Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

وقد دعم هذا البحث صندوق أمبارو à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9؛ 2017/05264-7)؛ 2017/05687-5؛ 2018/20722-4)، كونسيلهو ناسيونال دي ديسينفولفيمنتو سينتيفيكو إي تينولوغيكو (CNPq) وكوارديناساو دي أبيرفيسوامنتو دي بيسال دي نيفل سوبيريور (CAPES)، الرمز المالي 001. نشكر المتعاونين لدينا في مختبر ماريا ريتا دوس سانتوس إي باسوس بوينو ومرفق زيبرافيش التابع لقسم علم الوراثة وعلم الأحياء التطوري، في معهد العلوم البيولوجية في جامعة ساو باولو. نشكر كريستيان نافا دي سوزا بريدا وتيريزا راكيل دي أوليفيرا رامالهو على التعليقات والاقتراحات المتعلقة بالمخطوطة. نحن نقدر ونشكر مارسيو فيلار مارتينز، من فريق الوسائط المتعددة في معهد العلوم الطبية الحيوية، على تسجيل هذا الفيديو وطبعته وإنتاجه.

وقد وافقت لجنة أخلاقيات استخدام الحيوان التابعة لمعهد العلوم الطبية الحيوية في جامعة ساو باولو في السابق على الإجراءات الموصوفة في هذا البروتوكول لاستخدامها في نموذج سمك الحمار الوحشي.
1. AKI التعريفي عن طريق الحقن داخل الصفاق Cisplatin
<ol><li>إعداد حل عمل سيسبلاتين عن طريق تخفيف محلول المخزون إلى 850 ميكروغرام / مل في 0.9٪ NaCl. حافظ على درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. تنبيه: يوصي النسيج بالتلاعب في سيسبلاتين بمعدات الحماية الشخصية (PPE) بما في ذلك النظارات الواقية والقفازات ومعطف المختبر. تخزين محلول المخزون في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء.</li>
	<li>إعداد 150 ملغم/لتر MS-222 (تريكين) مخدر في مياه النظام45. تخدير حمار وحشي الكبار (5-9 أشهر) عن طريق الغمر لمدة 1-2 دقيقة تقريبا. ملاحظة: يجب أن تكون الأسماك المخدرة بشكل فعال غير راعية للمس. لاختبار التخدير الفعال، اضغط برفق على الزعنفة الكودية لمراقبة رد الفعل. تنبيه: Tricaine هو مهيج للجلد والعينين، واستخدام معدات الوقاية الشخصية للتلاعب.</li>
	<li>باستخدام ملعقة بلاستيكية نقل الأسماك إلى سطح ماصة، مثل المناشف الورقية، لإزالة المياه الزائدة في جميع أنحاء الجسم. ثم، مع ملعقة بلاستيكية نقل الأسماك إلى طبق بيتري على مقياس ووزن الأسماك. يحيط علما وزن السمك كما سيكون من الضروري لحسابات الجرعة. ملاحظة: امتصاص المياه الزائدة من الأسماك يمنع المبالغة في وزن الحيوان، لا الإفراط في الجفاف منذ يضر بالأسماك.</li>
	<li>لتحقيق الجرعة النهائية من 120 ميكروغرام / غرام من الوزن، وتقسيم ميكروغرام من الجرعة النهائية (120 ميكروغرام) لكل ميكروغرام من محلول عمل سيسبلاتين (850 ميكروغرام) وتحويل هذا العدد إلى ميكرولتر (ميكرولتر) عن طريق ضرب ل 1000، للحصول على حجم 120 ميكروغرام من سيسبلاتين (141.2 ميكرولتر). ثم ضرب هذا العدد (141.2 ميكرولتر) لوزن السمك (ز) للحصول على الحجم النهائي لحقنها.</li>
	<li>مع ملعقة بلاستيكية، نقل السمك على اسفنجة مبللة مع قطع قليلا لعقد ذلك، مع الجانب البطني حتى. يجب أن يكون الإسفنج مبللا بمخدر في مياه النظام.</li>
	<li>ملء 31 G 1.0 مل حقنة الأنسولين مع حجم محسوب من محلول عمل سيسبلاتين.</li>
	<li>أدخل الإبرة في الجزء داخل الصفاق للحيوان بالقرب من زعنفة الحوض ، بزاوية ضحلة لتجنب ثقب الأحشاء(الشكل 2A). ثم حقن ببطء الحل.</li>
	<li>بعد حقن وضع السمك في خزان للتعافي من التخدير. مشاهدة الأسماك لعلامات الانتعاش الطبيعي(على سبيل المثال، حركات السباحة، حركات opercular). ملاحظة: يجب أن يتعافى الحيوان في 3-5 دقائق القادمة. إذا لزم الأمر، وتحفيز الأسماك عن طريق تحريكه مع ملعقة بلاستيكية، ماصة البلاستيك باستور، أو وضعه على مقربة من خرطوم مع فقاعات.</li>
	<li>للسيطرة على الأسماك، وإجراء نفس الإجراء عن طريق حقن حل من 0.9٪ NaCl. استخدم نفس الحساب بعد نسبة وزن الجسم: سيكون الحجم الذي سيتم حقنه 141 ميكرولتر مضروبا في وزن السمك (ز).</li>
	<li>رصد بقاء الأسماك على الأقل مرتين في اليوم في الأيام التالية (الشكل 2B).</li>
</ol>2. عزل الكلى ومعالجة الأنسجة لتدفق الخلايا المناعية
<ol><li>لهذا الإجراء، استخدم الخلايا المناعية الفلورية الحيوانات المعدلة وراثيا ملحوظ (على سبيل المثال،TG (mpo:GFP)).</li>
	<li>بعد 24 hpi من 120 ميكروغرام / غرام سيسبلاتين ، والقتل الرحيم الحيوانات عن طريق صدمة تحت الحرارية (تقشعر لها الأبدان السريع). ملاحظة: وقد ثبت أن الصدمة الحرارية لتكون أكثر فعالية كطريقة القتل الرحيم من جرعة زائدة MS-222. صدمة تحت الحرارية هو أقل إرهاقا وسريعة ومتسقة، وأكثر أمانا للموظفين من استخدام MS-222، وقد سبق وصف46،47.</li>
	<li>في خزان عبور الخارجي إعداد المياه الجليدية في نسبة 5:1 من الجليد إلى مياه النظام، ووضع الخزان الداخلي مع شاشة فوق الجليد، والانتظار حتى تصل المياه 2-4 درجة مئوية. ملاحظة: يجب ألا تكون الأسماك على اتصال مباشر مع الجليد، لأن هذا قد يسبب حروقا حرارية وألما.</li>
	<li>نقل الحيوان إلى الماء المثلج، والانتظار على الأقل 10 دقيقة حتى يكون هناك فقدان التوجه وعدم وجود حركة opercular.</li>
	<li>مع ملعقة بلاستيكية، ضع السمك على مناشف ورقية لتجفيف الماء الزائد.</li>
	<li>نقل السمك إلى لوحة تشريح agarose 3٪ وأخذها تحت مجسمة مع الضوء العلوي. مع مقص، وقطع رأس الأسماك مما يجعل قطع سريع فقط وراء العينين، وإزالة الرأس.</li>
	<li>مع مقص غرامة جعل قطع من الجانب المفتوح إلى كلوكا وإزالة الأعضاء الداخلية مع ملقط غرامة.</li>
	<li>استخدام دبابيس الحشرات لقرصة الجانبين من جدران الجسم لفتح الذبيحة وفضح الكلى تعلق على العمود الفقري.</li>
	<li>فصل الكلى مع ملقط غرامة ووضع الجهاز في لوحة بئر 6 مع محلول بارد من 1x PBS/2٪ FBS. ابق على الجليد.</li>
	<li>التقاط الأنسجة مع ماصة بلاستيكية باستور وتمرير الأنسجة من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر على أنبوب 50 مل، يذبل بلطف مع المكبس حقنة.</li>
	<li>غسل مرتين مع 1 مل من 1x PBS/2٪ FBS وجمع الخلايا في أنبوب 50 مل.</li>
	<li>خلايا الطرد المركزي في 400 × غرام لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.</li>
	<li>التقط بعناية كل الناتنات مع ميكروبايت 1 مل وتجاهله. إضافة 500 ميكرولتر من البارد 1x برنامج تلفزيوني لإعادة إنفاق الخلايا ووضعها في أنابيب قياس الخلايا تدفق 5 مل. ابق على الجليد.</li>
	<li>عد الخلايا في غرفة نيوباور مما يجعل تخفيف 1:10 في تريبان الأزرق(على سبيل المثال،تأخذ 10 ميكرولتر من العينة وتخلط مع 90 ميكرولتر من تريبان الأزرق). إضافة 10 ميكرولتر من الخليط إلى غرفة نيوباور وعدد الخلايا تحت المجهر. ملاحظة: من المتوقع تحقيق أفضل النتائج مع 1-5 × 106 خلايا / مل وقابلية البقاء >80٪. تنبيه: تريبان الأزرق هو عامل مسرطن، استخدم معدات الوقاية الشخصية للتعامل معها.</li>
	<li>خذ الخلايا لقراءتها بواسطة مقياس الخلايا. ثم تحليل النتائج التي تحدد السكان من الفائدة.</li>
</ol>3. تجهيز الكبار زيبرافيش أنسجة الكلى ل TUNEL المقايسة
<ol><li>لهذا الإجراء، استخدم الحيوانات البرية(على سبيل المثال،AB، توبنغن، الخ) أو معدل وراثيا بلون فلوري مختلف عن طقم TUNEL، حيث يمكن أن تتداخل الفلورسينس المماثلة مع تحليل TUNEL.</li>
	<li>بعد 24 hpi من 120 ميكروغرام / غرام سيسبلاتين ، والقتل الرحيم الحيوانات عن طريق صدمة تحت الحرارية (تقشعر لها الأبدان السريع). انظر 2.3-2.4.</li>
	<li>تشريح الأسماك كما هو موضح في 2.5-2.6؛ يجب أن تبقى الكلية متصلة العمود الفقري أثناء إجراء التثبيت (موضح أدناه).</li>
	<li>باستخدام دبابيس الحشرات ، قم بقرص جانبي جدران الجسم لفتح الذبيحة ودبوسها على سطح الفلين للحفاظ على تعرض الكلى. ملاحظة: يضمن هذا الإجراء بقاء الكلية في الوضع الصحيح للتحليل اللاحق.</li>
	<li>ثم ضع سطح الفلين مع الكلى التي تواجه أسفل في لوحة بئر 6 على محلول الطازجة من 4٪ paraformaldehyde (PFA). يبقيه بين عشية وضحاها في 4 °C. تنبيه: PFA مسرطن ومهيج للبشرة والأسطح المخاطية. إعداد حلول PFA تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي باستخدام معدات الوقاية الشخصية بما في ذلك معدات حماية العين.</li>
	<li>في اليوم التالي، تشريح الكلى كما هو الحال في 2.8. وضع الكلى في طبق بيتري 60 ملم مع برنامج تلفزيوني 1x وشطف مرتين في برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>إعداد 2٪ agarose لتوليد مصفوفة دعم للأنسجة.</li>
	<li>تجاهل جميع المتبقية 1x برنامج تلفزيوني من طبق بيتري وصب 2٪ agarose ببطء لتغطية الجهاز كله. ثم وضع الكلى باستخدام ملقط ناعم تحت مجسم لمنع الكلى لأضعاف. دع الآغروز يترسخ في درجة حرارة الغرفة. ملاحظة: هذا الإجراء سوف يحافظ على اتجاه وشكل الجهاز من خلال المعالجة النسيجية لأن الشكل الشبيه بأوراق الأعضاء يسبب ميلا إلى الطي إذا لم يكن داخل مصفوفة داعمة.</li>
	<li>بعد التصلب agarose، استخدم مشرط لقطع agarose حول الأنسجة، وتشكيل مكعبات صغيرة، وإزالة فائض من الآغاروز حول الأنسجة.</li>
	<li>ضع مكعبات الآغاروز في كاسيت مناسب للمعالجة النسيجية. ملاحظة: يمكن القيام بالخطوات التالية يدويا أو في معالج الأنسجة التلقائي.</li>
	<li>أولا، معالجة الأنسجة في كاسيت باتباع الخطوات التالية لمدة 45 دقيقة لكل منهما في درجة حرارة الغرفة: حمام واحد من الإيثانول 50٪، حمام واحد من الإيثانول 70٪، حمامين متتاليين من الإيثانول 95٪، وثلاثة حمامات متتالية من الإيثانول 100٪. بعد ذلك ، قم بمعالجة الأنسجة في حمامين متتاليين من Xylene وثلاثة حمامات متتالية من البارافين. هذا الأخير يستمر 1 ساعة لكل منهما في 60 درجة مئوية. تنبيه: إجراء تغييرات تحت غطاء محرك السيارة الكيميائي، والأبخرة من الإيثانول والزيلين هي مهيجة وسامة.</li>
	<li>لإعداد كتل البارافين، تذوب العدس البارافين إلى 60 درجة مئوية.</li>
	<li>افتح الكاسيت البلاستيكي مع الأنسجة في الداخل وأبقه على طبق دافئ. قوالب معدنية الاحماء للبارافين.</li>
	<li>مع ملاقط وضع الأنسجة على قالب معدني بحيث طول الكلى موازية لقاعدة العفن. إضافة البارافين، وإعادة تخصيص الأنسجة إذا لزم الأمر.</li>
	<li>تغطية القالب مع قاعدة كاسيت وإضافة البارافين حتى يتم تغطية الشبكة. السماح ترسيخ في درجة حرارة الغرفة ومن ثم وضع في -20 درجة مئوية لعملية تماسك أسرع.</li>
	<li>الافراج عن كتلة البارافين من القالب المعدني حوالي 20-30 دقيقة في وقت لاحق.</li>
	<li>مع microtome، قسم الأنسجة جزءا لا يتجزأ من البارافين إلى سمك 5 ميكرومتر. استخدام الشرائح الزجاجية silanized أو مشحونة إيجابيا لجمع الأنسجة.</li>
</ol>4. اختبار TUNEL
ملاحظة: يستخدم البروتوكول التالي مجموعة أدوات الكشف عن موت الخلايا في الموقع (جدول المواد).
<ol><li>أنسجة Dewax الشرائح وضعها في اثنين من الحمامات المتتالية من الزيلين لمدة 5 دقائق. ثم ترطيب الأنسجة من خلال سلسلة متدرج من الإيثانول: 100٪-95٪-70٪-50٪، لمدة 5 دقائق لكل منهما.</li>
	<li>وضع الشرائح في تشغيل مياه الصنبور الباردة لشطف قبالة الإيثانول. الحفاظ على الشرائح في الماء المقطر.</li>
	<li>إعداد غرفة حاضنة مظلمة. إضافة مناشف ورقية مبللة في الجزء السفلي للحفاظ على الرطوبة أثناء خطوات الحضانة. ملاحظة: في حالة عدم وجود غرفة حاضنة من الممكن استخدام طبق بيتري مع ورقة رطبة في الجزء السفلي واثنين من المسواك لوضع الشريحة.</li>
	<li>إعداد بروتيناز K حل العملالطازجة : 10 ميكروغرام / مل في 10 mM تريس / HCl، درجة الحموضة 7.4-8. ملاحظة: يستخدم البروتين K كعامل permeabilization، على النحو الموصى به من قبل النسيج.</li>
	<li>ضع الشرائح في غرفة الحاضنة المظلمة وأضف حل عمل Proteinase K حتى تغطي العينات. حضانة لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.</li>
	<li>بينما العينات هي احتضان، وإعداد خليط رد فعل TUNEL: إضافة 50 ميكرولتر من محلول إنزيم إلى 450 ميكرولتر تسمية الحل. حماية من الضوء. ملاحظة: يمكن ضبط وحدة التخزين التي سيتم إعدادها بنفس نسبة 1:10. ويحسب حجم ليكون 50 ميكرولتر من الخليط لكل قسم؛ هذا يمكن أن يتغير اعتمادا على حجم العينات.</li>
	<li>التقاط غرفة مظلمة وغسل الشرائح مرتين مع برنامج تلفزيوني 1x.</li>
	<li>بعد ذلك ، قم بتجفيف المنطقة المحيطة بالعينة باستخدام الورق الماصة وإضافة 50 ميكرولتر من خليط تفاعل TUNEL على كل شريحة نسيج ، ونشر المحلول بحيث يتم تغطية العينة بأكملها. حضانة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. حماية من الضوء.</li>
	<li>بعد الحضانة، شطف الشريحة ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x وتجفيف المنطقة حول العينة باستخدام المناشف الورقية.</li>
	<li>إضافة 50 ميكرولتر من DAPI 1:1000 إلى العينات، لاحتواء النووية، واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. حماية من الضوء.</li>
	<li>شطف مرة أخرى ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني 1x وتجفيف المنطقة المحيطة بالعينة.</li>
	<li>جبل الشريحة مع المتوسطة المائية المضادة للتلاشي، ووضع غطاء، وختم مع طلاء الأظافر. تخزين الشرائح أفقيا، محمية من الضوء عند 4 درجة مئوية. ملاحظة: خصائص المضادة للتلاشي من المتوسطة المتصاعدة هي للحفاظ على مضان العينات ولكن من الممكن استخدام أي وسيلة هيدروفيلية المتاحة. خطوة الختم النهائي مع طلاء الأظافر أمر بالغ الأهمية لتجنب الجفاف.</li>
	<li>تصور العينات تحت المجهر الفلوري. لهذا النوع من الصباغ الفلوري، استخدم الطول الموجي للإثارة في نطاق 520-560 نانومتر (أخضر) والكشف في نطاق 570-620 نانومتر (أحمر).</li>
</ol>

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

استمر انتشار أمراض الكلى في الازدياد في جميع أنحاء العالم، ليصبح مشكلة صحية عامة عالمية تؤثر على الملايين من الناس63. إيجاد وسيلة لعلاج المصابين الكلى الأفراد ذات أهمية قصوى، فضلا عن فهم المزيد عن المسببات والتقدم. وقد تم استخدام العديد من الدراسات نماذج حيوانية لفهم الضرر الكلوي. وقد درس الكلى حمار وحشي (الشكل 1) لسنوات في علم الأحياء التنموية والبحوث الإصابة بسبب قدراتها الذاتية تجديد والتشابه الجيني29,64. هنا، نقدم نموذج AKI جديد في حمار وحشي الكبار باستخدام خصائص سيسبلاتين كعامل nephrotoxic، بالتفصيل خطوات لتحقيق رد فعل سريع وحاد مع الضرر مرئية في أقرب وقت 24 hpi (الشكل 2). وعلاوة على ذلك، هنا نشرح اثنين من التقنيات التي من شأنها أن تساعد على تقييم تلف الأنسجة بعد حقن سيسبلاتين، وتدفق قياس الخلايا و TUNEL (الشكل 3).
نماذج AKI الحالية في حمار وحشي الكبار تشمل حقن i.p. من جنتاميسين الذي يسبب أضرارا واسعة النطاق في تدمير الكلية والتبول، وأحداث تولد النيونفروجين تبدأ من اليوم 5، ويتم الانتهاء من التجديد من قبل 21 يوما بعد الحقن65. من ناحية أخرى ، تم إنشاء نموذج لإصابة الكلى الحادة المرتبطة بالإنتان (S-AKI) من خلال العدوى مع Edwardsiella tarda، نظرا لزيادة التعبير عن علامات AKI بشكل كبير ، مثل بروتين ربط عامل النمو الشبيه بالإنسولين -7 (IGFBP7) ، ومثبط الأنسجة من metalloproteinases 2 (TIMP-2) ، وجزيء إصابة الكلى -1 (KIM-1) ، في اليرقات وسمك الحمار الوحشي البالغ66. ومن المعروف أن حمار وحشي لكونه عالي الإنتاجية للبحث عن العوامل العلاجية وهذا يشمل استخدام البروبيوتيك والأيض المشتقة من الميكروبيوتا لدراسة وظائف الكلى وتجديد67. ومع ذلك، يمكن أن تؤثر النماذج المتاحة بشكل مباشر على نتيجة هذه العلاجات. وهكذا، أنشأنا طريقة مختلفة للحث على AKI في حمار وحشي الكبار (الشكل 4)،وذلك باستخدام سيسبلاتين كعامل معروف كلي البروتين التي لن يكون لها آثار معروفة مباشرة على ميكروبيوتا الأسماك، كما هو الحال مع نموذج جنتاميسين لكونه مضاد حيوي، أو العدوى مع E. tarda، لكونها نموذج الإنتان. ومع ذلك ، في نفس الوقت الذي كنا نطور بروتوكول سيسبلاتين لدينا ، استكشفت مجموعة أخرى أيضا الآثار الكلية للسيسبلاتين في سمك الحمار الوحشي البالغ ، وتبسيط الجرعة إلى 10-20-30 ميكروغرام لكل68. على الرغم من أنها أظهرت أيضا تأثير سيسبلاتين تعتمد على الجرعة في البقاء على قيد الحياة، ونحن نوصي الحذر في استخدام كمية واحدة من سيسبلاتين لجميع الأسماك، كما حمار وحشي من نفس العمر يمكن أن يكون لها أحجام مختلفة جدا والوزن وهذا يمكن أن تحفز الاختلافات في النتائج69،70. نعتقد أنه من المهم ضبط الجرعة على الوزن المقابل للحيوان ، كما هو الحال في الفئران وهذه الدراسة.
في تجاربنا مع حمار وحشي الكبار، أظهرت سيسبلاتين تأثير الجرعة والاستجابة. وقد تصور هذا من خلال رصد معدل بقاء الحيوانات بعد حقن سيسبلاتين (الشكل 5). استخدمنا البقاء على قيد الحياة كوسيلة لتقدير شدة جرعة سيسبلاتين وليس كمقياس للسمية الكلوية ، حيث لا توجد علامة مادية أخرى مرئية خلال وقت الرصد. هذا يمكن أن تكون قابلة للمقارنة مع القوارض، والتي يمكن تعديل شدة إصابة الكلى من قبل جرعة وتواتر حقن سيسبلاتين15،وتحقيق جرعات قاتلة مع تركيزات أعلى من سيسبلاتين71. وينظر أيضا الميت في الأيام التالية في نموذج اليرقات من سيسبلاتين72. منذ كان هدفنا للحث على إصابة حادة في غضون أيام قليلة، اخترنا جرعة 120 ميكروغرام /غرام من سيسبلاتين كما هو ممكن لمراقبة تلف الكلى 24 ساعة بعد الحقن، ومع ذلك، يمكن تعديل هذا اعتمادا على أهداف الدراسة.
في البشر، يتم تشخيص سريريا AKI عن طريق انخفاض معدل الترشيح الكبيبات (GFR)، وارتفاع الكرياتينين المصل، والنيتروجين اليوريا في الدم3. في حمار وحشي، ذخيرة نماذج AKI يتضمن بعض النماذج الجينيةالمشروطة 73،74 وبعض النماذج ذات الصلة بالمخدرات65،72، ولكن كما لا يمكن قياس بعض المعلمات الوظيفية AKI على حمار وحشي بسبب صعوبات تقنية(على سبيل المثال، جمع الدم)، تعتمد معظم الأبحاث تقنيات مورفولوجية وبصرية لمراقبة ملامح AKI1،75 مثل دراستنا.
في القوارض ، يدخل cisplatin الخلايا الظهارية في الأنابيب القريبة وال البعيدة ، داخل الخلية يخضع لتنشيط التمثيل الغذائي ويصبح تفاعليا للغاية يتصرف على العضيات الخلوية ويحفز على تغييرات في بنية الخلية. هذه التغييرات يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمج وautphagy وحتى نخر، بجرعات عالية جدا. ردا على هذا الضرر ، يتم إطلاق العديد من السيتوكينات ويتم تجنيد الكريات البيض مما يؤدي إلى التهاب ويؤثر على وظائف الجهاز15. وهذا يسلط الضوء على أهمية تقييم نوع الخلايا التي يمكن العثور عليها في الكلى المصابة، كمقيمين أو خلايا مناعية مخترقة. هنا أظهرنا كيفية تقييم هذا عن طريق قياس التدفق الخلوي ، وذلك باستخدام خطوط مراسل المناعة المعدلة وراثيا المتاحة في الوقت الحاضر(الجدول 1). سيسبلاتين زيادة النسبة المئوية للنوات(mpo:GFP الخلايا الإيجابية) في الكلى 24 ح بعد الحقن (الشكل 6). في حالة حمار وحشي، والكلى هي مكانة من HSCs التي تؤدي إلى أنواع خلايا الدم المختلفة. ومع ذلك ، فإن العديد من المحببات والكواعم عادة ما تنتشر في الدم. في مثالنا، استخدمنا خط mpo:GFP المعدل وراثيا الذي يعبر عن GFP تحت مروج myeloperoxidase من العدلات52. أظهرت الدراسات الأصلية للخط المعدل وراثيا mpo:GFP التعبير عن myeloperoxidase في حالات مختلفة من نضوج العدلات76 ولكن استراتيجيتنا البوابة ركزت على كسر المحببة التي تضم الخلايا الناضجة القادمة من الدم52، وبهذه الطريقة تحليلنا تشمل الخلايا المتسللة وليس الخلايا المقيمة. هذا مهم للنظر عند عزل السكان الخلية المطلوبة.
كما هو موضح أعلاه ، فإن موت الخلايا المبرمج هو العلامة الأكثر كلاسيكية ل AKI المرتبط ب cisplatin. هنا، أظهرنا بروتوكول بسيط لتوطين الخلايا الميتة من خلال اختبار TUNEL. حقن سيسبلاتين زيادة عدد الخلايا المبرمج 24 hpi (الشكل 7). ويمكن قياس ذلك بسهولة عن طريق عد الخلايا الميتة مباشرة من الأنسجة. ومع ذلك، لتحديد الموت الخلية محددة استخدام الأجسام المضادة ضد الخلية المطلوبة(على سبيل المثال، خلايا أنبوبية)، أو استخدام خط مراسل المعدلة وراثيا يمكن استخدامها جنبا إلى جنب مع هذه التقنية. بالمقارنة مع نموذج يسببه جنتاميسين من AKI, سيسبلاتين ويبدو أن نموذجا أكثر شدة, منذ كان أعلى جنتاميسين موت الخلايا المبرمج في اليوم الثالث بعد الحقن65.
على الرغم من وجود مجموعة متنوعة من الآثار الجانبية, سيسبلاتين لا يزال يستخدم على نطاق واسع في علاج السرطان, بسبب فعاليته ضد أنواع مختلفة من السرطان, بما في ذلك سرطان, أورام الخلايا الجرثومية, الأورام اللمفاوية, وsarcomas77. يحدث السمية الكلوية في ثلث المرضى في العلاج مع سيسبلاتين10، وبالتالي فإن البحث عن الاستراتيجيات التي يمكن أن تقلل من هذا التأثير وزيادة إعادة التشتيت أمر حتمي. نحن نعتقد أن الأساليب والتقنيات الواردة في هذه المخطوطة ستساعد على توضيح آليات إصابة الكلى وإيجاد أهداف علاجية يمكن أن تكون ضرورية لتحسين نوعية حياة الأفراد الذين يعانون من مضاعفات كلوية ، في الغالب تلك المتعلقة باستخدام سيسبلاتين.

الكلى هي المسؤولة عن العديد من الوظائف الفسيولوجية الهامة التي تحافظ على التوازن، مثل ترشيح الدم، وإزالة المخلفات الزائدة، وتنظيم تركيزات الأيونات1. تلف الأنسجة الكلوية يمكن أن يؤدي إلى حالة غير متجانسة تسمى إصابة الكلى الحادة (AKI) ، والتي توصف سريريا بأنها انخفاض سريع في وظيفة الكلى الناجمة عن تدمير وموت الخلايا الظهارية الأنبوبية ، إصابة الخلايا البطانية ، وتسلل الكريات البيض 2،3. AKI هو شرط من المتوقع أن يحدث في 8-16٪ من دخول المستشفيات4،مع ارتفاع معدل الوفيات التي تتراوح بين 20 إلى 50٪ في وحدة العناية المركزة (ICU)5. ويرتبط هذا المرض مع زيادة الإقامة في المستشفى واستخدام كبير للموارد المالية5. وتشمل العوامل الايولوجية الجفاف، والصدمة، والالتهابات، والإنتان، وأمراض القلب والأوعية الدموية، والأدوية كلي البروتينات6. يعرف السمية الكلوية بأنها إصابة كلوية ناجمة عن المخدرات ، مما يسبب آثارا مثل AKI ، اعتلالات الأنابيب ، و اعتلالات الكبيبات7. تؤثر السمية الكلوية على ثلثي مرضى وحدة العناية المركزة ، حيث أن ما يقرب من 20٪ من الأدوية الموصوفة في وحدة العناية المركزة تعتبر8،9، وهذا يشمل الأدوية المضادة للالتهابات غير الستيرويدية (مضادات الالتهاب غير الستيروئيدية) والمضادات الحيوية مثل فانكومايسين وأمينوغليكوزيد ، وعوامل العلاج الكيميائي مثل الميثوتريكسات و سيسبلاتين7. سيسبلاتين هو واحد من أقوى الأدوية والعلاج الكيميائي شيوعا، وتستخدم في علاج الأورام الصلبة، مثل الرأس والرقبة، الخصية، المبيض، والمثانة10. في الكلى ، يتم استيعاب cisplatin في الأنبوب الملتوي القريب (PCT) من خلال الناقل القيصري العضوي 2 (OCT-2) وفي تركيزات عالية يرتبط بالحمض النووي الذي يؤدي إلى مسارات موت الخلية7،10،11،12. تراكم هذا الدواء في الكلى يساهم في السمية الكلوية مع الموت والالتهاب13. هذا الآثار الجانبية الضارة يؤثر بشكل كبير على حياة وتشخيص ثلث مرضى السرطان الذين يخضعون لعلاج سيسبلاتين ، لذلك لا بد من البحث عن علاجات جديدة يمكن أن تقلل من السمية الكلوية دون فقدان تأثير القتل على الخلايا السرطانية10.
وبسبب هذا التأثير الكلوي ، يستخدم سيسبلاتين عادة كمحث AKI في النماذج الحيوانية التجريبية ، كما هو موضح إلى الأمام. في القوارض، تم الإبلاغ عن أول نموذج AKI الناجمة عن سيسبلاتين في عام 197114 ولكن في الوقت الحاضر، ظهرت العديد من البروتوكولات المختلفة باستخدام الآثار التراكمية التي تعتمد على الجرعة من سيسبلاتين15. وبالتالي، اعتمادا على الجرعة وعدد من التطبيقات، يمكن أن تكون درجات مختلفة من شدة إصابة الكلىالناجمة 16،17،18،19،20،21. وتتكون الطريقة الأكثر شيوعا من حقن داخل الصفاق (أي p.) جرعة واحدة من سيسبلاتين تليها القتل الرحيم في الأيام التالية. في هذا البروتوكول الكلاسيكي، جرعة واحدة عالية من السيتبلاتين (10-13 ملغم/كغ في الفئران و/أو 3-8 ملغم/كغ في الفئران) تحفز تغييرات هيستولوجية حادة، مثل فقدان حدود الفرشاة وحطام الخلية داخل التجويف الأنبوبي، بعد أيام قليلة من حقن سيسبلاتين. شدة التغيرات النسيجية تعتمد على الجرعة ، ويلاحظ وجود علامات على التجديد بعد 7 أيام من حقن سيسبلاتين16،17.
على الرغم من أن نماذج القوارض راسخة ، قررنا الاستفادة من خصائص فقاريات أخرى ، مع تركيز دراساتنا على سمك الحمار الوحشي(دانيو ريو). وقد استخدمت هذه الأسماك على نطاق واسع لنمذجة الأمراض البشرية، وذلك بسبب صغر حجمها، والإخصاب الخارجي، وارتفاع معدلات الإنجاب، والتطور السريع، وشفافية الأجنة واليرقات، وانخفاض تكلفة الصيانة، وتشريح مماثلة للثدييات (مع بعض الاستثناءات)، وارتفاع قدرة تجديد الأنسجة، والسلوك الاجتماعي، 70٪ من التشابه الجيني مع البشر و 84٪ مع الجينات المرتبطة بالأمراض البشرية22. Streisinger وآخرون23،24،25 بدأت الدراسات مع حمار وحشي التي أكدت عمليا على استخدام هذا الكائن الحي نموذج للتحليل الجيني للتنمية الفقاريات. في أبحاث الكلى ، ظهرت سمكة الحمار الوحشي ليس فقط في الدراسات التنموية ولكن أيضا كأداة وراثية في البحث عن جينات جديدة مرتبطة بحالات الكلى26. وعلاوة على ذلك، فإن قدرة التجديد دون تشكيل ندبة والقدرة على توليد الكلية من خلال حياتهم، ودعا نيونيفروجينيسيس، وجعل حمار وحشي نموذجا حيوانيا رئيسيا للبحث التجديد27،28. وعلاوة على ذلك، فإن توافر نماذج تجريبية لأمراض الكلى المختلفة، بما في ذلك إصابات الكلى الحادة والمزمنة، يدل على براعة هذا الكائن التجريبي26،29. كما هو الحال في الثدييات ، يتم اشتقاق السلف الكلوي لسمك الحمار الوحشي من الوسيط المتوسط. تولد هذه السلف الكلوية المعرضة التي سوف تتطور في وقت لاحق إلى mesonephros، والتي سيتم الحفاظ عليها كجهاز ناضجة حتى سن البلوغ29،30.
وتقع الكلى حمار وحشي الكبار على الجدار الظهري للجسم، بين المثانة السباحة والعمود الفقري29. من وجهة نظر بطنية، يمكن تقسيم حمار وحشي إلى ثلاث مناطق(الشكل 1A):الرأس (H)، الجذع (Tr)، والذيل (تا)29. نفس الثدييات، حمار وحشي لديه الكلية كوحدات وظيفية من الكلى، والتي تنقسم إلى شرائح أنبوبية(الشكل 1A):الكلي (RC)، أنبوب ملتوية قريبة (PCT)، أنبوب مستقيم قريب (PST)، القاصد في وقت مبكر (DE)، في وقت متأخر من القاص (DL) وجمع القناة (CD)29. حمار وحشي تشترك في الحفظ الجيني وأوجه التشابه الهيكلي مع الكليرونات البشرية (الشكل 1B) ولكن يفتقر إلى بعض الجزيئات مثل أنبوبي وسيطة، والمعروف أيضا باسم حلقة هنل (LH)29،31. عادة ما تكون أسماك المياه العذبة مثل حمار وحشي محاطة بوسط منخفض جدا ، وبسبب هذا ، فإنها تميل إلى أن تكون مفرطة السمية وتعتمد على الخياشيم والجلد في المراحل المبكرة ، والكلى لتنظيم التناضح وإفراز الماء32. يبدأ ترشيح الدم من الشريان الأورطي الظهري بواسطة الفروس حوالي 48 ساعة بعد الإخصاب (hpf)33،34. الكلى من حمار وحشي ليس فقط جهاز إفراز النفايات الأيضية ولكن أيضا يعمل كعضو دموي من 4 أيام بعد الإخصاب (dpf) إلى مرحلة البلوغ وهو ما يعادل نخاع العظام في الثدييات35. أثناء التنمية، والخلايا الجذعية الدموية (HSCs) بذور الكلى، وتجديد الذات، وتوليد النخاعي، الغدة الدرقية، وأنساب الخلايا اللمفاوية، والحفاظ على عوامل النسخ، والجزيئات الإشارات، والبرامج الوراثية المحفوظة للغاية مع الثدييات36،37. وقد كشفت الدراسات أن معظم الغدة الدرقية، خثار، النخاع، والخلايا اللمفاوية في الجهاز المناعي البشري موجودة في حمار وحشي37،38. الخصائص الفريدة لهذا الحيوان والميزات المحفوظة مع الكلى البشرية جعلت هذا الكائن الحي النموذجي مفيدا في البحث عن وظائف الكلى والإصابات والتجديد.
على الرغم من أن الكلى من حمار وحشي درس جيدا وبعض نماذج من AKI متوفرة بالفعل في اليرقات وسمك الحمار الوحشي الكبار28، في وقت إنشاء هذا البروتوكول لم يكن هناك أي دليل على نموذج AKI غير المستحث كيميائيا غير المضاد الحيوي في حمار وحشي الكبار. وإلى جانب ذلك، يركز مختبرنا على اختبار البكتيريا بروبيوتيك والمركبات المشتقة من الكائنات الحية المجهرية لدراسة التجديد وتلف الكلى، وبالتالي ركزنا جهودنا في خلق نموذج جديد AKI الناجم عن سيسبلاتين في الأسماك الكبار. توضح مقالة الفيديو المعروضة في هذه المخطوطة إجراءات نموذج جديد لتحريض AKI باستخدام حقنة أي p. من 120 ميكروغرام سيسبلاتين لكل غرام من الحيوان (120 ميكروغرام /غرام) (الشكل 2A). واستندت هذه الجرعة في البداية على دراسات AKI الناجمة عن سيسبلاتين في نماذج مورين التي ذهبت حوالي 10 ملغ / كغ (أي ما يعادل 10 ميكروغرام / غرام)14,15,16,17, ومع ذلك, هذه الجرعة لم تكن كافية للحث على تلف الكلى المتعلقة بالسمية الكلوية (البيانات غير مبينة). وهكذا، قمنا بزيادة الجرعة لتلك المستخدمة في هذهالدراسة (الشكل 2B). كشف عملنا عن تأثير يعتمد على الجرعة من سيسبلاتين في معدل البقاء على قيد الحياة بعد الحقن مع تحريض تلف أنسجة الكلى 24 hpi كما هو مبين من خلال فقدان الهيكل الأنبوبي ، وزيادة التسلل الالتهابي ، وارتفاع معدل موت الخلايا. هنا، ونحن نصف اثنين من التقنيات لتحليل تطوير AKI الناجم عن سيسبلاتين: تدفق قياس الخلايا، لتحليل تسلل الخلايا، و TUNEL، لقياس موت الخلية. قياس التدفق الخلوي هو تقنية تقيس الخصائص الفيزيائية (الحجم والحبيبة) والكيميائية (المركبات الفلورية) للخلايا. داخل السيتومتر، يمر تعليق الخلية عبر سائل غمد ينظم الخلايا في خط واحد، مما يسمح لها بالمرور عبر شعاع ليزر خلية واحدة في كل مرة(الشكل 3A). سيقوم كاشف أمام شعاع الضوء بقياس مبعثر الأمام (FSC) ، الذي يرتبط بحجم الخلية ، وأجهزة الكشف إلى الجانب ستقيس مبعثر الجانب (SSC) الذي يرتبط بحبيبة الخلايا. وسوف أجهزة الكشف الأخرى قياس مضان من الجسيمات، والبروتينات الفلورية، أو الخلايا التي تحمل اسم الأجسام المضادة39،40. كما الأجسام المضادة التجارية لسمك الحمار الوحشي نادرة في الوقت الحاضر، واستخدام المراسلين الحيوان والمؤشرات الحيوية الفلورية يسمح لتحسين هذا التحليل وتحديد مجموعات الخلايا المتنوعة41،42،43. أداة أخرى مستخدمة في هذا البروتوكول كان نقل deoxynucleotidyl الطرفية (TdT) dUTP إنهاء وضع العلامات (TUNEL) المقايسة. إن اختبار TUNEL هو طريقة اكتشاف موت الخلايا المبرمج في مرحلة متأخرة تعتمد على قدرة TdT على تحديد الحمض النووي المجزأ وتسميته بإزالة الأكسجين الموسوم بعلامة فلورية يمكن تصورها وقياسها كميا بواسطة المجهر44 (الشكل 3B). وبالنظر إلى أن واحدة من أكثر السمات لفتا للاكي هو تحريض موت الخلايا المبرمج في خلايا الكلى أنبوبي3, هذه التقنية مفيد للغاية لأنه يمكن تحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي و / أو المجهر.
النهج المعروضة في هذه المقالة يسمح بمراقبة حالة AKI وتقديم نموذج حاد جديد لدراسة اضطرابات AKI التي يمكن أن تكون مفيدة للبحث عن أهداف علاجية جديدة في AKI المرتبطة سيسبلاتين.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

يستخدم سيسبلاتين عادة ككيماوي. على الرغم من أن له آثار إيجابية في الأفراد الذين عولجوا من السرطان، سيسبلاتين يمكن أن تتراكم بسهولة في الكلى بسبب انخفاض وزنه الجزيئي. هذا التراكم يسبب موت الخلايا الأنبوبية ويمكن أن تحفز على تطوير إصابة الكلى الحادة (AKI) ، والتي تتميز بانخفاض سريع في وظائف الكلى ، وتلف الأنسجة ، وتسلل الخلايا المناعية. إذا تدار في جرعات محددة سيسبلاتين يمكن أن يكون أداة مفيدة كمحفز AKI في النماذج الحيوانية. وقد ظهرت حمار وحشي كنموذج مثير للاهتمام لدراسة وظائف الكلى, تجديد الكلى, والإصابة, كما هياكل الكلى الحفاظ على أوجه التشابه الوظيفي مع الثدييات. حمار وحشي الكبار حقن مع سيسبلاتين يظهر انخفاض البقاء على قيد الحياة, موت خلايا الكلى, وزيادة علامات الالتهاب بعد 24 ح بعد الحقن (hpi). في هذا النموذج، يمكن تقييم تسلل الخلايا المناعية وموت الخلية عن طريق قياس التدفق الخلوي وتقيس TUNEL. يصف هذا البروتوكول الإجراءات للحث على AKI في حمار وحشي الكبار عن طريق حقن سيسبلاتين داخل الصفاق ويوضح في وقت لاحق كيفية جمع الأنسجة الكلوية لمعالجة قياس التدفق الخلوي واختساب TUNEL موت الخلية. وستكون هذه التقنيات مفيدة لفهم آثار سيسبلاتين كعامل كلي البروتينات وستسهم في توسيع نماذج AKI في حمار وحشي الكبار. ويمكن أيضا أن يستخدم هذا النموذج لدراسة تجديد الكلى, في البحث عن المركبات التي تعالج أو منع تلف الكلى ودراسة التهاب في AKI. وعلاوة على ذلك، فإن الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول تحسين توصيف تلف الأنسجة والالتهاب، والتي هي أهداف علاجية في الأمراض المصاحبة للكلى.

Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

يصف هذا البروتوكول الإجراءات للحث على إصابة الكلى الحادة (AKI) في سمك الحمار الوحشي البالغ باستخدام سيسبلاتين كعامل كلي. قمنا بتفصيل الخطوات لتقييم قابلية إعادة إنتاج التقنية وتقنياتين لتحليل الالتهاب وموت الخلايا في الأنسجة الكلوية ، وقياس التدفق الخلوي و TUNEL ، على التوالي.

نموذج إصابة الكلى الحادة الناجمة عن سيسبلاتين في حمار وحشي الكبار

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

الهدف العام لهذا الإجراء، وأوضح استخدام سيسبلاتين كعامل nephrotoxic في الأسماك حمار وحشي الكبار، وتحليل الالتهاب، وموت الخلايا في أنسجة الكلى. لتحقيق هذا وسمك حمار وحشي الكبار هو تخدير ووزنها لحقن في جرعة محددة من سيسبلاتين في تجويف الصفاق. بعد رصد الوفيات، يتم تشريح الكلى ويتم عزل الخلايا لقياس التدفق الخلوي أو ثابتة وتشريح ليتم تحليلها عن طريق فحص TUNEL الفلورسنت.الإجراءات التالية يمكن أن تساعد على الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال الكلى باستخدام الآثار الكلوية من سيسبلاتين كأداة لتطوير نموذج إصابة الكلى الحادة والأسماك حمار وحشي الكبار. ويمكن استخدام هذا النموذج لاستكشاف أهداف علاجية جديدة في الحماية الكلوية، وكذلك توضيح آلية التجديد في الكلى الأسماك حمار وحشي. سيسبلاتين هو عامل العلاج الكيميائي المستخدمة لعلاج مجموعة متنوعة من السرطان.ومع ذلك، يمكن أن تتراكم بسهولة في الكلى، وتوليد موت الخلايا، والتهاب، وانخفاض وظائف الكلى. تأثير سيسبلاتين تعتمد على الجرعة, حتى تتمكن من خفض زيادة الجرعات لدينا تعتمد على أهدافك. التقنيات المستخدمة هنا لتحليل الالتهاب وموت الخلايا ليست حصرا لنشر نموذج المرض.يمكن أن يساعد قياس التدفق الخلوي في أسماك الحمار الوحشي في توضيح الحالات الالتهابية للحيوان بطريقة كمية ، بينما في TUNEL نقول أنه يمكن توضيح وجود الخلايا المنبثقة في السياقات الفسيولوجية والمرضية. قبل البدء في التجربة، قم بإعداد محلول عمل سيسبلاتين عن طريق تخفيف محلول المخزون إلى 820 ميكروغرام لكل ميل في كلوريد الصوديوم بنسبة 0.9٪. بعد ذلك ، تخدير سمك حمار وحشي آخر وتجفيف فائض الماء على بعض المناشف الورقية.وزن الأسماك عن طريق وضعها على مقياس، مع الأخذ في الاعتبار الوزن. إجراء العمليات الحسابية لمعرفة حجم الدقيق لحقن. لتحقيق جرعة 120 ميكروغرام لكل غرام من الوزن، استخدم الصيغة التالية.تقسيم الجرعة النهائية بجرعة من محلول العمل وتحويل هذا العدد إلى ميكرولتر، عن طريق ضرب ل1000 للحصول على حجم 120 ميكروغرام من سيسبلاتين. ثم، ضرب هذا العدد من وزن السمك للحصول على الحجم النهائي لحقنها. ضع سمكة على اسفنجة مبللة، مع كوب صغير لعقد عليه.مع الجانب البطني لأعلى وملء حقنة الأنسولين مع حجم محسوب من سيسبلاتين. أدخل الإبرة على خط الوسط البطني في زاوية ضحلة، وسحب بلطف الجدار البطني لتجنب ثقب الأعضاء الداخلية. ثم حقن الحل.بعد الحقن، ضع سمكة في خزان للتعافي من التخدير، وانتظر علامات التعافي مثل السباحة والحركات المناسبة. رصد لتلك الأسماك مرتين في اليوم للأيام المقبلة. في هذه الجرعة، سيسبلاتين تحفز حوالي 30٪ من الوفيات في أول 24 ساعة.قتل الأسماك وتجفيف فائض من الماء في منشفة ورقية. بعد إزالة الرأس والأعضاء الداخلية، استخدم إبر التشريح لتثبيت جدران الجسم. حدد موقع الكلى في الجدار الظهري للأسماك ، واستخدم ملقط لفصل الكلى.وضع الكلى في لوحة بئر ستة مع حل بارد من برنامج تلفزيوني واحد 1X، 2٪ FBS والحفاظ على الجليد. بعد ذلك ، التقط الأنسجة مع بعض السائل ومررها عبر مصفاة خلايا 40 ميكرون ، وتهز الأنسجة بلطف باستخدام المكبس المحقن. غسل مرتين مع برنامج تلفزيوني واحد 1X، 2٪FBS.وجمع الخلايا في أنبوب الصقر 50 ميل. ثم الطرد المركزي لمدة خمس دقائق في 400 G.Careful بيك اب supernatant مع ماصة والتخلص منه. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X الباردة لإعادة تعليق الخلايا ووضعها في أنبوب قياس الخلايا تدفق خمسة ميل.أبقهم على الجليد خذ 10 ميكرولترات من العينة واخلطها مع 90 ميكرولتر من أزرق المثقب في أنبوب Eppendorf. إضافة 10 ميكرولتر من الخليط إلى غرفة نيوباور وعدد الخلايا في المجهر.خذ الخلايا لقراءتها بواسطة مقياس الخلايا، ثم قم بتحليل النتائج التي تحدد مجموعة اهتماماتك. لهذا الإجراء، قتل الأسماك وإزالة الأعضاء الداخلية ترك الكلى تعلق على الجسم. ثم، دبوس جدران الجسم إلى سطح الفلين ووضعه تدريجيا على حل التثبيت.أبقها أربع درجات بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، تشريح الكلى مع ملقى غرامة. حاول ألا تعطلهوضعه في طبق بتري صغير أو أنبوب Eppendorf مع برنامج تلفزيوني 1X لشطف. تغيير برنامج تلفزيوني وإعداد 2٪ agarose لتوليد مصفوفة دعم للكلى قبل أن عملية بقوة. تجاهل جميع برنامج تلفزيوني المتبقية وصب agarose ببطء.ثم ضع الكلى مع ملقط ناعم لمنعها من الطي. دع الآغروز يترسخ في درجة حرارة الغرفة. بعد التصلب agarose، استخدم مشرط لقطع أغاروز حول الكلى تشكيل مكعبات صغيرة.ضع مكعبات الآغروز داخل كاسيت النسيج وأرسلها للمعالجة النسيجية لتضمين الأنسجة في البارافين. كتل البارافين، وسوف نقطع بعد ذلك في خمسة أقسام سمك ميكرون. إزالة الشمع الشرائح والاحتفاظ بها في الماء المقطر.إعداد غرفة حاضنة الظلام، ووضع المناشف الورقية الرطبة في الجزء السفلي. وضع الشرائح في غرفة مظلمة، وإضافة Proteinase K لبيرمابيليز من الأنسجة. احتضان لمدة 30 دقيقة في 37 درجة مئوية.في حين يتم احتضان العينات، وإعداد خليط رد فعل TUNEL، عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من محلول الانزيم على 450 ميكرولتر من محلول التسمية. والحفاظ على حماية من الضوء. التقاط غرفة مظلمة وغسل شريحة مرتين مع واحد 1X برنامج تلفزيوني.بعد ذلك، قم بتجفيف الشرائح وعلى خليط تفاعل TUNEL. و تحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين بعد الحضانة، اغسل هذه الشرائح مرة أخرى مع برنامج تلفزيوني واحد 1X.وإضافة DAPI لتلطيخ عداد النوى. الحضانة في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، محمية من الضوء. شطف ثلاث مرات مع واحد 1X برنامج تلفزيوني.وبعد ذلك، قالب الشرائح مع وسيلة مضادة للتلاشي المائية. ضع زلة غطاء. وختم مع طلاء الأظافر.تصور العينات في المجهر الفلورسنت. في هذا الرسم البياني، من الممكن أن نرى أن سيسبلاتين له تأثير استجابة الجرعة على بقاء الأسماك، مقارنة مع السيطرة حقن فقط مع كلوريد الصوديوم 0.9٪. يمثل الخط الأحمر في هذا الرسم البياني جرعة من 120 ميكروغرام لكل غرام مستخدم في هذا الفيديو.ويمكن تطبيق هذه الجرعة على الذكور والإناث, كما لم يتم العثور على فرق إحصائي بينهما. يسمح قياس التدفق الخلوي بتحديد الخلايا المختلفة الموجودة في الأنسجة. يتم تحديد مجموعات الخلايا الدموية في كلية العديد من الأسماك من حيث الحجم أو التشتت إلى الأمام والحبيبة أو الحجم المتناثر.بهذه الطريقة ، من الممكن فصل المجموعات السكانية في خلايا الدم الحمراء ، والخلايا الليمفاوية ، والخلايا الحبيبية ، والسلائف الدموية. هنا، استراتيجية البوابة الحالية اختيار المحببات، المفردات والخلايا الإيجابية MPO تسمح للعثور على السكان من العدلات في الكلى تميزت التعبير الفلوري من myeloperoxidase. في هذه الحالة ، تسبب حقن سيسبلاتين في زيادة النسبة المئوية للنيوتروفيليا الموجودة في الكلى.يسمح فحص TUNEL بالكشف عن الخلايا المبرمج في الأنسجة من خلال مراقبة انزلاق الأنسجة في الكلى بواسطة مجهر مضان ، فمن الممكن رؤية إشارة أبوتوبوتية داخل نواة بعض الخلايا ، هنا باللون الأحمر. يتناقض مع وصمة عار نووية في مثل هذا DAPI هنا باللون الأزرق. حقن سيسبلاتين زيادة وجود خلايا أبوتوبوتيك في الكلى، والتي يمكن تحديدها يدويا أو باستخدام برنامج صورة.في نهاية هذا الفيديو يجب أن تكون قادرا على معرفة كيفية حقن وضبط جرعة سيسبلاتين للحث على إصابة الكلى الحادة في الأسماك حمار وحشي الكبار. وكيفية تشريح الكلى لأغراض مختلفة. قياس التدفق الخلوي هو أداة ممتازة من شأنها أن تساعدك على فهم الملف الشخصي لأنواع الخلايا المختلفة التي تعتمد على توافر خطوط tragenclave في المختبر الخاص بك.تذكر أن تنظر في لون خطوط الناقلين إذا كنت ترغب في استخدام الأجسام المضادة لتسمية جميع أنواع الخلايا الخاصة بهم. إن اختبار TUNEL هو أداة بسيطة تسمح لنا بالكشف عن الخلايا والأنسجة المبرمج ، ويمكن تحليلها ليس فقط عن طريق المجهر ، ولكن أيضا عن طريق قياس التدفق الخلوي. تذكر، استخدم دائما معدات الحماية الشخصية أثناء الإجراء بأكمله.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

التهوية الضغط الشواهد للحث على إصابة الرئة الحادة في الفئران

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

و في الجسم الحي النموذجي القوارض من الإصابات الناجمة عن انكماش ، وغير الغازية ورصد الانتعاش

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

The Spared Nerve Injury SNI Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

وإصابة العصب تنج (SNI) موديل Allodynia الميكانيكية المستحثة في الفئران

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

تقييم التغييرات المشوهة في نموذج الزرد من التعرض الكحول الجنينية

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

نقص التروية-ضخه نموذج من إصابة الكلى الحاد والتليف آخر الاصابات في الفئران

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

نموذج الزرد ممكن من مرض الكلى المتعدد الكيسات: ضربة قاضية لل<em&gt; wnt5a</em&gt; أسباب الخراجات في الكلى اسماك الزرد

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis الناجم عن نقص التروية التنسيق نموذجا من اصابات الحبل الشوكي في الفئران

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

الناجمة عن غسيل السطحي استنفاد في الخنازير كنموذج للاستغاثة متلازمة التنفسية الحادة (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

فتح القصبة الهوائية المعدة حمض الطموح فأري موديل الحاد الرئة إصابة النتائج في القصوى الحاد غير قاتل الرئة الإصابات

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...