Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Questa ricerca è stata sostenuta da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), codice finanziario 001. Ringraziamo i nostri collaboratori presso il Laboratorio di Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno e lo Zebrafish Facility del Dipartimento di Genetica e Biologia Evolutiva, presso l'Istituto di Bioscienze dell'Università di San Paolo. Ringraziamo gentilmente Cristiane Naffah de Souza Breda e Theresa Raquel de Oliveira Ramalho per i commenti e i suggerimenti sul manoscritto. Apprezziamo molto e ringraziamo Marcio Villar Martins, del team multimediale dell'Istituto di Scienze Biomediche, per la registrazione, l'edizione e la produzione di questo video.

Le procedure descritte in questo protocollo sono state precedentemente approvate per essere utilizzate nel modello zebrafish dal Comitato Etico per l'Uso Animale dell'Istituto di Scienze Biomediche dell'Università di San Paolo.
1. Induzione AKI per iniezione intraperitoneale cisplatino
<ol><li>Preparare la soluzione di lavoro del cisplatino diluire la soluzione stock a 850 μg/mL nello 0,9% di NaCl. Conservare a temperatura ambiente, protetto dalla luce. ATTENZIONE: Il tessuto raccomanda la manipolazione del cisplatino con dispositivi di protezione individuale (DPI) tra cui occhiali, guanti e camice da laboratorio. Conservare la soluzione stock a temperatura ambiente, protetta dalla luce.</li>
	<li>Preparare 150 mg/L MS-222 (Tricaina) anestetico nell'acqua del sistema45. Anestetizzare il pesce zebra adulto (5-9 mesi) per immersione per circa 1-2 minuti. NOTA: Il pesce anestetizzato efficacemente dovrebbe essere irresponsabile da toccare. Per testare l'anestesia efficace, premere delicatamente la pinna caudale per osservare la reazione. ATTENZIONE: La tricaina è irritante per la pelle e gli occhi, utilizzare i DPI per manipolare.</li>
	<li>L'uso di un cucchiaio di plastica trasferisce il pesce su una superficie assorbente, come gli asciugamani di carta, per rimuovere l'acqua in eccesso intorno al corpo. Quindi, con il cucchiaio di plastica trasferire il pesce in una piastra di Petri su una bilancia e pesare il pesce. Prendere nota del peso del pesce in quanto sarà necessario per il calcolo della dose. NOTA: Assorbire l'acqua in eccesso dai pesci previene la sopravvalutazione del peso dell'animale, non asciugare troppo poiché è pregiudizievole per il pesce.</li>
	<li>Per ottenere la dose finale di 120 μg/g di peso, dividere il μg della dose finale (120 μg) per μg della soluzione di lavoro della cisplatino (850 μg) e convertire questo numero in microlitri (μL) moltiplicandosi per 1000, per ottenere il volume di 120 μg di cisplatino (141,2 μL). Quindi moltiplicare questo numero (141,2 μL) per il peso del pesce (g) per ottenere il volume finale da iniettare.</li>
	<li>Con un cucchiaio di plastica, trasferire il pesce su una spugna bagnata con un piccolo taglio per tenerlo, con il lato ventrale verso l'alto. La spugna deve essere bagnata con anestetico nell'acqua del sistema.</li>
	<li>Riempire una siringa per insulina da 31 G 1,0 ml con il volume calcolato della soluzione di lavoro del cisplatino.</li>
	<li>Inserire l'ago nella porzione intraperitoneale dell'animale vicino alla pinna pelvica, con un angolo poco profondo per evitare di forare i visceri (Figura 2A). Quindi iniettare lentamente la soluzione.</li>
	<li>Dopo l'iniezione mettere il pesce in un serbatoio per riprendersi dall'anestesia. Guarda il pesce per i segni di normale recupero(ad esempio, movimenti di nuoto, movimenti opercolari). NOTA: L'animale dovrebbe riprendersi nei prossimi 3-5 minuti. Se necessario, stimolare il pesce spostandolo con un cucchiaio di plastica, una pipetta di plastica Pasteur o mettendolo vicino a un tubo con bolle.</li>
	<li>Per controllare i pesci, eseguire la stessa procedura iniettando una soluzione dello 0,9% di NaCl. Utilizzare lo stesso calcolo seguendo la proporzione di peso corporeo: il volume da iniettare sarà di 141 μL moltiplicato per il peso del pesce (g).</li>
	<li>Monitorare la sopravvivenza dei pesci almeno due volte al giorno nei giorni successivi(figura 2B).</li>
</ol>2. Isolamento renale e lavorazione dei tessuti per la citometria a flusso delle cellule immunitarie
<ol><li>Per questa procedura, utilizzare animali transgenici marcati fluorescenti con celluleimmunitarie( ad esempio , Tg (mpo:GFP)).</li>
	<li>Dopo 24 hpi da 120 μg/g di cisplatino, eutanasiare gli animali con shock ipotermico (rapido raffreddamento). NOTA: È stato dimostrato che lo shock ipotermico è più efficace come metodo di eutanasia rispetto al sovradosaggio ms-222. Lo shock ipotermico è meno stressante, veloce, coerente e più sicuro per il personale rispetto all'uso di MS-222, ha precedentementedescritto 46,47.</li>
	<li>In un serbatoio di attraversamento esterno preparare l'acqua ghiacciata in un rapporto 5:1 tra ghiaccio e acqua di sistema, mettere il serbatoio interno con uno schermo sopra il ghiaccio, attendere fino a quando l'acqua raggiunge i 2-4 °C. NOTA: I pesci non devono essere a diretto contatto con il ghiaccio, perché ciò può causare ustioni termiche e dolore.</li>
	<li>Trasferire l'animale in acqua ghiacciata, attendere almeno 10 minuti fino a quando non vi è perdita di orientamento e nessun movimento opercolare.</li>
	<li>Con un cucchiaio di plastica, posizionare il pesce sugli asciugamani di carta per asciugare l'acqua in eccesso.</li>
	<li>Trasferire il pesce su una piastra di dissezione di agarosio al 3% e prenderlo sotto uno stereoscopio con la luce superiore. Con le forbici, decapitare i pesci facendo un taglio veloce proprio dietro gli occhi e rimuovere la testa.</li>
	<li>Con le forbici fini fai un taglio dal lato aperto alla cloaca e rimuovi gli organi interni con forcep fini.</li>
	<li>Usa spille per insetti per pizzicare i lati delle pareti del corpo per aprire la carcassa ed esporre il rene attaccato alla spina dorsale.</li>
	<li>Staccare il rene con forcelle fini e posizionare l'organo in una piastra di 6 po pozza con una soluzione fredda di 1x PBS /2% FBS. Tieniti sul ghiaccio.</li>
	<li>Raccogliere il tessuto con una pipetta di plastica Pasteur e passare il tessuto attraverso un colino cellulare di 40 μm su un tubo da 50 ml, macerandolo delicatamente con uno stantuffo per siringhe.</li>
	<li>Lavare due volte con 1 ml di 1x PBS/2% FBS e raccogliere le celle in un tubo da 50 ml.</li>
	<li>Cellule centrifughe a 400 × g per 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Raccogliere con cura tutto il supernatante con una micropipetta da 1 mL e scartarla. Aggiungere 500 μL di PBS freddo 1x per rimossare le cellule e posizionarle in tubi di citometria a flusso di 5 ml. Tieniti sul ghiaccio.</li>
	<li>Contare le cellule nella camera di Neubauer facendo una diluizione 1:10 in Trypan Blue(ad esempio,prendere 10 μL del campione e mescolare con 90 μL di Trypan Blue). Aggiungere 10 μL della miscela a una camera Neubauer e contare le cellule al microscopio. NOTA: Sono attesi risultati ottimali con 1-5 x 106 celle/mL e una >80%. ATTENZIONE: Trypan blue è un agente cancerogeno, utilizzare I DPI per gestire.</li>
	<li>Prendi le cellule per essere lette da un citometro. Quindi analizzare i risultati selezionando la popolazione di interesse.</li>
</ol>3. Lavorazione del tessuto renale zebrafish adulto per il test TUNEL
<ol><li>Per questa procedura, utilizzare animali ditipo selvatico (ad esempio, AB, Tubinga, ecc.) o un animale transgenico con un colore fluorescente diverso dal kit TUNEL, poiché una fluorescenza simile può interferire con l'analisi di TUNEL.</li>
	<li>Dopo 24 hpi da 120 μg/g di cisplatino, eutanasiare gli animali con shock ipotermico (rapido raffreddamento). Cfr. 2.3-2.4.</li>
	<li>Sezionare il pesce come descritto al 2.5-2.6; il rene deve rimanere attaccato alla spina dorsale durante la procedura di fissazione (spiegato di seguito).</li>
	<li>Usando spilli per insetti, pizzicare i lati delle pareti del corpo per aprire la carcassa e fissarla su una superficie di sughero per mantenere esposto il rene. NOTA: Questa procedura garantisce che il rene rimanga nella posizione giusta per un'analisi successiva.</li>
	<li>Quindi posizionare la superficie di sughero con il rene rivolto verso il basso in una piastra di 6 pozza su una soluzione appena fatta di paraformaldeide al 4% (PFA). Tenerlo durante la notte a 4 °C. ATTENZIONE: La PFA è cancerogena e irritante per la pelle e le superfici mucose. Preparare soluzioni PFA sotto una cappa chimica utilizzando DPI, comprese le apparecchiature per la protezione degli occhi.</li>
	<li>Il giorno dopo, sezionare i reni come in 2.8. Mettere i reni in una piastra di Petri da 60 mm con 1x PBS e risciacquare due volte in 1x PBS.</li>
	<li>Preparare il 2% di agarosio per generare una matrice di supporto per il tessuto.</li>
	<li>Scartare tutti i restanti 1x PBS dalla piastra di Petri e versare lentamente il 2% di agarosio per coprire l'intero organo. Quindi posizionare il rene usando forcep fini sotto uno stereomicroscopio per evitare che il rene si pieghi. Lasciare che l'agarosio si solidifichiamo a temperatura ambiente. NOTA: Questa procedura manterrà l'orientamento e la forma dell'organo attraverso l'elaborazione istologica poiché la forma fogliare dell'organo provoca una tendenza a piegarsi se non si trova all'interno di una matrice di supporto.</li>
	<li>Dopo la solidificazione dell'agarosio, utilizzare un bisturi per tagliare l'agarosio attorno al tessuto, formando piccoli cubi e rimuovere l'eccesso di agarosio intorno al tessuto.</li>
	<li>Mettere i cubi di agarosio in una cassetta adatta alla lavorazione istologica. NOTA: I seguenti passaggi possono essere eseguiti manualmente o in un processore automatico di tessuti.</li>
	<li>In primo luogo, elaborare il tessuto nella cassetta seguendo i passaggi successivi per 45 minuti ciascuno a temperatura ambiente: un bagno di etanolo al 50%, un bagno di etanolo al 70%, due bagni consecutivi di etanolo al 95% e tre bagni consecutivi di etanolo al 100%. Successivamente, elaborare il tessuto in due bagni consecutivi di xilene e tre bagni consecutivi di paraffina; quest'ultimo dura 1 ora ciascuno a 60 °C. ATTENZIONE: Apportare modifiche sotto una cappa chimica, i vapori di etanolo e xilene sono irritanti e tossici.</li>
	<li>Per preparare blocchi di paraffina, sciogliere le lenticchie di paraffina a 60 °C.</li>
	<li>Aprire la cassetta di plastica con il tessuto all'interno e tenerlo su una piastra calda. Stampi metallici riscaldanti per la paraffina.</li>
	<li>Con le pinzette posizionare il tessuto su uno stampo metallico in modo che la lunghezza del rene sia parallela alla base dello stampo. Aggiungere la paraffina, riallocare il tessuto se necessario.</li>
	<li>Coprire lo stampo con la base della cassetta e aggiungere la paraffina fino a quando la griglia non è coperta. Lasciare solidificare a temperatura ambiente e quindi posizionare a -20 °C per un processo di solidificazione più veloce.</li>
	<li>Rilasciare il blocco di paraffina dallo stampo metallico circa 20-30 minuti dopo.</li>
	<li>Con un microtomo, sessare il tessuto incorporato nella paraffina a 5 μm di spessore. Utilizzare vetrini silanizzati o caricati positivamente per raccogliere il tessuto.</li>
</ol>4. Saggio TUNEL
NOTA: il seguente protocollo utilizza un kit di rilevamento della morte cellulare in situ (tabella dei materiali).
<ol><li>Dewax scivola i tessuti posizionandoli in due bagni consecutivi di xilene per 5 minuti. Quindi reidratare il tessuto attraverso una serie graduata di etanolo: 100%-95%-70%-50%, per 5 min ciascuno.</li>
	<li>Posizionare gli scivoli nell'acqua corrente del rubinetto freddo per risciacquare l'etanolo. Tenere gli scivoli in acqua distillata.</li>
	<li>Preparare una camera di incubazione scura. Aggiungere asciugamani di carta bagnati sul fondo per mantenere l'umidità durante le fasi di incubazione. NOTA: In mancanza di una camera dell'incubatrice è possibile utilizzare una piastra di Petri con carta umida nella parte inferiore e due stuzzicadenti per posizionare lo scivolo.</li>
	<li>Preparare la soluzione di lavoro fresco proteinasi K:10 μg/mL in Tris/HCl da 10 mM, pH 7,4-8. NOTA: La proteinasi K viene utilizzata come agente permeabilizzazione, come raccomandato dal fabbricante.</li>
	<li>Posizionare le diapositive nella camera dell'incubatore scuro e aggiungere la soluzione di lavoro Proteinase K fino a coprire i campioni. Incubare per 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Durante l'incubazione dei campioni, preparare la miscela di reazione TUNEL: Aggiungere 50 μL di soluzione enzimatica a soluzione di etichetta da 450 μL. Proteggere dalla luce. NOTA: Il volume da preparare può essere regolato nella stessa proporzione 1:10. Il volume è calcolato in 50 μL della miscela per ogni sezione; questo può cambiare a seconda delle dimensioni dei campioni.</li>
	<li>Raccogliere la camera scura e lavare gli scivoli due volte con 1x PBS.</li>
	<li>Successivamente, asciugare la regione intorno al campione utilizzando carta assorbente e aggiungere 50 μL di miscela di reazione TUNEL su ogni diapositiva tissutale, stendere la soluzione in modo che l'intero campione sia coperto. Incubare a 37 °C per 2 ore. Proteggere dalla luce.</li>
	<li>Dopo l'incubazione, sciacquare lo scivolo tre volte con 1x PBS e asciugare la regione intorno al campione utilizzando tovaglioli di carta.</li>
	<li>Aggiungere 50 μL di DAPI 1:1000 ai campioni, per la controsottenimento nucleare, e incubare per 5 minuti a temperatura ambiente. Proteggere dalla luce.</li>
	<li>Risciacquare di nuovo tre volte con 1x PBS e asciugare la regione intorno al campione.</li>
	<li>Montare lo scivolo con un mezzo idrofilo anti-dissolvenza, posizionare un coverslip e sigillare con smalto per unghie. Conservare le diapositive orizzontalmente, protette dalla luce a 4 °C. NOTA: Le proprietà anti-dissolvenza del mezzo di montaggio sono di preservare la fluorescenza dei campioni ma è possibile utilizzare qualsiasi mezzo idrofilo disponibile. La fase finale di tenuta con smalto per unghie è fondamentale per evitare la disidratazione.</li>
	<li>Visualizzare i campioni al microscopio a fluorescenza. Per questo tipo di pigmento fluorescente, utilizzare una lunghezza d'onda di eccitazione nell'intervallo di 520-560 nm (verde) e il rilevamento nell'intervallo di 570-620 nm (rosso).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La prevalenza della malattia renale ha continuato ad aumentare in tutto il mondo, diventando un problema globale di salute pubblica che colpisce milioni dipersone 63. Trovare un modo per trattare gli individui feriti renali è di fondamentale importanza e capire di più sulla loro eziologia e progressione. Diversi studi hanno utilizzato modelli animali per comprendere i danni renali. Il rene zebrafish (Figura 1) è stato studiato per anni nella biologia dello sviluppo e nella ricerca sulle lesioni a causa delle sue capacità autogeneranti e della somiglianza genetica29,64. Qui presentiamo un nuovo modello AKI in zebrafish adulto utilizzando le proprietà del cisplatino come agente nefrotossico, dettagliando i passaggi per realizzare una reazione rapida e acuta con danni visibili già da 24 hpi(Figura 2). Inoltre, qui spieghiamo due tecniche che aiuteranno alla valutazione del danno tissutale dopo l'iniezione di cisplatino, la citometria del flusso e il TUNEL(Figura 3).
Gli attuali modelli AKI nel pesce zebra adulto includono l'iniezione di i.p. di gentamicina che induce danni estesi nella distruzione del nefrone e dei tubuli, gli eventi di neonefrogenesi iniziano dal giorno 5 e la rigenerazione viene completata entro 21 giorni dopol'iniezione 65. D'altra parte, un modello di lesione renale acuta associata alla sepsi (S-AKI) è stato stabilito dall'infezione da Edwardsiella tarda, poiché ha aumentato significativamente l'espressione dei marcatori AKI, come la proteina legante il fattore di crescita insulino-simile-7 (IGFBP7), l'inibitore tissutale delle metalloproteinasi 2 (TIMP-2) e la molecola di lesione renale-1 (KIM-1), nelle larve e nel pesce zebra adulto66. Il pesce zebra è noto per essere un animale ad alta produttività per la ricerca di agenti terapeutici e questo include l'uso di probiotici e metaboliti derivati dal microbiota per studiare la funzione renale e larigenerazione 67. Tuttavia, i modelli disponibili potrebbero influenzare direttamente l'esito di questi trattamenti. Pertanto, abbiamo stabilito un metodo diverso per indurre l'AKI nel pesce zebra adulto (Figura 4), usando il cisplatino come agente nefrotossico noto che non avrebbe effetti diretti noti sul microbiota del pesce, così come il modello di gentamicina per essere un antibiotico, o l'infezione da E. tarda, per essere un modello di sepsi. Tuttavia, nello stesso momento in cui stavamo sviluppando il nostro protocollo cisplatino, un altro gruppo ha anche esplorato gli effetti nefrotossici del cisplatino nel pesce zebra adulto, semplificando la dose a 10-20-30 μg per animale68. Sebbene abbiano anche mostrato un effetto dose-dipendente dal cisplatino nella sopravvivenza, si consiglia cautela nell'utilizzare una singola quantità di cisplatino per tutti i pesci, poiché i pesci zebra della stessa età possono avere dimensioni e peso molto diversi e questo potrebbe indurre variazioni neirisultati 69,70. Pensiamo che sia importante regolare la dose al peso corrispondente dell'animale, come viene fatto nei topi e in questo studio.
Nei nostri esperimenti con il pesce zebra adulto, il cisplatino ha mostrato un effetto dose-risposta. Ciò è stato visualizzato monitorando il tasso di sopravvivenza degli animali dopo l'iniezione di cisplatino(figura 5). Abbiamo usato la sopravvivenza come un modo per stimare l'intensità della dose di cisplatino e non come misura di nefrotossicità, poiché nessun altro segno fisico è visibile durante il tempo di monitoraggio. Questo può essere paragonabile ai roditori, in cui la gravità della lesione renale può essere modulata dal dosaggio e dalla frequenza dell'iniezione di cisplatino15, ottenendo dosi letali con concentrazioni più elevate di cisplatino71. Morto è anche visto nei giorni successivi nel modello larvale del cisplatino72. Poiché il nostro obiettivo era quello di indurre una lesione acuta in pochi giorni, abbiamo selezionato la dose di 120 μg / g di cisplatino come è possibile osservare il danno renale 24 ore dopo l'iniezione, tuttavia, questo può essere regolato in base agli obiettivi dello studio.
Nell'uomo, l'AKI è clinicamente diagnosticato da una diminuzione del tasso di filtrazione glomerulare (GFR), dell'elevata creatinina sierica e dell'azoto ureanel sangue 3. Nel pesce zebra, il repertorio dei modelli AKI comprende alcuni modelli genetico-condizionali73,74 e alcuni modelli correlati ai farmaci65,72, ma poiché alcuni dei parametri funzionali AKI non possono essere misurati su zebrafish a causa di difficoltà tecniche(ad esempio, raccolta del sangue), la maggior parte delle ricerche adotta tecniche morfologiche e visive per osservare le caratteristiche di AKI1,75 come il nostro studio.
Nei roditori, il cisplatino entra nelle cellule epiteliali nei tubuli prossimali e distali, all'interno della cellula subisce l'attivazione metabolica e diventa altamente reattivo agendo sugli organelli cellulari e inducendo cambiamenti nella struttura cellulare. Questi cambiamenti possono indurre apoptosi e autofagia e persino necrosi, a dosi molto elevate. In risposta a questo danno, molte citochine vengono rilasciate e i leucociti vengono reclutati portando all'infiammazione e influenzando la funzionalità dell'organo15. Ciò evidenzia l'importanza di valutare quale tipo di cellule può essere trovato nel rene ferito, come residenti o cellule immunitarie infiltrate. Qui abbiamo mostrato come valutarlo per citometria del flusso, utilizzando le linee di reporter immunitario transgenico oggi disponibili(Tabella 1). La cisplatino ha aumentato la percentuale di neutrofili(cellule positive mpo:GFP) nel rene 24 ore dopo l'iniezione(Figura 6). Nel caso del pesce zebra, il rene è la nicchia degli HSC che danno origine a diversi tipi di cellule del sangue. Tuttavia, molti granulociti e macrofagi circolano normalmente nel sangue. Nel nostro esempio, abbiamo usato la linea transgenica mpo:GFP che esprime GFP sotto il promotore della mieloperossidasi dei neutrofili52. Studi originali della linea transgenica mpo:GFP hanno dimostrato l'espressione della mieloperossidasi in diversi stati di maturazione neutrofila76, ma la nostra strategia di gate si è concentrata sulla frazione granulocita che comprende cellule matureprovenienti dal sangue 52, in questo modo la nostra analisi include cellule infiltrate e non cellule residenti. Questo è importante da considerare quando si isola la popolazione cellulare desiderata.
Come spiegato sopra, l'apoptosi è il marcatore più classico dell'AKI correlato al cisplatino. Qui, abbiamo dimostrato un semplice protocollo per la localizzazione delle cellule morte tramite il saggio TUNEL. L'iniezione di cisplatino ha aumentato il numero di cellule apoptotiche 24 hpi (Figura 7). Questo può essere facilmente quantificato contando direttamente le cellule morte dal tessuto. Tuttavia, per l'identificazione della morte specifica della cellula, l'uso di anticorpi contro la cellula desiderata(ad esempio, cellule tubolari) o l'uso di una linea di reporter transgenica può essere utilizzato insieme a questa tecnica. Rispetto al modello indotto dalla gentamicina dell'AKI, il cisplatino sembra essere un modello più severo, poiché l'apoptosi della gentamicina era più alta il terzo giorno dopol'iniezione 65.
Nonostante abbia una varietà di effetti collaterali, il cisplatino è ancora ampiamente utilizzato nella terapia del cancro, a causa della sua efficacia contro vari tipi di tumori, tra cui carcinomi, tumori delle cellule germinali, linfomi e sarcomi77. La nefrotossicità si verifica in un terzo dei pazienti in trattamento con cisplatino10, quindi è imperativa la ricerca di strategie in grado di ridurre questo effetto e aumentare la riprotezione. Crediamo che i metodi e le tecniche presentati in questo manoscritto aiuteranno a chiarire i meccanismi della lesione renale e a trovare obiettivi terapeutici che possano essere essenziali per migliorare la qualità della vita degli individui che soffrono di complicazioni renali, principalmente quelle legate all'uso del cisplatino.

I reni sono responsabili di diverse importanti funzioni fisiologiche che mantengono l'omeostasi, come la filtrazione del sangue, la rimozione dei residui in eccesso e la regolazione delle concentrazioni diioni 1. Il danno del tessuto renale può portare a una condizione eterogenea chiamata lesione renale acuta (AKI), che clinicamente è descritta come una rapida diminuzione della funzione renale causata dalla distruzione e dalla morte di cellule epiteliali tubolari, lesioni cellulari endoteliali e infiltrazione di leucociti 2,3. L'AKI è una condizione che si prevede si verifica nell'8-16% dei ricoveriospedalieri 4, con un alto tasso di mortalità che varia dal 20 al 50% nell'unità di terapia intensiva (TERAPIA INTENSIVA)5. Questo disturbo è associato all'aumento della dea stay ospedaliera e all'uso considerevole delle risorsefinanziarie 5. I fattori eziologici includono disidratazione, shock, infezioni, sepsi, malattie cardiovascolari e farmaci nefrotossici6. La nefrotossicità è definita come una lesione renale indotta da farmaci, che causa effetti come AKI, tubulopatie e glomerulopatie7. La nefrotossicità colpisce i due terzi dei pazienti in terapia intensiva, poiché circa il 20% dei farmaci prescritti in terapia intensiva sono considerati nefrotossici8,9, questo include farmaci antinfiammatori non steroidei (FANS), antibiotici come vancomicina e amminoglicosidi e agenti chemioterapici come metotrexato e cisplatino7. Il cisplatino è uno dei farmaci chemioterapici più potenti e comuni, utilizzato nel trattamento di tumori solidi, come testa e collo, testicolare, ovarico e vescica10. Nel rene, il cisplatino viene interiorizzato nel tubo contorto prossimale (PCT) attraverso il trasportatore cationico organico 2 (OCT-2) e in alte concentrazioni si lega alle vie di morte cellulare innescanti del DNA7,10,11,12. L'accumulo di questo farmaco nel rene contribuisce alla nefrotossicità con morte einfiammazione 13. Questo effetto collaterale dannoso colpisce enormemente la vita e la prognosi di un terzo dei pazienti oncologici sottoposti a trattamento con cisplatino, quindi è imperativa la ricerca di nuove terapie che possono abbassare la nefrotossicità senza perdere l'effetto di uccisione sulle celluletumorali 10.
A causa di questo effetto nefrotossico, il cisplatino è comunemente usato come induttore di AKI nei modelli animali sperimentali, come descritto in avanti. Nei roditori, il primo modello AKI indotto dal cisplatino è stato riportato nel 197114, ma attualmente sono emersi molti protocolli diversi utilizzando gli effetti dose-dipendenti e cumulativi del cisplatino15. In tal modo, a seconda del dosaggio e del numero di applicazioni, diversi gradi di gravità della lesione renale possono essere indotti16,17,18,19,20,21. Il metodo più frequente consiste in un'iniezione intraperitoneale (i.p.) di una dose di cisplatino seguita dall'eutanasia nei giorni successivi. In questo protocollo classico, una singola dose nefrotossica elevata di cisplatino (10-13 mg/kg nei topi e/o 3-8 mg/kg nei ratti) induce gravi cambiamenti istologici, come la perdita del bordo della spazzola e dei detriti cellulari all'interno del lume tubolare, pochi giorni dopo l'iniezione di cisplatino. La gravità dei cambiamenti istologici dipende dalla dose e i segni di rigenerazione si osservano 7 giorni dopo l'iniezione di cisplatino16,17.
Sebbene i modelli di roditori siano ben consolidati, abbiamo deciso di sfruttare le caratteristiche di un altro vertebrato, concentrando i nostri studi sul pesce zebra(Danio rerio). Questo pesce è stato ampiamente utilizzato per modellare le malattie umane, a causa delle sue piccole dimensioni, fertilizzazione esterna, alti tassi di riproduzione, rapido sviluppo, trasparenza degli embrioni e delle larve, basso costo di manutenzione, anatomia simile ai mammiferi (con alcune eccezioni), elevata capacità di rigenerazione dei tessuti, comportamento sociale, 70% di somiglianza genetica con l'uomo e 84% con geni associati alle malattie umane22. 23,24,25hannoavviato glistudi con zebrafish che hanno confermato la praticabilità dell'utilizzo di questo organismo modello per l'analisi genetica dello sviluppo dei vertebrati. Nella ricerca sui reni, il pesce zebra è emerso non solo negli studi di sviluppo, ma anche come strumento genetico nella ricerca di nuovi geni legati alle condizioni renali26. Inoltre, la capacità di rigenerazione senza formazione di cicatrici e la capacità di generare nefroni attraverso la loro vita, chiamata neonefrogenesi, rendono il pesce zebra un modello animale chiave per la ricerca sullarigenerazione 27,28. Inoltre, la disponibilità di modelli sperimentali per diverse malattie renali, tra cui lesioni renali acute e croniche, dimostra laversatilità di questo organismo sperimentale 26,29. Come nei mammiferi, i progenitori renali del pesce zebra derivano dal mesoderma intermedio. Tali progenitori renali generano i pronephros che in seguito si svilupperanno ai mesonephros, che saranno mantenuti come organo maturo fino all'etàadulta 29,30.
Il rene zebrafish adulto si trova sulla parete dorsale del corpo, tra la vescica di nuoto e la spina dorsale29. Da una vista ventrale, il pesce zebra può essere segmentato in tre regioni(figura 1A):testa (H), tronco (Tr) e coda (Ta)29. Come i mammiferi, il pesce zebra ha i nefrroni come unità funzionali del rene, che sono divisi in segmenti di tubuli(Figura 1A):corpuscolo renale (RC), tubulo contorto prossimale (PCT), tubulo dritto prossimale (PST), distale precoce (DE), distale tardivo (DL) e condotto di raccolta (CD)29. Zebrafish condivide la conservazione genetica e le somiglianze strutturali con i nefroni umani(Figura 1B)ma manca di alcune conformazioni come il tubulo intermedio, noto anche come anello di Henle (LH)29,31. I pesci d'acqua dolce come il pesce zebra sono normalmente circondati da un mezzo con osmolarità molto bassa, per questo motivo, tendono ad essere iperosmotici e dipendono dalle branchie, dalla pelle nelle prime fasi e dal rene per regolare l'osmolarità e l'escrezioned'acqua 32. La filtrazione del sangue dall'aorta dorsale da parte del pronephros inizia intorno alle 48 h di post-fecondazione (hpf)33,34. Il rene del pesce zebra non è solo un organo di escrezione di scarto metabolico, ma funziona anche come organo ematopoietico da 4 giorni dopo la fecondazione (dpf) all'età adulta ed è equivalente al midollo osseo nei mammiferi35. Durante lo sviluppo, le cellule staminali ematopoietiche (HSC) sedurranno il rene, si autorinovano e genereranno lignaggi mieloidi, erioidi e cellule linfoidi, mantenendo fattori di trascrizione, molecole di segnalazione e programmi genetici altamente conservati con mammiferi36,37. Gli studi hanno rivelato che la maggior parte delle cellule eriteroidi, trombocitiche, mieloidi e linfoidi del sistema immunitario umano sono presenti nel zebrafish37,38. Le caratteristiche uniche di questo animale e le caratteristiche conservate con il rene umano hanno reso questo organismo modello vantaggioso nella ricerca della funzione renale, della lesione e della rigenerazione.
Sebbene il rene del pesce zebra sia ben studiato e alcuni modelli di AKI siano già disponibili in larva e zebrafishadulto 28, al momento della definizione di questo protocollo non c'erano prove di un modello AKI non antibiotico indotto chimicamente nel pesce zebra adulto. Oltre a questo, il nostro laboratorio si concentra sul test di batteri probiotici e composti derivati dal microbiota per studiare la rigenerazione e i danni renali, quindi abbiamo concentrato i nostri sforzi nella creazione di un nuovo modello AKI indotto dal cisplatino nei pesci adulti. L'articolo video presentato in questo manoscritto illustra le procedure per un nuovo modello di induzione AKI utilizzando un'iniezione i.p. di 120 ug cisplatino per g di animale (120 μg/g)(Figura 2A). Questa dose è stata inizialmente basata su studi di AKI indotti dal cisplatino in modelli murini che sono andati intorno a 10 mg /kg (equivalenti a 10 μg/g)14,15,16,17, tuttavia, questa dose non è stata sufficiente a indurre danni renali legati alla nefrotossicità (dati non mostrati). Pertanto, abbiamo aumentato la dose a quelle utilizzate in questo studio(figura 2B). Il nostro lavoro ha rivelato un effetto dose-dipendente del cisplatino nel tasso di sopravvivenza dopo iniezione con induzione di danni al tessuto renale 24 hpi come dimostrato dalla perdita della struttura tubolare, aumento dell'infiltrato infiammatorio e alto tasso di morte cellulare. Qui descriviamo due tecniche per analizzare lo sviluppo dell'AKI indotta da cisplatino: citometria del flusso, per analizzare l'infiltrazione cellulare, e TUNEL, per misurare la morte cellulare. La citometria a flusso è una tecnologia che misura le caratteristiche fisiche (dimensioni e granularità) e chimiche (composti fluorescenti) delle cellule. All'interno del citometro la sospensione cellulare attraversa un fluido di fasci che organizza le cellule in un'unica linea, permettendo loro di passare attraverso un raggio laser una cella alla volta (Figura 3A). Un rivelatore davanti al fascio di luce misurerà lo Scatter in avanti (FSC), che è correlato con la dimensione della cella, e i rivelatori a lato misureranno lo Scatter laterale (SSC) correlato alla granularità delle cellule. Altri rivelatori misureranno la fluorescenza da particelle, proteine fluorescenti o cellule etichettate con anticorpi39,40. Poiché gli anticorpi commerciali per il pesce zebra sono scarsi al giorno d'oggi, l'uso di reporter animali e biomarcatori fluorescenti consente di migliorare questa analisi e identificare diversepopolazioni cellulari 41,42,43. Un altro strumento utilizzato in questo protocollo era il test TdT (Terminal deoxynucleotidyl transferasi) dUTP Nick End Labeling (TUNEL). Il saggio TUNEL è un metodo di rilevamento dell'apoptosi in fase avanzata che si basa sulla capacità del TdT di identificare il DNA frammentato ed etichettarlo con deossinucleotidi contrassegnati con un marcatore fluorescente che in seguito può essere visualizzato e quantificato mediante microscopia44 (Figura 3B). Considerando che una delle caratteristiche più sorprendenti dell'AKI è l'induzione dell'apoptosi nelle cellule renalitubolari 3, questa tecnica è estremamente vantaggiosa poiché può essere analizzata dalla citometria del flusso e / o dalla microscopia.
Gli approcci presentati in questo articolo consentono l'osservazione dello stato AKI e offrono un nuovo modello acuto per studiare i disturbi AKI che possono essere utili per la ricerca di nuovi obiettivi terapeutici nell'AKI correlato al cisplatino.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

Il cisplatino è comunemente usato come chemioterapia. Sebbene abbia effetti positivi negli individui trattati con cancro, il cisplatino può facilmente accumularsi nel rene a causa del suo basso peso molecolare. Tale accumulo causa la morte delle cellule tubolari e può indurre lo sviluppo di lesioni renali acute (AKI), che è caratterizzata da una rapida diminuzione della funzione renale, danni ai tessuti e infiltrazioni delle cellule immunitarie. Se somministrato in dosi specifiche cisplatino può essere uno strumento utile come induttore AKI nei modelli animali. Il pesce zebra è apparso come un modello interessante per studiare la funzione renale, la rigenerazione renale e le lesioni, poiché le strutture renali conservano somiglianze funzionali con i mammiferi. Il pesce zebra adulto iniettato con cisplatino mostra una diminuzione della sopravvivenza, la morte delle cellule renali e un aumento dei marcatori di infiammazione dopo 24 ore dopo l'iniezione (hpi). In questo modello, l'infiltrazione delle cellule immunitarie e la morte cellulare possono essere valutate dalla citometria del flusso e dal test TUNEL. Questo protocollo descrive le procedure per indurre l'AKI nel pesce zebra adulto mediante iniezione intraperitoneale di cisplatino e successivamente dimostra come raccogliere il tessuto renale per la lavorazione della citometria a flusso e il test TUNEL di morte cellulare. Queste tecniche saranno utili per comprendere gli effetti del cisplatino come agente nefrotossico e contribuiranno all'espansione dei modelli AKI nel pesce zebra adulto. Questo modello può anche essere utilizzato per studiare la rigenerazione renale, nella ricerca di composti che trattano o prevengono danni renali e per studiare l'infiammazione nell'AKI. Inoltre, i metodi utilizzati in questo protocollo miglioreranno la caratterizzazione dei danni ai tessuti e dell'infiammazione, che sono obiettivi terapeutici nelle comorbidità associate ai reni.

Il rene del pesce zebra è un organo pigmentato piatto situato sulla parete dorsale e la sua unità funzionale di base, il nefrrone, è conservata con mammiferi (Figura 1). La particolarità di avere un solo rene con un'alta capacità di rigenerazione rende questo organismo modello una scelta eccellente per la lesione renale modello. I protocolli presentati in questo lavoro sono progettati per indurre l'AKI mediante iniezione intraperitoneale (i.p.) di cisplatino nel pesce zebra adulto (Figura 2) e per essere successivamente analizzati con due tecniche dettagliate prima: citometria a flusso (Figura 3A) e TUNEL(Figura 3B). Un diagramma di flusso dell'intero processo è illustrato nella figura 4. Le dosi di cisplatino sono state applicate inizialmente sulla base di quelle descritte nei modelli di topo15,16,17, in cui la norma utilizzata è di 10-13 mg di cisplatino per kg di animale (mg/kg). Tuttavia, il pesce zebra ha dimostrato di essere più resistente al cisplatino rispetto al topo (dati non mostrati) e la dose finale è stata aumentata. Quando abbiamo valutato il tasso di sopravvivenza degli animali, gli esperimenti hanno mostrato un effetto dose-dipendente del cisplatino(figura 5A). Per questo motivo, si consiglia di seguire le istruzioni esattamente come spiegato in questo protocollo e monitorare costantemente il tasso di sopravvivenza degli animali come misura di riproducibilità, prima di raccogliere qualsiasi materiale. Dopo l'iniezione di i.p. di 120 μg/g cisplatino(figura 5A,linea rossa),è stata osservata una diminuzione della sopravvivenza di circa il 30% degli animali nelle prime 24 ore e la sopravvivenza è diminuita gradualmente fino a raggiungere circa il 20% degli animali vivi il giorno 5 dopo l'iniezione, poi stabilizzata(figura 5A). La tossicità del cisplatino non è stata influenzata dal sesso degli animali, poiché maschi e femmine hanno curve di sopravvivenza simili (figura 5B).
L'analisi della cinetica dell'AKI indotta da cisplatino ha mostrato un aumento dell'infiammazione e della morte cellulare nel rene 24 hpi. Uno dei modi più veloci e quantitativi per valutare l'infiammazione è la citometria del flusso, ma data la mancanza di anticorpi contro gli antigeni zebrafish disponibili commercialmente per questa tecnica, è necessario utilizzare una linea transgenica con un marcatore immunitario. Al giorno d'oggi, molte linee di zebrafish che etichettano le cellule immunitarie sono accessibili(Tabella 1). Queste linee possono essere utilizzate singolarmente o in combinazione, dato abbastanza repertorio perl'analisi 48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Questo semplifica enormemente la tecnica poiché non è necessaria alcuna fase di incubazione degli anticorpi, al contrario, dopo l'isolamento delle cellule per separazione meccanica, è possibile la lettura diretta sul citometro.
Come accennato in precedenza, il rene del pesce zebra non è solo un organo di filtrazione del sangue con funzioni omeostatiche, ma anche il sito anatomico dell'ematopoiesi negli adulti, equivalente al midollo osseo nei mammiferi33,34,35. In questo modo, quando lo analizziamo per citometria a flusso è possibile differenziare le popolazioni cellulari paragonabili alsangue umano 61,62 (Figura 6A), questo ci consente di identificare le popolazioni cellulari inizialmente per dimensioni e granularità ed escludere i detriti. In questo caso, abbiamo usato una linea transgenica chiamata Tg(mpo:GFP)52 che esprime una proteina fluorescente verde (GFP) insieme all'enzima mieloperossidasi, che è presente nei neutrofili. Sapendo questo, la nostra strategia di gate si basava sulla separazione iniziale della popolazione del granulocita (Figura 6B). In seguito, le cellule a farsa sono state escluse, poiché possono alterare significativamente l'analisi e portare a conclusioni imprecise. Un farsato è un singolo evento costituito da 2 particelle indipendenti e può essere escluso selezionando un plot di densità FSC-H (Forward Scatter Height) rispetto a un plottaggio di densità FSC-A (Forward Scatter Area) (Figura 6C) . Dopo questo passaggio, le celle che hanno espresso il marcatore fluorescente sono state identificate e selezionate (Figura 6D). Infine, le statistiche sulla popolazione sono state estratte dall'analisi e tracciate in percentuale delle cellule (figura 6E).
Una delle caratteristiche più importanti della nefrotossicità del cisplatino è la morte cellulare tubolare10e per visualizzarlo facilmente abbiamo usato il saggio TUNEL per il rilevamento dell'apoptosi. Questo metodo raccomanda di utilizzare cellule e tessuti di tipo selvatico privi di marcatori fluorescenti, poiché la fluorescenza parallela interferirebbe con l'analisi, nel caso del pesce zebra si consiglia di utilizzare linee di tipo selvatico, come AB, Tubinga, TAB o una linea transgenica con una proteina fluorescente che non interferisce con il colore di fluorescenza TUNEL. La tecnica TUNEL consente l'analisi tramite citometria a flusso o microscopia. La microscopia ha il vantaggio di conservare la struttura tissutale, permettendo di vedere quali cellule stanno morendo. Al microscopio fluorescente, i nuclei luminosi delle cellule apoptotiche possono essere facilmente differenziati dallo sfondo. Gli animali iniettati di cisplatino (Figura 7B) hanno più cellule morte del controllo (figura 7A) a 24 hpi. La quantificazione finale è stata effettuata con l'opzione del contatore cellulare di FIJI Software e ha mostrato statisticamente più cellule morte nei reni trattati con cisplatino che nei controlli(figura 7C)
Il protocollo descritto in questo manoscritto ha mostrato come usare il cisplatino come induttore di AKI nel pesce zebra adulto, che è dose-intervistato, veloce e affidabile. Sulla base dei dati ottenuti dai tassi di sopravvivenza e dalla misurazione dei segni di nefrotossicità del cisplatino tra cui infiammazione (rilevata dalla citometria del flusso) e morte cellulare (rilevata dal saggio TUNEL), proponiamo questo modello per lo studio della nefrotossicità della cisplatino e per i futuri trattamenti nelle malattie correlate all'AKI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig01.jpg"> Figura 1: Struttura e confronto del pesce zebra e dei reni umani. A. La commissione per l'a (1) Vista laterale di un pesce zebra adulto con il rene rappresentato in marrone scuro situato nella parete dorsale del pesce, tra la vescica di nuoto (sb) e la spina dorsale. (2) Vista ventrale del rene che mostra nefroni (giallo) collegati al condotto di raccolta (blu). Le diverse regioni del rene sono contrassegnate: testa (H), tronco (Tr) e coda (Ta). (3) Schema che rappresenta i nefroni zebrafish e i loro segmenti etichettati e colorati per abbinare le regioni geneticamente conservate al nefrone umano. B. (1) Vista sagittale di un rene umano. (2) Schema raffigurante un nefro umano con segmenti etichettati e colorati. RC: corpuscolo renale; PCT: tubulo contorto prossimale; PST: tubulo rettilineo prossimale; TL: arto sottile; LH: Loop of Henle; TAL: arto ascendente spesso; DE: distale precoce; DL: distale tardivo; DCT: tubulo contorto distale; CD: condotto di raccolta. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig02.jpg"> Figura 2: Progettazione sperimentale dell'AKI indotta da cisplatino. A. La commissione per l'a Vista laterale e ventrale del pesce zebra adulto che punta la posizione dell'ago durante la procedura di iniezione. L'ago penetra con un angolo di 20-30° dalla pancia e viene inserito lentamente parallelo alla parete ventrale evitando di forare i visceri. B. La commissione per l' Progettazione sperimentale dell'AKI indotta da cisplatino: (1) Iniezione di cisplatino 120 μg/g per animale al giorno zero. (2) Prima di tentare la fase 3, si raccomanda il monitoraggio della sopravvivenza dei pesci dopo iniezione dal primo al primo giorno. (3) Dissezioni renali un giorno dopo l'iniezione di cisplatino per ulteriori tecniche di lavorazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig03.jpg"> Figura 3: Meccanismi della citometria del flusso e tecniche TUNEL. A. La commissione per l'a Panoramica del citometro di flusso: una sospensione delle cellule è idrodinamicamente focalizzata su una singola linea da un fluido di sheath, facendo passare le cellule una per una davanti a un raggio laser. I rivelatori davanti e sul lato misurano la dispersione in avanti (FSC), la dispersione laterale (SSC) e la fluorescenza delle cellule. B. La commissione per l' Principio del saggio TUNEL. La deossinucleotidil transferasi terminale (TdT) media l'aggiunta di un dUTP marcato fluorescente alle estremità 3'-OH di un DNA frammentato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig04.jpg"> Figura 4: Diagramma di flusso delle tecniche rappresentate. A. La commissione per l'a Diagramma di flusso che mostra i passaggi da seguire quando si sceglie di analizzare il tessuto renale attraverso la citometria del flusso (arancione) o TUNEL (blu), quando si induce AKI per iniezione di cisplatino (grigio). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig05.jpg"> Figura 5: Controllo di sopravvivenza dei pesci iniettati di cisplatino. A. La commissione per l'a Tasso di sopravvivenza di diversi dosaggi di iniezioni di cisplatino (25 - 50 - 112,5 - 120 μg / g). Test di log-rank (Mantel-Cox), ** p < 0.01. B. La commissione per l' Tasso di sopravvivenza dei maschi rispetto alle femmine iniettate con 120 μg/g di cisplatino. Test di log-rank (Mantel-Cox), *** p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig05large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig06.jpg"> Figura 6: Strategia gate per la linea transgenica di zebrafish. A. La commissione per l'a Grafico di densità delle cellule renali adulte di zebrafish, le popolazioni sono separate per dimensioni (FSC-A) e granularità (SSC-A). Diverse popolazioni sono selezionate da ovali/cerchi colorati. Rosa: Erythroid; Nero: Linfoide; Giallo: Precursori; Rosso: Granulociti. B. La commissione per l' Grafico di densità dell'area di dispersione laterale (SSC-A) e dell'area di dispersione in avanti (FSC-A) per la selezione della popolazione di Granulociti nel rene. C. La commissione per l' Grafico di densità di dispersione in avanti alta (FSC-H) e area di dispersione in avanti (FSC-A) per la selezione della popolazione di singoletti all'interno della porta granulocitaria. D. La commissione per l' Grafico di densità dell'area di dispersione in avanti (FSC-A) e FITC-A:MPO per la selezione di cellule positive mpo:GFP (neutrofili) nel rene. Una popolazione positiva è considerata circa 103 dopo, di intensità di fluorescenza. E. La commissione per l' Grafico della percentuale di cellule positive mpo:GFP (neutrofili) in Animali Control vs. Test tnon accoppiato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig06large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig07.jpg"> Figura 7: Dosaggio TUNEL del pesce iniettato di cisplatino. A. La commissione per l'a Microfotografie di rene adulto fisso 24 ore dopo 120 μg/g iniezione di cisplatino. I controlli vengono iniettati con lo 0,9% di NaCl. Le cellule positive TUNEL (celle apoptotiche) sono macchiate di rosso (frecce bianche). Dapi (blu) è usato come controsostenibile nucleare. Barra di scala: 50 μm. B. La commissione per l' Grafico che mostra la quantificazione del numero di cellule morte nel rene per 20x campo. Test t nonaccoppiato, * p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig07large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Linea transgenica</td>
			<td>Tipo di cella etichettato</td>
			<td>referenze</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(spi1:EGFP)pA301</td>
			<td>Cellule mieloidi</td>
			<td>Ward et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(zpu1:GFP)</td>
			<td>Cellule mieloidi</td>
			<td>200449 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mhc2dab:GFP)sd6</td>
			<td>monociti</td>
			<td>Wittamer et al.</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lysC:DsRED2)</td>
			<td>Neutrofili</td>
			<td>Hall et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpo:GFP)</td>
			<td>Neutrofili</td>
			<td>Mathias et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:mCherry)</td>
			<td>Macrofagi</td>
			<td>Ellett et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:Dendra2)</td>
			<td>Macrofagi</td>
			<td>Harvie et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lck:GFP)</td>
			<td>Cellule T</td>
			<td>Langenau et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TgBAC(ikaros:EGFP)</td>
			<td>Cellule T</td>
			<td>Bajoghli et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag1:GFP)</td>
			<td>Cellule T</td>
			<td>Jessen et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag2:GFP)</td>
			<td>Cellule T</td>
			<td>Jessen et al. 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg (CD79:GFP)</td>
			<td>Cellule B</td>
			<td>Liu et al. 201759
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(CD45:DsRed)</td>
			<td>leucociti</td>
			<td>Bertrand et al. 
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Linee transgeniche zebrafish per cellule immunitarie. Tabella che riprende i nomi delle linee di reporter zebrafish con il rispettivo tipo di cellula immunitaria etichettata e gli articoli di riferimento in cui sono state costruite. Una combinazione di queste linee zebrafish può offrire nuove possibilità di selezione cellulare per citometria a flusso.

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Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Questo protocollo descrive le procedure per indurre la lesione renale acuta (AKI) nel pesce zebra adulto usando il cisplatino come agente nefrotossico. Abbiamo dettagliato i passaggi per valutare la riproducibilità della tecnica e due tecniche per analizzare l'infiammazione e la morte cellulare nel tessuto renale, citometria del flusso e TUNEL, rispettivamente.

Modello di lesione renale acuta indotto dal cisplatino nel pesce zebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

L'obiettivo generale di questa procedura, viene spiegato l'uso del cisplatino come agente nefrotossico nei pesci zebra adulti, analizzando l'infiammazione e la morte cellulare nel tessuto renale. Per raggiungere questo obiettivo e il pesce zebra adulto viene anestetizzato e pesato per iniettare una dose specifica di cisplatino nella cavità peritoneale. Dopo aver monitorato la mortalità, il rene viene sezionato e le cellule sono isolate per la citometria del flusso o fissate e sezionate per essere analizzate con test TUNEL fluorescenti.Le seguenti procedure possono aiutare a rispondere a domande chiave in campo renale utilizzando gli effetti nefrotossici del cisplatino come strumento per sviluppare un modello di lesione renale acuta e pesci zebra adulti. Questo modello può essere utilizzato per l'esplorazione di nuovi obiettivi terapeutici nella protezione renale, oltre ad chiarire il meccanismo di rigenerazione nel rene del pesce zebra. Il cisplatino è un agente chemioterapico usato per trattare una varietà di cancro.Tuttavia, può facilmente accumularsi nel rene, generando morte cellulare, infiammazione e diminuzione della funzione renale. L'effetto del cisplatino dipende dalla dose, quindi puoi ridurre il nostro aumento del consumo dipende dai tuoi obiettivi. Le tecniche utilizzate qui per analizzare l'infiammazione e la morte cellulare non sono esclusivamente per la diffusione del modello della malattia.La citometria a flusso nei pesci zebra può aiutare ad chiarire gli stati infiammatori dell'animale in modo quantitativo, mentre in TUNEL diciamo che può chiarire la presenza di cellule poptosed nei contesti fisiologici e patologici. Prima di iniziare l'esperimento, preparare la soluzione di lavoro del cisplatino diluire la soluzione stock a 820 microgrammi per mil in cloruro di sodio allo 0,9%. Successivamente, anestetizza un altro pesce zebra e asciuga l'eccesso di acqua su alcuni tovaglioli di carta.Pesare il pesce posizionandolo su una bilancia, prendendo nota del peso. Effettuare i calcoli per conoscere il volume esatto da iniettare. Per ottenere la dose di 120 microgrammi per grammi di peso, utilizzare la formula successiva.Dividere la dose finale per la dose della soluzione di lavoro e convertire questo numero in microlitri, moltiplicando per 1000 per ottenere il volume di 120 microgrammi di cisplatino. Quindi, moltiplica questo numero per il peso del pesce per ottenere il volume finale da iniettare. Posizionare un pesce su una spugna bagnata, con una piccola tazza per tenerlo.Con il lato ventrale verso l'alto e riempire una siringa di insulina con un volume calcolato di cisplatino. Inserire l'ago sulla linea mediana ventrale in un angolo poco profondo, tirando delicatamente la parete ventrale verso l'alto per evitare di forare organi interni. E poi iniettare la soluzione.Dopo l'iniezione, mettere un pesce in un serbatoio per riprendersi dall'anestesia e attendere segni di recupero come nuoto e movimenti appropriati. Monitora per quei pesci due volte al giorno per i prossimi giorni. A questa dose, il cisplatino induce circa il 30% della mortalità nelle prime 24 ore.Eutanasia il pesce e asciugare l'eccesso di acqua in un tovagliolo di carta. Dopo aver rimosso la testa e gli organi interni, utilizzare aghi di dissezione per appuntare le pareti del corpo. Individuare il rene nella parete dorsale del pesce e utilizzare le forcep per staccare il rene.Posizionare il rene in una piastra a sei po pozza con una soluzione fresca di un PBS 1X, 2%FBS e tenere sul ghiaccio. Successivamente, raccogliere il tessuto con del liquido e passarlo attraverso un colino cellulare da 40 micron e macerare delicatamente il tessuto con uno stantuffo per siringhe. Lavare due volte con un PBS 1X, 2%FBS.E raccogliere le cellule in un tubo di falco da 50 mils. Quindi centrifugare per cinque minuti a 400 G.Careful pickup il supernatante con una pipetta e scartarlo. Aggiungere 500 microlitri di PBS freddo 1X per sospendere di nuovo le celle e posizionarle in un tubo di citometria a flusso di cinque mils.Tienili sul ghiaccio. Prendi 10 microlitri del campione e mescolalo con 90 microlitri di blu trypan in un tubo Eppendorf. Aggiungere 10 microlitri della miscela a una camera Neobauer e contare le cellule al microscopio.Prendi le cellule per essere lette da un citometro, quindi analizza i risultati selezionando la popolazione dei tuoi interessi. Per questa procedura, eutanasiare un pesce e rimuovere gli organi interni lasciando il rene attaccato al corpo. Quindi, fissare le pareti del corpo su una superficie di sughero e posizionarla gradualmente verso il basso sulla soluzione di fissazione.Tienilo a quattro gradi durante la notte. Il giorno dopo, sezionare il rene con un forcipe fine. Cerca di non disturbarlo.Mettilo in una piccola piastra di Petri o in un tubo Eppendorf con 1X PBS per risciacquare. Cambiare il PBS e preparare il 2%agarosio per generare una matrice di supporto per il rene prima che si evolvano solidamente. Scartare tutti i PBS rimanenti e versare lentamente l'agarosio.Quindi, posizionare il rene con forcep fini per evitare che si pieghi. Lasciare che l'agarosio si solidifichiamo a temperatura ambiente. Dopo la solidificazione dell'agarosio, utilizzare un bisturi per tagliare l'agarosio intorno ai reni formando un piccolo cubetto.Posizionare i cubi di agarosio all'interno di una cassetta istologica e inviarli per l'elaborazione istologica per incorporare il tessuto in paraffina. I blocchi di paraffina, taglieremo quindi in cinque sezioni di spessore di micron. Sgonfonda gli scivoli e conservali in acqua distillata.Preparare una camera di incubazione scura, mettendo gli asciugamani di carta bagnata sul fondo. Posizionare le diapositive nella camera scura e aggiungere proteinasi K per la permeabilizzazione del tessuto. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius.Mentre i campioni vengono incubati, preparare la miscela di reazione TUNEL, aggiungendo 50 microlitri di soluzione enzimatica su 450 microlitri di soluzione di etichetta. E tenersi al protetto dalla luce. Raccogliere la camera scura e lavare la fetta due volte con un PBS 1X.Quindi, asciugare le diapositive e sulla miscela di reazione TUNEL. E incubare a 37 Gradi Celsius per due ore. Dopo l'incubazione, lavare nuovamente questo diapositive con un PBS 1X.E aggiungere DAPI per la colorazione del contatore dei nuclei. Incubare a temperatura ambiente per cinque minuti, protetto dalla luce. Risciacquare tre volte con un PBS 1X.E poi, modellare le diapositive con un mezzo idrofilo anti-dissolvenza. Posizionare una lapsus. E sigillare con smalto per unghie.Visualizzare i campioni in un microscopio fluorescente. In questo grafico, è possibile vedere che il cisplatino ha un effetto di risposta alla dose sulla sopravvivenza dei pesci, rispetto a un controllo iniettato solo con cloruro di sodio allo 0,9%. La linea rossa in questo grafico rappresenta una dose di 120 microgrammi per grammi utilizzati in questo video.Queste dosi possono essere applicate a maschi e femmine, poiché non è stata riscontrata alcuna differenza statistica tra loro. La citometria a flusso consente di quantificare diverse cellule presenti in un tessuto. Le popolazioni di cellule ematopoietiche sono identificate nel rene di diversi pesci per dimensione o dispersione in avanti e granularità o dispersione delle dimensioni.In questo modo, è possibile separare le popolazioni in eritetrociti, linfociti, granulociti e precursori ematopoietici. Qui, l'attuale strategia di gate selezionando i granulociti, le singolette e le cellule positive MPO permettono di trovare la popolazione dei neutrofili nel rene segnata dall'espressione di fluorescenza della mieloperossidasi. In questo caso, l'iniezione di cisplatino ha indotto l'aumento della percentuale di neutrofili presenti nel rene.Il saggio TUNEL permette di rilevare le cellule apoptotiche in un tessuto osservando lo scivolo tissutale del rene da un microscopio a fluorescenza, è possibile vedere il segnale apoptotico all'interno dei nuclei di alcune cellule, qui in rosso. Contrastato da una macchia nucleare in un tale DAPI qui in blu. L'iniezione di cisplatino ha aumentato la presenza di cellule apoptotiche nel rene, che sono possibili quantificare manualmente o utilizzando un software di immagine.Alla fine di questo video dovresti essere in grado di sapere come iniettare e regolare la dose di cisplatino per indurre lesioni renali acute nei pesci zebra adulti. E come sezionare il rene per scopi diversi. La citometria a flusso è uno strumento eccellente che ti aiuterà a comprendere il profilo di diversi tipi di cellule dipendenti dalla disponibilità di linee di tragenclave nel tuo laboratorio.Ricordarsi di considerare il colore delle linee dei trasportatori se si desidera utilizzare anticorpi per etichettare tutti i loro tipi di cellule. Il saggio TUNEL è un semplice strumento che ci permette di rilevare cellule e tessuti apoptotici e può essere analizzato non solo per microscopia, ma anche per citometria a flusso. Ricorda, usa sempre dispositivi di protezione individuale durante l'intera procedura.

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