Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Denne forskning blev støttet af Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finanskode 001. Vi takker vores samarbejdspartnere på Laboratoriet af Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno's og Zebrafish Facility of the Genetics and Evolutionary Biology Department, i Bioscience Institute ved universitetet i São Paulo. Vi takker Cristiane Naffah de Souza Breda og Theresa Raquel de Oliveira Ramalho for kommentarerne og forslagene til manuskriptet. Vi sætter stor pris på og takker Marcio Villar Martins, fra multimedie-team af Institut for Biomedicinske Videnskaber, for optagelse, udgave og produktion af denne video.

De procedurer, der er beskrevet i denne protokol, blev tidligere godkendt til brug i zebrafiskmodellen af Animal Use Ethics Committee fra Institute of Biomedical Sciences ved universitetet i São Paulo.
1. AKI Induktion af Cisplatin Intraperitoneal Injektion
<ol><li>Der fremstilles cisplatinarbejdsopløsning ved at fortynde stamopløsningen til 850 μg/mL i 0,9% NaCl. Hold ved stuetemperatur, beskyttet mod lys. ADVARSEL: Fabrikanten anbefaler manipulation af cisplatin med personlige værnemidler (PPE), herunder beskyttelsesbriller, handsker og laboratoriekittel. Opbevar lageropløsningen ved stuetemperatur, beskyttet mod lys.</li>
	<li>Forbered 150 mg/L MS-222 (Tricaine) bedøvelsesmiddel i systemvand45. Bedøve voksen zebrafisk (5-9 måneder) ved nedsænkning i ca. 1-2 min. BEMÆRK: Effektivt bedøvede fisk bør være uansvarlige at røre ved. For at teste effektiv anæstesi skal du forsigtigt trykke på halefinnen for at observere reaktionen. ADVARSEL: Tricain er irriterende for hud og øjne, brug PPE til at manipulere.</li>
	<li>Ved hjælp af en plastikske overføres fisken til en absorberende overflade, såsom papirhåndklæder, for at fjerne overskydende vand rundt om kroppen. Derefter overfører fisken med plastskeen til en petriskål over en skala og vejer fisken. Vær opmærksom på fiskens vægt, da det vil være nødvendigt for dosisberegninger. BEMÆRK: Hvis overskydende vand absorberes fra fisk, forhindres overvurdering af dyrets vægt, må det ikke overtørres, da det er skadeligt for fisken.</li>
	<li>For at opnå den endelige dosis på 120 μg/g vægt μg af den endelige dosis (120 μg) pr. μg af cisplatinarbejdsopløsningen (850 μg) og konvertere dette tal til mikroliter (μL) ved at formere sig i 1000 for at få volumen på 120 μg cisplatin (141,2 μL). Derefter multipliceres dette tal (141,2 μL) for fiskens vægt (g) for at få det endelige volumen, der skal injiceres.</li>
	<li>Med en plastikske overføres fisken på en våd svamp med et lille snit for at holde den med den ventrale side op. Svampen skal være våd med bedøvelsesmiddel i systemvand.</li>
	<li>Fyld en 31 G 1,0 ml insulinsprøjte med den beregnede mængde cisplatin arbejdsopløsning.</li>
	<li>Indfør nålen i dyrets intraperitoneale del nær bækkenfinnen i en lav vinkel for at undgå at punktere indvoldene (Figur 2A). Derefter injiceres opløsningen langsomt.</li>
	<li>Efter injektion placeres fisken i en tank for at komme sig efter anæstesi. Se fisken for tegn på normal genopretning(f.eks svømning bevægelser, operkulære bevægelser). BEMÆRK: Dyret skal komme sig i de næste 3-5 minutter. Om nødvendigt stimulere fisken ved at flytte den med en plastikske, en Pasteur plastpipette eller sætte den tæt på en slange med bobler.</li>
	<li>For kontrolfisk skal du udføre den samme procedure ved at injicere en opløsning på 0,9% NaCl. Brug samme beregning efter andelen af kropsvægt: Det volumen, der skal injiceres, vil være 141 μL ganget med fiskens vægt (g).</li>
	<li>Monitorer fiskens overlevelse mindst to gange om dagen i de følgende dage (figur 2B).</li>
</ol>2. Nyreisolation og vævsbehandling for flowcytometri af immunceller
<ol><li>Til denne procedure skal du anvende immuncelle-fluorescerende mærkede transgenedyr (f.eks.</li>
	<li>Efter 24 hpi på 120 μg/g cisplatin aflives dyr ved hypotermisk stød (hurtig nedkøling). BEMÆRK: Hypotermisk chok har vist sig at være mere effektiv som aktiv dødshjælp metode end MS-222 overdosis. Hypotermisk chok er mindre stressende, hurtigt, konsekvent og sikrere for personalet end brugen af MS-222, har tidligere beskrevet46,47.</li>
	<li>I en ydre krydsningstank forbereder isvand i et 5:1-forhold mellem is og systemvand, sæt den indre tank med en skærm over isen, vent til vandet når 2-4 °C. BEMÆRK: Fisk bør ikke være i direkte kontakt med isen, da dette kan forårsage termiske forbrændinger og smerter.</li>
	<li>Overfør dyr til isvand, vent mindst 10 minutter, indtil der er tab af orientering og ingen operkulær bevægelse.</li>
	<li>Med en plastikske skal du placere fisken på papirhåndklæder for at tørre det overskydende vand af.</li>
	<li>Overfør fisken til en 3% agarose dissektion plade og tage det under et stereoskop med øvre lys. Med en saks, halshugge fisk gør en hurtig snit lige bag øjnene, og fjerne hovedet.</li>
	<li>Med fin saks laves et snit fra den åbne side til cloaca og fjern de indre organer med fine pincet.</li>
	<li>Brug insektstifter til at klemme siderne af kroppens vægge for at åbne slagtekroppen og udsætte nyrerne fastgjort til rygraden.</li>
	<li>Løsrive nyrerne med fine pincet og læg organet i en 6 brønd plade med en kold opløsning på 1x PBS/2% FBS. Bliv ved med at være på is.</li>
	<li>Opsummer vævet med en Pasteur-plastpipette, og send vævet gennem en 40 μm cellesien over et 50 mL rør, og macerating det forsigtigt med en sprøjte stemplet.</li>
	<li>Vask to gange med 1 mL 1x PBS/2% FBS og opsaml cellerne i et 50 mL rør.</li>
	<li>Centrifugeceller ved 400 × g i 5 min ved 4 °C.</li>
	<li>Tag forsigtigt alle supernatanten op med en 1 mL mikropipette, og kassér den. Der tilsættes 500 μL kold 1x PBS for at genbruge cellerne og placere dem i 5 mL flow cytometrirør. Bliv ved med at være på is.</li>
	<li>Tæl celler i Neubauer kammer gør en 1:10 fortynding i Trypan Blue (f.ekstage 10 μL af prøven og blandes med 90 μL Trypan Blue). Der tilsættes 10 μL af blandingen til et Neubauer-kammer og tælles celler under mikroskopet. BEMÆRK: Der forventes optimale resultater med 1-5 x 106 celler/mL og >80% levedygtighed. ADVARSEL: Trypan blue er et kræftfremkaldende middel, brug PPE til at håndtere.</li>
	<li>Tag cellerne til at blive læst af et cytometer. Analyser derefter resultaterne ved valg af interessepopulation.</li>
</ol>3. Behandling af voksen zebrafisk nyrevæv til TUNEL Assay
<ol><li>Til denne procedure skal du anvende vilde dyr(f.eks.AB, Tübingen osv.) eller et transgent dyr med forskellig fluorescerende farve end TUNEL-sættet, da lignende fluorescens kan forstyrre TUNEL's analyse.</li>
	<li>Efter 24 hpi på 120 μg/g cisplatin aflives dyr ved hypotermisk stød (hurtig nedkøling). Se 2.3-2.4.</li>
	<li>Dissekere fisken som beskrevet i 2.5-2.6; nyrerne skal forblive fastgjort til rygraden under fikseringsproceduren (forklaret nedenfor).</li>
	<li>Brug insektstifter, klem siderne af kroppens vægge for at åbne slagtekroppen og fastgør den på en korkoverflade for at holde nyrerne udsatte. BEMÆRK: Denne procedure sikrer, at nyrerne forbliver i den rigtige position til senere analyse.</li>
	<li>Placer derefter korkoverfladen med nyrerne nedad i en 6-brøndsplade over en frisklavet opløsning på 4% paraformaldehyd (PFA). Hold den natten over ved 4 °C. ADVARSEL: PFA er kræftfremkaldende og irriterende for hud- og slimhindeoverflader. Forbered PFA-opløsninger under en kemisk emhætte ved hjælp af PPE, herunder øjenværnsudstyr.</li>
	<li>Den næste dag dissekere nyrerne som i 2,8. Placer nyrerne i en 60 mm petriskål med 1x PBS og skyl to gange i 1x PBS.</li>
	<li>Forbered 2% agarose til at generere en støtte matrix for vævet.</li>
	<li>Kassér alle resterende 1x PBS fra Petri parabol og hæld 2% agarose langsomt til at dække hele orgel. Placer derefter nyrerne ved hjælp af fine pincet under et stereomikroskop for at forhindre nyrerne i at folde. Lad agarose størkne ved stuetemperatur. BEMÆRK: Denne procedure vil holde organets orientering og form gennem histologisk behandling, da organets bladlignende form forårsager en tendens til at folde, hvis det ikke er inde i en understøttende matrix.</li>
	<li>Efter agarose størkning, bruge en skalpel til at skære agarose omkring vævet, danner små terninger, og fjerne overskydende agarose omkring vævet.</li>
	<li>Placer agarose terningerne i en kassette egnet til histologisk behandling. BEMÆRK: Følgende trin kan udføres manuelt eller i en automatisk vævsprocessor.</li>
	<li>For det første skal vævet behandles i kassetten efter de næste trin i 45 minutter hver ved stuetemperatur: et bad med 50% ethanol, et bad på 70% ethanol, to på hinanden følgende bade på 95% ethanol og tre på hinanden følgende bade med 100% ethanol. Derefter behandles vævet i to på hinanden følgende bade af Xylen og tre på hinanden følgende bade af paraffin; sidstnævnte varer hver 1 time ved 60 °C. ADVARSEL: Foretag ændringer under en kemisk emhætte, dampe fra ethanol og xylen er irriterende og giftige.</li>
	<li>For at forberede paraffinblokke smeltes paraffin linser til 60 °C.</li>
	<li>Åbn plastkassetten med vævet indeni og hold det på en varm plade. Opvarmning af metalforme til paraffinen.</li>
	<li>Med pincet placere vævet over en metalform, så nyrelængden er parallel med formen base. Tilsæt paraffin, omfordele vævet, hvis det er nødvendigt.</li>
	<li>Dæk formen med bunden af kassetten og tilsæt paraffin, indtil gitteret er dækket. Lad størkne ved stuetemperatur og derefter placere ved -20 °C for en hurtigere størkningsproces.</li>
	<li>Slip paraffin blok fra metalform omkring 20-30 minutter senere.</li>
	<li>Med en mikrotome, sektion vævet indlejret i paraffin til 5 μm tykkelse. Brug silaniserede eller positivt ladede glasrutsjebaner til at indsamle vævet.</li>
</ol>4. TUNEL-analyse
BEMÆRK: Følgende protokol bruger et In Situ Cell Death Detection Kit (Table of Materials).
<ol><li>Dewax væv dias placere dem i to på hinanden følgende bade af xylen i 5 min. Derefter rehydrere vævet gennem en gradueret serie af ethanol: 100%-95%-70%-50%, i 5 min hver.</li>
	<li>Placer rutsjebaner i rindende koldt vand fra hanen for at skylle ethanol. Hold rutsjebanerne i destilleret vand.</li>
	<li>Forbered et mørkt inkubatorkammer. Tilsæt våde papirhåndklæder på bunden for at holde fugten under inkubationstrinnene. BEMÆRK: I mangel af et inkubatorkammer er det muligt at bruge en petriskål med fugtigt papir i bunden og to tandstikkere til at placere rutsjebanen.</li>
	<li>Forbered frisk Proteinase K arbejdsopløsning: 10 μg/mL i 10 mM Tris/HCl, pH 7,4-8. BEMÆRK: Proteinase K anvendes som et gennemtrængningsmiddel, som anbefalet af stoffet.</li>
	<li>Placer lysbillederne i det mørke inkubatorkammer, og tilsæt Proteinase K arbejdsopløsning, indtil dækprøverne er udtaget. Inkuber i 30 min ved 37 °C.</li>
	<li>Mens prøverne inkuberes, fremstilles TUNEL-reaktionsblandingen: Der tilsættes 50 μL enzymopløsning til 450 μL etiketopløsning. Beskyt mod lys. BEMÆRK: Den mængde, der skal fremstilles, kan justeres i samme 1:10-proportion. Volumenet beregnes til 50 μL af blandingen for hvert afsnit. Dette kan ændre sig afhængigt af prøvernes størrelse.</li>
	<li>Pick up det mørke kammer og vask dias to gange med 1x PBS.</li>
	<li>Derefter tørres området omkring prøven med absorberende papir, og der tilsættes 50 μL TUNEL-reaktionsblanding over hvert vævsdias, og opløsningen spredes, så hele prøven dækkes. Inkuber ved 37 °C i 2 timer. Beskyt mod lys.</li>
	<li>Efter inkubation skylles rutsjebanen tre gange med 1x PBS, og området tørres omkring prøven med papirhåndklæder.</li>
	<li>Der tilsættes 50 μL DAPI 1:1000 til prøverne til nuklear modfarvning og inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur. Beskyt mod lys.</li>
	<li>Skyl igen tre gange med 1x PBS og tør området omkring prøven.</li>
	<li>Monter rutsjebanen med et anti-fade hydrofilt medium, placer en coverlip og forsegl med neglelak. Opbevar lysbilleder vandret, beskyttet mod lys ved 4 °C. BEMÆRK: Monteringsmediets anti-fade-egenskaber skal bevare prøvernes fluorescens, men det er muligt at anvende ethvert hydrofilt medium, der er tilgængeligt. Det sidste tætningstrin med neglelak er afgørende for at undgå dehydrering.</li>
	<li>Visualiser prøverne under et fluorescensmikroskop. For denne type fluorescerende pigment skal du bruge en excitationsbølgelængde i området 520-560 nm (grøn) og detektion i området 570-620 nm (rød).</li>
</ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Forekomsten af nyresygdom er fortsat med at stige på verdensplan og bliver et globalt folkesundhedsproblem, der påvirker millioner af mennesker63. At finde en måde at behandle nyreskadede personer er af afgørende betydning samt forstå mere om deres ætiologi og progression. Flere undersøgelser har brugt dyremodeller til at forstå nyreskader. Zebrafisk nyre (Figur 1) er blevet undersøgt i årevis i udviklingsbiologi og skade forskning på grund af sin selvregenererende kapacitet og genetiske lighed29,64. Her præsenterer vi en ny AKI-model i voksen zebrafisk ved hjælp af cisplatins egenskaber som et nefrotoksisk middel, der beskriver trinene til at opnå en hurtig og akut reaktion med skader synlige, så snart 24 hpi (Figur 2). Desuden forklarer vi her to teknikker, der vil hjælpe med at evaluere vævsskaden efter cisplatinindsprøjtningen, flowcytometry og TUNEL (Figur 3).
Nuværende AKI-modeller i voksne zebrafisk omfatter i.p. injektion af gentamicin, som fremkalder omfattende skader i nephron og tubule ødelæggelse, neonephrogenesis begivenheder starter fra dag 5, og regenerering er afsluttet med 21 dage efter injektion65. På den anden side blev en model af sepsis-associeret akut nyreskade (S-AKI) etableret ved infektionen med Edwardsiella tarda, da signifikant øgede ekspressionen af AKI-markører, såsom insulinlignende vækstfaktorbindende protein-7 (IGFBP7), vævshæmmer af metalloproteinaser 2 (TIMP-2) og nyreskademolekyle-1 (KIM-1), hos larver og voksne zebrafisk66. Zebrafisken er kendt for at være et dyr med høj gennemstrømning til søgning af terapeutiske midler, og dette omfatter brugen af probiotika og mikrobiota-afledte metabolitter til undersøgelse af nyrefunktion og regenerering67. Men de tilgængelige modeller kan direkte påvirke resultatet af disse behandlinger. Således har vi etableret en anden metode til at fremkalde AKI hos voksne zebrafisk (Figur 4), ved hjælp af cisplatin som et kendt nefrotoksisk middel, der ikke ville have direkte kendte virkninger på fiskens mikrobiota, ligesom gentamicinmodellen for at være et antibiotikum eller infektionen med E. tarda, for at være en sepsismodel. Men samtidig med at vi var ved at udvikle vores cisplatin protokol, en anden gruppe også undersøgt de nefrotoksiske virkninger af cisplatin hos voksne zebrafisk, forenkle dosis til 10-20-30 μg pr dyr68. Selv om de også viste cisplatin dosisafhængig effekt i overlevelse, anbefaler vi forsigtighed ved brug af en enkelt mængde cisplatin til alle fisk, da zebrafisk fra samme alder kan have meget forskellige størrelser og vægt, og dette kan fremkalde variationer i resultaterne69,70. Vi synes er vigtigt at justere dosis til dyrets tilsvarende vægt, som det gøres i mus og denne undersøgelse.
I vores eksperimenter med voksne zebrafisk viste cisplatin en dosisresponseffekt. Dette blev visualiseret ved at overvåge dyrenes overlevelsesrate efter cisplatininjektion (figur 5). Vi brugte overlevelse som en måde at estimere intensiteten af dosis af cisplatin og ikke som et mål for nephrototoksicitet, da intet andet fysisk tegn er synligt i overvågningstiden. Dette kan sammenlignes med gnavere, hvor sværhedsgraden af nyreskaden kan moduleres ved dosering og hyppighed af cisplatin injektion15, opnå dødelige doser med højere koncentrationer af cisplatin71. Døde ses også i de følgende dage i larvemodellen af cisplatin72. Da vores mål var at fremkalde en akut skade på få dage, valgte vi 120 μg/g dosis cisplatin, som det er muligt at observere nyreskader 24 timer efter injektionen, men dette kan justeres afhængigt af undersøgelsens mål.
Hos mennesker diagnosticeres AKI klinisk af nedsat glomerulær filtreringshastighed (GFR), forhøjet serum kreatinin og blod urea nitrogen3. I zebrafisk omfatter repertoiret af AKI-modeller nogle genetisk betingede modeller73,74 og nogle lægemiddelrelaterede modeller65,72, men da nogle af AKI funktionelle parametre ikke kan måles på zebrafisk på grund af tekniske vanskeligheder(f.eks. blodsamling), vedtager de fleste forskning morfologiske og visuelle teknikker til at observere funktionerne i AKI1,75 som vores undersøgelse.
Hos gnavere kommer cisplatin ind i epitelcellerne i de proksimale og distale tubules, inde i cellen gennemgår metabolisk aktivering og bliver meget reaktiv, der virker på celleorganeller og fremkalder ændringer i cellestrukturen. Disse ændringer kan fremkalde apoptose og autofagi og endda nekrose, ved meget høje doser. Som reaktion på denne skade frigives mange cytokiner, og leukocytter rekrutteres, hvilket fører til betændelse og påvirker organets funktionalitet15. Dette fremhæver vigtigheden af at vurdere, hvilken type celler der kan findes i den skadede nyre, som beboere eller infiltrerede immunceller. Her viste vi, hvordan man vurderer dette ved flow cytometry, ved hjælp af transgene immun reporter linjer til rådighed i dag (Tabel 1). Cisplatin øgede procentdelen af neutrofiler (mpo:GFP positive celler) i nyrerne 24 timer efter injektionen (Figur 6). I tilfælde af zebrafisk er nyrerne nichen af HSC'er, der giver anledning til forskellige blodcelletyper. Ikke desto mindre cirkulerer mange granulocytter og makrofager normalt i blodet. I vores eksempel brugte vi den mpo:GFP transgene linje, der udtrykker GFP under promotoren af myeloperoxidase af neutrofiler52. Originale undersøgelser af mpo:GFP transgen linje demonstreret udtryk for myeloperoxidase i forskellige tilstande af neutrofil modning76, men vores gate strategi fokuseret på granulocyte fraktion, der omfatter modne celler, der kommer fra blodet52, på denne måde vores analyse omfatter infiltrerede celler og ikke hjemmehørende celler. Dette er vigtigt at overveje, når man isolerer den ønskede cellepopulation.
Som forklaret ovenfor er apoptose den mest klassiske markør for cisplatin-relateret AKI. Her demonstrerede vi en simpel protokol for lokalisering af døde celler ved TUNEL-analysen. Cisplatin-injektionen øgede antallet af apoptotiske celler 24 hpi (Figur 7). Dette kan let kvantificeres ved at tælle direkte de døde celler fra vævet. Ikke desto mindre kan brugen af antistoffer mod den ønskede celle(f.eks. rørceller) eller brugen af en transgen reporterlinje anvendes sammen med denne teknik til identifikation af cellespecifik død. Sammenlignet med den gentamicin-inducerede model af AKI ser cisplatin ud til at være en mere alvorlig model, da gentamicinapoptose var højere på den tredje dag efter injektion65.
På trods af at have en række bivirkninger, cisplatin er stadig meget udbredt i kræftbehandling, på grund af dens effektivitet mod forskellige typer af kræft, herunder karcinomer, kimcelle tumorer, lymfomer, ogsarkomer 77. Nephrotoxicity forekommer hos en tredjedel af patienterne i behandling med cisplatin10, således er det bydende nødvendigt at søge efter strategier, der kan reducere denne effekt og øge renoprotection. Vi mener, at de metoder og teknikker, der præsenteres i dette manuskript, vil bidrage til at belyse mekanismer til nyreskade og finde terapeutiske mål, der kan være afgørende for at forbedre livskvaliteten for personer, der lider af nyrekomplikationer, overvejende dem, der er relateret til brugen af cisplatin.

Nyrerne er ansvarlige for flere vigtige fysiologiske funktioner, der opretholder homøostase, såsom blodfiltrering, fjernelse af overskydende rester og regulering af ionkoncentrationer1. Skader på nyrevæv kan føre til en heterogen tilstand kaldet Akut nyreskade (AKI), som klinisk beskrives som et hurtigt fald i nyrefunktion forårsaget af ødelæggelse og død af rørformede epitelceller, endotelcelleskade og leukocyt infiltration 2,3. AKI er en tilstand, der forventes at ske i 8-16% af hospitalsindlæggelser4, med en høj dødelighed, der varierer fra 20 til 50% i intensivafdelingen (ICU)5. Denne lidelse er forbundet med øget hospitalsophold og betydelig brug af økonomiske ressourcer5. Ætologiske faktorer omfatter dehydrering, chok, infektioner, sepsis, hjerte-kar-sygdomme og nefrotoksiske lægemidler6. Nephrotoxicity defineres som en nyreskade forårsaget af stoffer, der forårsager virkninger som AKI, tubulopatier og glomerulopatier7. Nephrotoxicity påvirker to tredjedele af ICU-patienter, da ca. 20% af de lægemidler, der er ordineret på intensivafdelingen, betragtes som nefrotoksiske8,9, dette omfatter nonsteroide antiinflammatoriske lægemidler (NSAID), antibiotika som vancomycin og aminoglycosides og kemoterapeutiske midler som methotrexat og cisplatin7. Cisplatin er en af de mest potente og almindelige kemoterapi lægemidler, der anvendes til behandling af faste tumorer, såsom hoved og hals, testikel, æggestokkene, og blære10. I nyrerne internaliseres cisplatin i det proksimale indviklede rør (PCT) gennem den organiske kationiske transportør 2 (OCT-2) og i høje koncentrationer binder sig til dna-udløser celledødsvejene7,10,11,12. Akkumulering af dette lægemiddel i nyrerne bidrager til nephrototoksicitet med død ogbetændelse 13. Denne skadelige bivirkning påvirker enormt liv og prognose for en tredjedel af kræftpatienter, der gennemgår cisplatinbehandling, så det er bydende nødvendigt at forske i nye terapier, der kan sænke nephrotoxicity uden at miste dræbereffekten på kræftceller10.
På grund af denne nefrotoksiske virkning anvendes cisplatin almindeligvis som en induktor af AKI i eksperimentelle dyremodeller, som beskrevet fremad. Hos gnavere blev den første AKI-model fremkaldt af cisplatin rapporteret i 197114, men på nuværende tidspunkt er der opstået mange forskellige protokoller ved hjælp af de dosisafhængige og kumulative virkninger af cisplatin15. Derved, afhængigt af doseringen og antallet af applikationer, forskellige sværhedsgrader af nyreskade kan induceres16,17,18,19,20,21. Den hyppigste metode består af en intraperitoneal (i.p.) injektion af en dosis cisplatin efterfulgt af aktiv dødshjælp i de følgende dage. I denne klassiske protokol fremkalder en enkelt høj nefrotoksisk dosis cisplatin (10-13 mg/kg hos mus og/eller 3-8 mg/kg hos rotter) alvorlige histologiske ændringer, såsom tab af børstekant og cellerester inde i rørformede lumen, få dage efter cisplatininjektionen. Sværhedsgraden af histologiske ændringer er dosisafhængig, og tegn på regenerering observeres 7 dage efter cisplatin injektion16,17.
Selvom gnavermodeller er veletablerede, besluttede vi at drage fordel af egenskaberne ved et andet hvirveldyr og fokusere vores undersøgelser på zebrafisken (Danio rerio). Denne fisk er blevet flittigt brugt til modellering af menneskelige sygdomme på grund af sin lille størrelse, ekstern befrugtning, høje reproduktionsrater, hurtig udvikling, gennemsigtighed af embryoner og larver, lave vedligeholdelsesomkostninger, lignende anatomi som pattedyr (med nogle undtagelser), høj vævsregenereringskapacitet, social adfærd, 70% af genetisk lighed med mennesker og 84% med menneskelige sygdomme-associerede gener22. Streisinger et al.23,24,25 startede undersøgelserne med zebrafisk, der bekræftede gennemførligheden af at udnytte denne modelorganisme til genetisk analyse af hvirveldyrudvikling. I nyreforskning er zebrafisken opstået ikke kun i udviklingsundersøgelser, men også som et genetisk værktøj i søgen efter nye gener forbundet med nyreforhold26. Desuden gør regenereringskapaciteten uden ardannelse og evnen til at generere nephron gennem deres liv, kaldet neonephrogenese, zebrafisken til en vigtig dyremodel til regenereringsforskning27,28. Desuden viser tilgængeligheden af eksperimentelle modeller for forskellige nyresygdomme, herunder akut og kronisk nyreskade, alsidigheden af denne eksperimentelle organisme26,29. Som hos pattedyr stammer zebrafiskens nyre forfædre fra den mellemliggende mesoderm. Sådanne nyre forfædre genererer de pronephros, der senere vil udvikle sig til mesonephros, som vil blive opretholdt som et modent organ indtil voksenalderen29,30.
Den voksne zebrafisk nyre er placeret på kroppens dorsale væg, mellem svømmeblæren og rygraden29. Fra en ventral visning kan zebrafisken opdeles i tre regioner(figur 1A):hoved (H), bagagerum (Tr) og hale (Ta)29. Samme som pattedyr har zebrafisken nephronerne som funktionelle enheder af nyrerne, som er opdelt i tubulesegmenter (Figur 1A): nyrekorpuskel (RC), proksimal indviklede tubule (PCT), proksimal lige tubule (PST), distal tidligt (DE), sen distal (DL) og opsamlingskanal (CD)29. Zebrafisk deler genetisk bevarelse og strukturelle ligheder med humane nephrons (Figur 1B), men mangler nogle konformationer såsom den mellemliggende tubule, også kendt som løkken af Henle (LH)29,31. Ferskvandsfisk som zebrafisk er normalt omgivet af et medium med meget lav osmolaritet, på grund af dette har de tendens til at være hyperosmotiske og afhænge af gællerne, huden i tidlige stadier og nyrerne til at regulere osmolaritet og vandudsledning32. Filtreringen af blod fra dorsal aorta af tilbøjeligephros begynder omkring 48 timer efter befrugtning (hpf)33,34. Zebrafiskens nyre er ikke kun et metabolisk affaldsudsletningsorgan, men fungerer også som et hæmatopoietisk organ fra 4 dage efter befrugtning (dpf) til voksenalderen, og det svarer til knoglemarven hos pattedyr35. Under udviklingen, hæmatopoietiske stamceller (HSC' er) vil frø nyrerne, selvrenovere, og generere myeloid, erythroid, og lymfoid celle afstamning, opretholde transskription faktorer, signalering molekyler, og stærkt bevaret genetiske programmer med pattedyr36,37. Undersøgelser har vist, at de fleste erythroid, trombocytiske, myeloide og lymfoide celler i det menneskelige immunsystem er til stede i zebrafisk37,38. De unikke egenskaber ved dette dyr og de bevarede funktioner med den menneskelige nyre gjorde denne modelorganisme fordelagtig i forskningen i nyrefunktion, skade og regenerering.
Selvom zebrafiskens nyre er godt undersøgt, og nogle modeller af AKI allerede er tilgængelige i larve og voksen zebrafisk28, var der på tidspunktet for etableringen af denne protokol ingen tegn på en kemisk induceret ikke-antibiotisk AKI-model hos voksne zebrafisk. Derudover fokuserer vores laboratorium på at teste probiotiske bakterier og mikrobiota-afledte forbindelser for at studere regenerering og nyreskader, og derfor koncentrerede vi vores indsats om at skabe en ny cisplatin-induceret AKI-model i voksne fisk. Den videoartikel, der præsenteres i dette manuskript, demonstrerer procedurerne for en ny model for AKI-induktion ved hjælp af en i.p. injektion på 120 ug cisplatin pr. g dyr (120 μg/g) (Figur 2A). Denne dosis var oprindeligt baseret på undersøgelser af AKI induceret af cisplatin i murinmodeller, der gik omkring 10 mg/kg (svarende til 10 μg/g)14,15,16,17, men denne dosis var ikke tilstrækkelig til at fremkalde nyreskader relateret til nephrotoksicitet (data ikke vist). Således øgede vi dosis til dem, der anvendes i denne undersøgelse (Figur 2B). Vores arbejde afslørede en dosisafhængig effekt af cisplatin i overlevelsesraten efter injektion med induktion af nyrevævsskader 24 hpi som vist ved tab af rørstruktur, øget inflammatorisk infiltrere og høj celledødsfald. Her beskriver vi to teknikker til analyse af udviklingen af cisplatin-induceret AKI: flowcytometry, til at analysere celleinfiltration og TUNEL til måling af celledød. Flowcytometri er en teknologi, der måler cellernes fysiske (størrelse og granularitet) og kemiske (fluorescerende forbindelser). Inde i cytometeret løber celleaffjedringen gennem en kappevæske, der organiserer cellerne i en enkelt linje, så de kan passere gennem en laserstråle en celle ad gangen (Figur 3A). En detektor foran lysstrålen måler FSC (Forward Scatter), som korrelerer med cellestørrelse, og detektorer til siden måler den side scatter (SSC), der korrelerer med cellernes granularitet. Andre detektorer vil måle fluorescensen fra partikler , fluorescerende proteiner eller antistofmærkede celler39,40. Da kommercielle antistoffer mod zebrafisk er knappe i dag, gør brugen af dyrejournalister og fluorescerende biomarkører det muligt at forbedre denne analyse og identificere forskellige cellepopulationer41,42,43. Et andet værktøj, der blev brugt i denne protokol, var TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferase) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) analyse. TUNEL-analysen er en sen-fase apoptosedetekteringsmetode, der er afhængig af TdT's evne til at identificere fragmenteret DNA og mærke det med deoxynukleotider mærket med en fluorescerende markør, der senere kan visualiseres og kvantificeres ved mikroskopi44 (Figur 3B). I betragtning af at et af de mest slående træk ved AKI er induktion af apoptose i rørformede nyreceller3, er denne teknik yderst fordelagtig, da den kan analyseres ved flowcytometry og / eller mikroskopi.
Tilgangene i denne artikel gør det muligt at observere AKI-status og tilbyde en ny akut model til undersøgelse af AKI-lidelser, der kan være nyttige til forskning i nye terapeutiske mål i cisplatin-relateret AKI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

Cisplatin er almindeligt anvendt som kemoterapi. Selv om det har positive virkninger hos kræftbehandlede personer, cisplatin kan nemt ophobes i nyrerne på grund af sin lave molekylvægt. En sådan akkumulering forårsager dø af rørformede celler og kan fremkalde udviklingen af akut nyreskade (AKI), som er karakteriseret ved et hurtigt fald i nyrefunktion, vævsskader og immunceller infiltration. Hvis cisplatin gives i specifikke doser, kan det være et nyttigt redskab som AKI-inducer i dyremodeller. Zebrafisken har vist sig som en interessant model til at studere nyrefunktion, nyreregenerering og skade, da nyrestrukturer bevarer funktionelle ligheder med pattedyr. Voksne zebrafisk injiceret med cisplatin viser nedsat overlevelse, nyrecelledød og øgede betændelsesmarkører efter 24 timer efter injektion (hpi). I denne model kan immunceller infiltration og celledød vurderes ved flow cytometry og TUNEL assay. Denne protokol beskriver procedurerne for at fremkalde AKI hos voksne zebrafisk ved intraperitoneal cisplatin injektion og viser efterfølgende, hvordan man indsamler nyrevævet til flowcytometribehandling og celledød TUNEL-analyse. Disse teknikker vil være nyttige til at forstå virkningerne af cisplatin som et nefrotoksisk middel og vil bidrage til udvidelsen af AKI-modeller hos voksne zebrafisk. Denne model kan også bruges til at studere nyreregenerering, i søgen efter forbindelser, der behandler eller forhindrer nyreskader og til at studere betændelse i AKI. Desuden vil de metoder, der anvendes i denne protokol, forbedre karakteriseringen af vævsskader og betændelse, som er terapeutiske mål i nyrerelaterede comorbiditeter.

Zebrafiskens nyre er et fladt pigmenteret organ placeret på dorsalvæggen, og dens grundlæggende funktionelle enhed, nephron, bevares med pattedyr (Figur 1). Det særlige ved at have kun en nyre med en høj kapacitet af regenerering gør denne model organisme et glimrende valg for model nyreskade. De protokoller, der præsenteres i dette arbejde, har til formål at fremkalde AKI ved intraperitoneal (i.p.) injektion af cisplatin hos voksne zebrafisk (figur 2) og senere analyseres ved hjælp af to teknikker, der er beskrevet før: flowcytometry (Figur 3A) og TUNEL (Figur 3B). Et rutediagram over hele processen er afbildet i figur 4. Doserne af cisplatin blev oprindeligt anvendt på grundlag afdem,der er beskrevet i musemodellerne15,16,17, hvor den anvendte standard er 10-13 mg cisplatin pr. kg dyr (mg/kg). Zebrafisken viste sig imidlertid at være mere modstandsdygtig over for cisplatin end musen (data vist ikke), og den endelige dosis blev øget. Da vi vurderede dyrenes overlevelsesrate, viste forsøgene en dosisafhængig virkning af cisplatin (Figur 5A). På grund af dette anbefaler vi at følge instruktionerne nøjagtigt som forklaret i denne protokol og overvåge dyrenes overlevelsesrate konstant som et mål for reproducerbarhed, før du samler materiale. Efter i.p. injektionen på 120 μg/g cisplatin (Figur 5A, rød linje) blev der observeret et fald i overlevelsen på ca. 30% af dyrene i de første 24 timer, og overlevelsen faldt gradvist, indtil den nåede op på ca. 20% af levende dyr på dag 5 efter injektionen, derefter stabiliseret ( Figur5A). Cisplatintoksicitet blev ikke påvirket af dyrenes køn, da mænd og kvinder har lignende overlevelseskurver (Figur 5B).
Analyse af kinetik af cisplatin-induceret AKI viste øget inflammation og celledød i nyrerne 24 hpi. En af de hurtigste og kvantitative måder at evaluere inflammation er flow cytometry, men i betragtning af manglen på antistoffer mod zebrafisk antigener til rådighed kommercielt for denne teknik, er nødvendig for at bruge en transgen linje med en immun markør. I dag er mange zebrafiskelinjer, der mærker immunceller, tilgængelige (tabel 1). Disse linjer kan bruges alene eller i kombination, givet nok repertoire til analyse48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Dette forenkler enormt teknikken, da det ikke er nødvendigt noget antistofinkubationstrin, tværtimod efter isolering af cellerne ved mekanisk adskillelse er den direkte aflæsning på cytometeret mulig.
Som nævnt før er zebrafiskens nyre ikke kun et blodfiltreringsorgan med homeostatiske funktioner, men også det anatomiske sted for hæmatopoiesis hos voksne, svarende til knoglemarven hos pattedyr33,34,35. På denne måde, når vi analyserer det ved flowcytometri, er det muligt at differentiere cellepopulationer, der kan sammenlignes med det menneskelige blod61,62 (Figur 6A), dette giver os mulighed for at identificere cellepopulationerne oprindeligt efter størrelse og granularitet og udelukke snavs. I dette tilfælde brugte vi en transgen linje kaldet Tg(mpo:GFP)52, der udtrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) sammen med enzymet myeloperoxidase, som er til stede i neutrofiler. Vel vidende dette, vores gate strategi var baseret på den første adskillelse af granulocyte befolkning(Figur 6B). Derefter blev dobbeltceller udelukket, da de i væsentlig grad kan ændre analysen og føre til unøjagtige konklusioner. En doublet er en enkelt hændelse, der består af to uafhængige partikler og kan udelukkes ved at vælge en fremadrettet spredningshøjde (FSC-H) vs. et fremadskudt spredningsområde (FSC-A) tæthedsplot (Figur 6C). Efter dette trin blev de celler, der udtrykte lysstofrøret, identificeret og valgt (Figur 6D). Endelig blev befolkningsstatistikkerne udledt af analysen og afbildet i procent af cellerne (figur 6E).
Et af de mest fremtrædende egenskaber ved cisplatin nephrotoxicity er rørcelledød10, og for nemt at visualisere dette brugte vi TUNEL-analysen til apoptosedetektion. Denne metode anbefaler at bruge vilde celler og væv, der mangler fluorescerende markører, da parallel fluorescens ville forstyrre analysen, i tilfælde af zebrafisk anbefales at bruge vilde linjer, såsom AB, Tübingen, TAB, eller en transgen linje med et fluorescerende protein, der ikke forstyrrer TUNEL fluorescensfarven. TUNEL-teknikken gør det muligt at analysere via flowcytometri eller mikroskopi. Mikroskopi har den fordel at bevare vævsstrukturen, så man kan se, hvilke celler der dør. Under det fluorescerende mikroskop kan de lyse kerner af apptotiske celler let skelnes fra baggrunden. Dyr, der injiceres med cisplatin (figur 7B), har flere døde celler end kontrol(figur 7A)ved 24 timer. Den endelige kvantificering blev foretaget med mulighed for celletæller for FIJI-software og viste statistisk flere døde celler i cisplatinbehandlede nyrer end i kontrollerne (figur 7C)
Protokollen beskrevet i dette manuskript viste, hvordan man bruger cisplatin som en inducer af AKI hos voksne zebrafisk, som er dosis-respondent, hurtig og pålidelig. Baseret på data fra overlevelsesrater og måling af tegn på nephrototoksicitet af cisplatin, herunder inflammation (påvist ved flowcytometry) og celledød (påvist ved TUNEL-analyse), foreslår vi denne model til undersøgelse af cisplatin nephrotoxicity samt til fremtidige behandlinger i AKI-relaterede sygdomme.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig01.jpg"> Figur 1:Struktur og sammenligning af zebrafisk og menneskelige nyrer. A. Det er ikke så lidt. (1) Lateral visning af en voksen zebrafisk med nyrerne repræsenteret i mørkebrun placeret i fiskens dorsale væg mellem svømmeblæren (sb) og rygraden. (2) Ventral visning af nyrerne, der viser nephrons (gul) forbundet til opsamlingskanalen (blå). De forskellige regioner i nyrerne er markeret: hoved (H), bagagerum (Tr) og hale (Ta). (3) Skematisk repræsenterer zebrafisk nephrons og deres segmenter mærket og farvet til at matche genetisk bevarede regioner med humane nephron. B. (1) Sagittal visning af en menneskelig nyre. (2) Skematisk skildrer en menneskelig nephron med segmenter mærket og farvet. RC: nyrekorpuskel; PCT: proksimalt indviklet tubule; PST: proksimal lige rør; TL: tyndt lem; LH: Løkke af Henle; TAL: tykt stigende lem; DE: distal tidligt; DL: distal sent; DCT: distal indviklet tubule; CD: opsamlingskanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig02.jpg"> Figur 2: Eksperimentelt design for cisplatin-induceret AKI. A. Det er ikke så lidt. Side- og ventralt syn på voksne zebrafisk, der peger på nålens position under injektionsproceduren. Nålen trænger ind i en 20-30° vinkel fra maven og indsættes langsomt parallelt med ventralvæggen for at undgå at punktere indvoldene. B. Eksperimentelt design af cisplatin-induceret AKI: (1) Injektion af cisplatin 120 μg/g pr. dyr ved dag nul. (2) Før du forsøger trin 3, anbefales overlevelsesovervågning af fisk efter injektion fra dag ét til dag ti. (3) Nyredissektioner en dag efter cisplatinindsprøjtningen med henblik på yderligere behandlingsteknikker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig03.jpg"> Figur 3: Mekanismer for flowcytometri og TUNEL-teknikker. A. Det er ikke så lidt. Oversigt over flowcytometeret: En suspension af celler er hydrodynamisk fokuseret på en enkelt linje af en kappevæske, hvilket får cellerne til at passere en efter en foran en laserstråle. Detektorer foran og på siden måler den forreste spredning (FSC), side scatter (SSC) og fluorescens af cellerne. B. Princippet om TUNEL assay. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) formidler tilsætningen af en fluorescerende-mærket dUTP til 3'-OH ender af et fragmenteret DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig03large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig04.jpg"> Figur 4:Rutediagram over repræsenterede teknikker. A. Det er ikke så lidt. Et rutediagram, der viser de trin, der skal følges, når du vælger at analysere nyrevævet gennem flowcytometry (orange) eller TUNEL (blå), når man fremkalder AKI ved cisplatininjektion (grå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig04large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig05.jpg"> Figur 5:Overvågning af overlevelsen af cisplatin injicerede fisk. A. Det er ikke så lidt. Overlevelsesraten for forskellige doser cisplatininjektioner (25 - 50 - 112,5 - 120 μg/g). Log-rank (Mantel-Cox) test, ** p < 0,01. B. Overlevelsesraten for mænd vs. hunner injiceret med 120 μg/g cisplatin. Log-rank (Mantel-Cox) test, *** p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig05large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig06.jpg"> Figur 6:Gate-strategi for transgene zebrafiskelinje. A. Det er ikke så lidt. Tæthed plot af zebrafisk voksne nyreceller, populationer er adskilt af størrelse (FSC-A) og granularitet (SSC-A). Forskellige populationer vælges af farvede ovaler/cirkler. Pink: Erythroid; Sort: Lymfoid; Gul: Prækursorer; Rød: Granulocytes. B. Tæthedsplot af sideopspejlet område (SSC-A) og fremad scatter område (FSC-A) for udvælgelse af Granulocytes befolkning i nyrerne. C. Tæthedsplot af fremadskudt høj (FSC-H) og fremadgående spredningsområde (FSC-A) for udvælgelse af singletspopulation inde i granulocytporten. D. Det er mig. Tæthedsplot for fremadrettet spredningsområde (FSC-A) og FITC-A:MPO til udvælgelse af mpo:GFP-positive celler (neutrofiler) i nyrerne. En positiv population betragtes som omkring 103 på, af fluorescens intensitet. E. Graf over procentdelen af mpo:GFP positive celler (neutrofiler) i Kontrol vs Cisplatin dyr, 24 hpi . Uparret t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig06large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig07.jpg"> Figur 7: TUNEL-analyse af cisplatinindsprøjtet fisk. A. Det er ikke så lidt. Mikrofotografer af fast voksen nyre 24 timer efter 120 μg/g cisplatininjektion. Kontrol injiceres med 0,9% NaCl. TUNEL-positive celler (apoptotiske celler) farves med røde (hvide pile). DAPI (blå) bruges som en nuklear modvægt. Skalabjælke: 50 μm. 20x forstørrelse. B. Graf, der viser kvantificeringen af antallet af døde celler i nyrerne med 20x felt. Umalet t-test, * p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig07large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transgen linje</td>
			<td>Celletype med navnet</td>
			<td>Referencer</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(spi1:EGFP)pA301</td>
			<td>Myeloidceller</td>
			<td>Menigheden et al. 200348
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gg(zpu1:GFP)</td>
			<td>Myeloidceller</td>
			<td>Hsu et al. 200449
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mhc2dab:GFP)sd6</td>
			<td>Monocytter</td>
			<td>Wittamer et al. 201150</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lysC:DSRED2)</td>
			<td>Neutrofiler</td>
			<td>Hal et al. 200751
</td>
		</tr>
<tr>
<td>GS(mpo:GFP)</td>
			<td>Neutrofiler</td>
			<td>Mathias et al. 200652
</td>
		</tr>
<tr>
<td>GS(mpeg1:mCherry)</td>
			<td>Makrofager</td>
			<td>Ellett et al. 201153
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:Dendra2)</td>
			<td>Makrofager</td>
			<td>Harvie et al. 201354
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lck:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Langenau et al. 200455
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TgBAC(ikaros:EGFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Bajoghli et al. 200956
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag1:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Jessen m.fl. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(klud2:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Jessen et al. 200158
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gg (CD79:GFP)</td>
			<td>B-celler</td>
			<td>Liu et al. 201759
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(CD45:DsRed)</td>
			<td>Leukocytter</td>
			<td>Bertrand et al. 200860
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Zebrafisk transgene linjer for immunceller. Tabel, der genoptager navnene på zebrafisk-reporterlinjer med den respektive type immuncelle mærket og de referenceartikler, hvor de blev konstrueret. En kombination af disse zebrafisk linjer kan tilbyde nye muligheder for celle udvælgelse af flow cytometry.

Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Denne protokol beskriver procedurerne for at fremkalde akut nyreskade (AKI) hos voksne zebrafisk ved hjælp af cisplatin som et nefrotoksisk middel. Vi detaljerede trin til at evaluere reproducerbarheden af teknikken og to teknikker til at analysere inflammation og celledød i henholdsvis nyrevævet, flowcytometri og TUNEL.

Akut nyreskade model induceret af Cisplatin hos voksne zebrafisk

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Det overordnede mål for denne procedure forklares brugen af cisplatin som et nefrotoksisk middel i voksne zebrafisk, analyserer betændelse og celledød i nyrevæv. For at opnå dette og voksne zebra fisk er bedøvet og vejes til at injicere i en bestemt dosis cisplatin i peritoneal hulrum. Efter monitor dødelighed, er nyrerne dissekeret og cellerne er isoleret for flow cytometry eller fast og dissekeret, der skal analyseres ved fluorescerende TUNEL assay.Følgende procedurer kan bidrage til at besvare centrale spørgsmål i nyreområdet ved hjælp af nefrotoksiske virkninger af cisplatin som et redskab til at udvikle en akut nyreskade model og voksne zebra fisk. Denne model kan bruges til udforskning af nye terapeutiske mål i nyrebeskyttelse, samt belyse mekanismen for regenerering i zebrafisk nyre. Cisplatin er en kemoterapi agent, der anvendes til behandling af en række kræftformer.Men kan nemt ophobes i nyrerne, generere celledød, betændelse, og mindske nyrefunktionen. Effekten af cisplatin er dosisafhængig, så du kan sænke vores stigning i dosering afhænger af dine mål. De teknikker, der anvendes her til at analysere inflammation og celledød er ikke udelukkende til spredning af sygdommen model.Flow cytometri i zebrafisk kan bidrage til at belyse dyrets inflammatoriske tilstande på en kvantitativ måde, mens vi hos TUNEL siger, at det kan afklare tilstedeværelsen af poptoserede celler i de fysiologiske og patologiske sammenhænge. Før forsøget påbegyndes, skal cisplatinarbejdsopløsningen fremstilles ved at fortynde stamopløsningen til 820 mikrogram pr. mil i 0,9%natriumchlorid. Dernæst bedøve en anden zebra fisk og tørre ud overskydende vand på nogle papirhåndklæder.Afveje fisken ved at placere dem på en skala, idet der lægges vægt. Foretag beregningerne for at kende den nøjagtige mængde, der skal injiceres. For at opnå dosis på 120 mikrogram pr. Gram vægt skal du bruge den næste formel.Divider den endelige dosis med dosis af arbejdsopløsningen og konverter dette tal til mikroliter ved at multiplicere i 1000 for at få volumenet på 120 mikrogram cisplatin. Derefter multipliceres dette tal med fiskens vægt for at få det endelige volumen, der skal injiceres. Placer en fisk på en våd svamp, med en lille kop til at holde den.Med den ventrale side op og fyld en insulinsprøjte med et beregnet volumen cisplatin. Sæt nålen på den ventrale midterlinje i en lav vinkel, træk forsigtigt ventralvæggen op for at undgå at punktere indre organer. Og derefter injicere opløsningen.Efter injektionen skal du placere en fisk i en tank for at komme sig efter anæstesi og vente på tegn på genopretning, såsom svømning og passende bevægelser. Monitor for at fisk to gange om dagen for de næste dage. Ved denne dosis fremkalder cisplatin omkring 30% af dødeligheden i de første 24 timer.Aflive fisken og tørre ud overskydende vand i et køkkenrulle. Efter at have fjernet hovedet og indre organer, skal du bruge dissektionsnåle til at fastgøre kropsvæggene. Find nyrerne i fiskens dorsale væg, og brug pincet til at løsne nyrerne.Placer nyrerne i en seks brøndplade med en kølig opløsning på en 1X PBS, 2%FBS og hold på is. Derefter afhentes vævet med noget væske og passerer det gennem en 40 mikron celle si, og forsigtigt macerate vævet med en sprøjte stemplet. Vask to gange med en 1X PBS, 2%FBS.Og saml cellerne i et falkerør på 50 mils. Derefter centrifuge i fem minutter ved 400 G.Careful pickup supernatanten med en pipette og kassér den. Tilsæt 500 mikroliter af kold 1X PBS for at suspendere cellerne igen og placere dem i et fem mils flow cytometry rør.Hold dem på is. Tag 10 mikroliter af prøven og bland den med 90 mikroliter trypanblå i et Eppendorf-rør. Tilsæt 10 mikroliter af blandingen til et Neobauer kammer og tæl celler i mikroskopet.Tag cellerne til at blive læst af et cytometer, og derefter analysere resultaterne vælge befolkningen af dine interesser. Til denne procedure aflives en fisk og fjerner indre organer, der forlader nyrerne fastgjort til kroppen. Fastgør derefter karrosserivæggene til en korkoverflade, og placer den udfasning over fikseringsopløsningen.Hold det en fire grader natten over. Næste dag dissekere nyrerne med fin kraft. Prøv ikke at forstyrre det.Placer den i en lille petriskål eller Eppendorf rør med 1X PBS til skylning. Skift PBS og forberede 2%agarose at generere en støtte matrix for nyrerne, før de solidt proces. Kassér alle resterende PBS og hæld agarose langsomt.Placer derefter nyrerne med fine pincet for at forhindre det i at folde. Lad agarose størkne ved stuetemperatur. Efter agarose størkning, bruge en skalpel til at skære Agarose omkring nyrerne danner en lille terninger.Placer agarose terninger inde i en histologisk kassette og sende det til histologisk behandling for at integrere vævet i paraffin. Paraffinblokkene, vi skærer derefter i fem mikron tykkelsessektioner. De-voks dias og holde dem i destilleret vand.Forbered et mørkt inkubatorkammer, læg våde papirhåndklæder i bunden. Placer dias i det mørke kammer, og tilsæt Proteinase K for permeabilization af vævet. Inkuber i 30 minutter ved 37 celsius grad.Mens prøver inkuberes, forberedes TUNEL-reaktionsblandingen ved at tilføje 50 mikroliter enzymopløsning på 450 mikroliter etiketopløsning. Og hold dig beskyttet mod lys. Pick up det mørke kammer og vask skive to gange med en 1X PBS.Tør derefter diasene og på TUNEL-reaktionsblandingen. Og inkuber ved 37 Celsius grad i to timer. Efter inkubation, vask dette dias igen med en 1X PBS.Og tilføj DAPI til nuclei counter farvning. Inkubere ved stuetemperatur i fem minutter, beskyttet mod lys. Skyl tre gange med en 1X PBS.Og derefter forme dias med en anti-fade hydrofile medium. Placer en dækseddel. Og forsegle med neglelak.Visualiser prøverne i et fluorescerende mikroskop. I denne graf er det muligt at se, at cisplatin har en dosisresponseffekt på fiskens overlevelse sammenlignet med en kontrol, der kun injiceres med 0,9% natriumchlorid. Den røde linje i denne graf repræsenterer en dosis på 120 mikrogram pr. gram, der bruges i denne video.Denne dosis kan anvendes på mænd og kvinder, da der ikke blev fundet nogen statistisk forskel mellem dem. Flow cytometry gør det muligt at kvantificere forskellige celler til stede i et væv. Hæmatopoietiske celler populationer er identificeret i flere fisk nyre efter størrelse eller fremad scatter og granularitet eller størrelse scatter.På denne måde er det muligt at adskille populationerne i erythrocytter, lymfocytter, granulocytter og hæmatopoietiske prækursorer. Her giver den nuværende gatestrategi, der vælger granulocytter, singletter og MPO-positive celler, mulighed for at finde populationen af neutrofilerne i nyrerne præget af fluorescensudtrykket af myeloperoxidase. I dette tilfælde fremkaldte injektionen af cisplatin stigningen i procentdelen af neutrofiler, der var til stede i nyrerne.Den TUNEL analyse tillader at opdage apptotiske celler i et væv ved at observere væv dias af nyrerne ved en fluorescens mikroskop, er det muligt at se apptotiske signal inde i kernen af nogle celler, her i rødt. Kontrasteret af en nuklear plet i sådan en DAPI her i blåt. Cisplatin injektion øget tilstedeværelsen af apptotiske celler i nyrerne, som er muligt at kvantificere manuelt eller ved hjælp af et billede software.I slutningen af denne video skal du være i stand til at vide, hvordan man injicerer og justerer dosis af cisplatin for at fremkalde akut nyreskade hos voksne zebrafisk. Og hvordan man dissekerer nyrerne til forskellige formål. Flow cytometry er et fremragende værktøj, der vil hjælpe dig med at forstå profilen af forskellige celletyper afhængig af tilgængeligheden af tragenclave linjer i dit laboratorium.Husk at overveje farven på transportlinjerne, hvis du vil bruge antistof til at mærke alle deres celletyper. TUNEL-analysen er et simpelt værktøj, der giver os mulighed for at opdage apptotisk celle og væv og kan analyseres ikke kun ved mikroskopi, men også ved flowcytometri. Husk altid at bruge personlige værnemidler under hele proceduren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

The Spared Nerve Injury SNI Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Evaluering Teratogene Ændringer i en Zebrafisk Model af Føtalt Alkohol Eksponering

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Iskæmireperfusion Model akut nyreskade og Post Injury Fibrose i mus

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En mulig Zebrafisk Model af polycystisk nyresygdom: Knockdown af<em&gt; Wnt5a</em&gt; Årsager cyster i zebrafisk Nyrer

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis-induceret Focal Iskæmi som en model for Rygmarvsskader i mus

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Lavage-induceret Surfactant Udtømmelse i Svin som en model af den Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åbent Tracheostomituber Gastric Acid Aspiration murin model af akut lungeskade Resultater i Maximal Akut ikke-letale Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...