karmaşıklığı göz önüne alındığında uninitiated zor olabilir, ve bu protokol açıklama için ayrıntılı rehberlik ve görsel yardımlar sağlar.

E. aedis enfekte Ae. aegypti Liverpool (LVP1b12)yumurtaları yukarıdaki protokolde açıklandığı gibi yumurtadan çıktı. 4. instar evresinde, enfekte larvaların yağ vücutlarındaki beyaz spor kistleri de dahil olmak üzere görsel enfeksiyon belirtileri görülebilir (Bu fenotipin bir örneği Şekil 2B'degösterilmiştir). Uninucleate sporlar 500 μL DI suda 10 larva homojenleştirilerek 4instar larvasından hasat edildi. Bu sporlar piriform (armut şeklinde) idi ve 400x(Şekil 2A)ile kolayca görülebilir. Hemositometre kullanılarak 4.05 x 103 spor/μL spor sayısı hesaplandı. Yüz sağlıklı Ae. aegypti larvaları daha sonra yatay ~ 500 sporlar / larva son bir doz için 100 mL suda ~ 50.000 sporlar ile enfekte edildi. Larvalar yetişkinliğe (ebeveyn nesli) ve defibrinated tavşan kanı artı %1 (v/v) 100 mM adenozin trifosfat kullanılarak kanla beslendi. Dikey enfekte yumurta toplandı (filial nesil) ve E. aedis yayılımı devam etmek ve enfeksiyon başarısını ölçmek için yumurtadan.
Kuluçkadan yedi gün sonra, 25 filial nesil larva larvalar tek tek 1,5 mL mikrosantrifüj tüplere aktarıldı ve bir kez DI suyu ile yıkandı. Di su ve enfeksiyon durumu 250 μL'de tek tek larva homojenleştirildi ve E. aedis yükleri hemositometre kullanılarak değerlendirildi. Filial jenerasyonda E. aedis dikey enfeksiyon oranı% 96 ve yedi gün sonra kuluçka enfekte bireylerin ortalama spor yükü bulundu 3.31 x 105 (Aralık: 3.25 x 104 – 1.47 x 106; Şekil 3).
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig02v2.jpg"> Şekil 2: Ae. aegypti sivrisineklerinde E. aedis enfeksiyonunun görselleştirilmesi. (A) E. aedis uninucleate piriform sporlar. Ten E. aedis enfekte 4instar larvaları yaklaşık yedi gün sonra kuluçka dan sonra 500 μL DI suda homojenize edildi. Homojenin 10 μL'si hemositometreye yüklendi ve 400X olarak izlendi. Kırmızı oklar temsili uninucleate E. aedis sporlarını gösterir. (B) E. aedis enfekte 4instar larvaları yağ vücut18boyunca ayırt edici beyaz spor kistleri geliştirmek . Ayrıca genellikle bozuk ve şişmiş karın segmentleri var. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61574/61574fig03.jpg"> Şekil 3: Kültür protokolü filial jenerasyonda etkili E. aedis enfeksiyonuna yol açar.  Ae. aegypti larvaları (n = 25) filial jenerasyondan 250°L DI suda ayrı ayrı homojenleştirildi ve homojenin 10 μL'si hemositometreye yüklendi. Uninucleate sporların varlığı pozitif enfeksiyon gösterdi ve tüm pozitif örnekler için sporlar ölçüldü. (A) Filial larvalar arasında enfeksiyon prevalansı. Gri enfekte olmamış larvalara, siyahın enfekte olduğu anlamına gelir. Her segmentte görüntülenen sayılar, her gruptaki bireylerin mutlak sayısını verir. (B) Enfekte olan her birey için spor yükü. Siyah nokta günlük temsil10 her larva için uninucleate spor sayısı dönüştürülmüş. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61574/61574fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes at JoVE.com

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

Kültür mikrosporidian parazit Edhazardia aedisiçin bir protokol . Parazit aedes aegypti sivrisinek bir nesil sonraki larva aşamasında yatay transfer ve yetişkin aşamasında dikey iletim takip yoluyla geçit edilir. Canlı sporoplazmlar enfekte yumurtalarda uzun süreli hayatta kalırlar.

Aedes aegypti Sivrisinekmikrosporidian Parazit Edhazardia aedis yayılması

Edhazardia aedis is a microsporidian parasite of Aedes aegypti mosquitoes, a disease vector that transmits multiple arboviruses which cause millions of ...

Edhazardia aedis özellikle Aedes aegypti sivrisinek enfekte bir mikrosporidian parazittir. Bu parazitin yetiştirilmesi, parazitin yaşam döngüsünün karmaşıklığı nedeniyle yeni araştırmacılar için zor olabilir. Bu protokol, E.aedis'in yetiştirilmesi için, prosedürün adımlarını nasıl düzgün bir şekilde zamanlandırılabilmek, bulaşıcı sporları belirlemek ve yeni nesil parazitleri yaymak da dahil olmak üzere adım adım talimatlar sağlar.Bu protokolün doğru zamanlaması zor olabilir ve bazı deneme yanılma gerektirebilir. Sporları tanımlamak da zor olabilir. Bu protokoldeki görsel yardımlar yardım sağlamalıdır.Başlamak için, yumurta A.Aegypti yumurta E.aedis ile enfekte bir litre deiyonize su ile bir larva yetiştirme tepsisine yerleştirerek ve balık gıda 50 miligram ekleyerek. 14 saat ışık, 10 saatlik karanlık döngüsü ile 27 santigrat derece ve% 80 bağıl nem sivrisinek ev. Yumurtadan çıktıktan sonra larva yoğunluğunu tepsi başına yaklaşık 100 larvaya düşürün ve gerektiğinde yeni tepsiler yapın.Her tepsiye bir parça kuru kedi maması ekleyin. Tükenmiş gıda doldurmak ama herhangi bir fazla gıda sağlamaz. Her üç günde bir 200 miligram kedi maması yeterlidir.Enfekte larvalar üçüncü ila dördüncü yıldız olduğunda, yeni bir tepsiiçine enfekte edilmemiş A.aegypti yumurtaları yumurtadan. Sivrisinekleri, sağlıklı A.aegypti'nin 48-72 saat içinde ikinci ila üçüncü yıldıza ulaşması gibi yoğunluklarda arka. Birden fazla gün boyunca sağlıklı yumurta kuluçka parti rırvaları gerektiğinde doğru aşamada olduğunu garanti edebilir.Uninucleate sporlarını hasat etmek ve ölçmek için, 10 enfekte dördüncü yıldız larvasını 1,5 mililitrelik mikrosantrifüj tüpüne taşımak için bir transfer pipeti kullanın. Bir transfer pipet ile Üreme suyu çıkarın ve temiz deiyonize su yaklaşık bir mililitre ekleyerek bir kez larvayı yıkayın. Yıkama suyunu çıkarın ve 10 larvaya 500 mikrolitre temiz deiyonize su ekleyin ve bir havaneli ve mekanik bir homogenizer kullanarak homojenize edin.Bir hemositometre üzerine homojen 10 mikrolitre yükleyin ve 400X büyütme de sporları ölçmek. 1,2 gram karaciğer tozu, 0,8 gram Brewer mayası ve 100 mililitre suyu karıştırarak taze larva gıda bulamacı yapın. 150 mililitrelik gagalar veya numune bardak içine üçüncü instar sağlıklı A.aegypti larva 100 saniye transfer ve bir pipet ile her fincan beşinci sporlar için bir kez 10 dördüncü beş kez 10 ekleyin.100 mililitre lik son bir hacim için iki mililitre larva gıda bulamacı ve deiyonize su ekleyin. 12 ila 24 saat maruz kaldıktan sonra larvaları yetiştirme tepsilerine aktarın. Yiyecek ekleyin ve yetişkinliğe geri.Yavrulama için dosed larvaları izleyin ve pupayı kafesteki bir çıkış kabına aktarın. Şeker yem yetişkinler reklam libitum. BEI Resources aracılığıyla mevcut standart protokollere göre kan besleme yetişkinler.Kanla beslenen yetişkinlerden yumurta toplayın. E.aedis'in dikey iletimi bu adımda gerçekleşir. Bittiğinde, kontaminasyonu önlemek için E.aedis ile temas eden tüm malzemeleri %10 çamaşır suyu ve otoklavlama ile temizleyin.Bu protokol, A.aegypti sivrisineklerinde E.aedis'i yaymak için gerekli prosedürü niçin gösterdiğini göstermektedir. E.aedis ile enfekte olmuş A.aegypti yumurtaları yumurtadan çıkmış ve larvalar dördüncü yıldız evresine kadar yetiştirilmiştir. Dördüncü instar aşamasında, enfekte larvaların yağ organları nda beyaz sporocysts gibi enfeksiyon görsel belirtileri görülebilir.Uninucleate sporları, 500 mikrolitre deiyonize suda 10 larvayı homojenleştirerek dördüncü yıldız larvalarından hasat edildi. Bu sporlar piriform ve kolayca 400X büyütme görülebilir. Mikrolitre başına 4.050 spor hesaplandı ve bu sporlar yatay iletim yoluyla sağlıklı larvaları enfekte etmek için kullanıldı.Enfeksiyon durumu ve 25 filial nesil larva yükleri kuluçkadan sonra yedi gün değerlendirildi. Filial jenerasyonda E.aedis'in dikey enfeksiyon oranı %96 olarak saptanmış ve yumurtadan çıkma dan sonra yedi gün içinde enfekte bireylerin ortalama spor yükü 3.31 çarpı 10 ile beşinci arasındadır. Larva evrelemesini düzgün bir şekilde koordine etmek için, yetiştirme süresinde bazı değişkenlikler göz önünde bulundurulması tavsiye edilir.Ayrıca, spor numaraları hızla artar, bu nedenle sporları tespit etmezseniz, ertesi gün tekrar deneyin. İyi şanslar.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Propagation of the Microsporidian Parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti Mosquitoes

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito (Aedes aegypti) and Tick (Rhipicephalus microplus) G Protein-coupled Receptors

A Calcium Bioluminescence Assay for Functional Analysis of Mosquito Aedes aegypti and Tick Rhipicephalus microplus G Protein-coupled Receptors

Sivrisinek Fonksiyonel Analiz için Kalsiyum Biyoparlaklık Testi ( Aedes aegypti) Ve Tick ( Rhipicephalus Microplus) G Protein-çiftli Reseptörler

Arthropod hormone receptors are potential targets for novel pesticides as they regulate many essential physiological and behavioral processes.  The ...

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

A Protocol for Collecting and Staining Hemocytes from the Yellow Fever Mosquito Aedes aegypti

Yellow Fever Sivrisinek Hemocytes Toplama ve Boyama için Protokol Aedes aegypti</em

 Mosquitoes are vectors for a number  of disease-causing pathogens such as the yellow fever virus, malaria parasites  and filarial worms. Laboratories are ...

Detection of Infectious Virus from Field-collected Mosquitoes by Vero Cell Culture Assay

Vero Hücre Kültür Testi ile Alan toplanan Sivrisinekler Enfeksiyon Virüs Algılama

Mosquitoes transmit a number of distinct viruses including important human pathogens such as West Nile virus, dengue virus, and chickungunya virus. Many ...

Intravital Microscopy of the Spleen: Quantitative Analysis of Parasite Mobility and Blood Flow

Dalak intravital Mikroskopi: Parazit Mobilite ve Kan Akımının Kantitatif Analiz

The advent of intravital microscopy in experimental rodent malaria models has allowed major advances to the knowledge of parasite-host interactions 1,2. ...

Parasite Induced Genetically Driven Autoimmune Chagas Heart Disease in the Chicken Model

Parazit Tavuk Modelinde Genetik Driven Otoimmün Chagas Kalp Hastalığı Indüklenen

The Trypanosoma cruzi acute infections acquired in infancy and childhood seem asymptomatic, but approximately one third of the chronically infected cases ...

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Floresan<em&gt; In situ</emSivrisinekler ve Mitotik Kromozomlar üzerinde&gt; Hibridizasyon

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

2D and 3D Chromosome Painting in Malaria Mosquitoes

Sıtma Sivrisineklerinde 2D ve 3D Kromozom Boyama

Fluorescent in situ hybridization (FISH) of whole arm chromosome probes is a robust technique for mapping genomic regions of interest, detecting ...

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Yetiştirme<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Bir immunsupresif Nematodu Parazit ve Salgılanmış Ürünleri

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

Influenza Virus Propagation in Embryonated Chicken Eggs

Embriyone Tavuk Yumurta Grip Virüsü Yayılım

Influenza infection is associated with about 36,000 deaths and more than 200,000 hospitalizations every year in the United States. The continuous ...

Measurement of Pulse Propagation Velocity, Distensibility and Strain in an Abdominal Aortic Aneurysm Mouse Model

Abdominal Aort Anevrizması Fare Modelinde Nabız Yayılma Hızı, Şişkinlik ve GerinimÖlçümü

An abdominal aortic aneurysm (AAA) is defined as a localized dilation of the abdominal aorta that exceeds the maximal intraluminal diameter (MILD) by 1.5 ...