Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

この研究は、フンダソン・デ・アンパロ・ア・ペスキサ・ド・エスタド・デ・サンパウロ - FAPESP(2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4, コンセル・ナシオナル・デ・デセンボルヴィメント・チエンティフィコ・エ・テクノロギコ (CNPq)サンパウロ大学バイオサイエンス研究所のマリア・リタ・ドス・サントス・エ・パッソス・ブエノ研究所と遺伝学進化生物学部のゼブラフィッシュ施設の共同研究者に感謝します。クリスティアン・ナファ・デ・ソウザ・ブレダとテレサ・ラケル・デ・オリベイラ・ラマリョの原稿に関するコメントや提案に感謝します。私たちは、このビデオの記録、版、および制作のために、生物医学研究所のマルチメディアチームから、マルシオ・ビジャル・マーティンスに大いに感謝し、感謝します。

このプロトコルに記載されている手順は、サンパウロ大学生物医学研究所の動物使用倫理委員会によってゼブラフィッシュモデルで使用することが以前に承認されました。
1. シスプラチン内腹腔内注射によるAKI誘導
<ol><li>ストック溶液を0.9%NaClで850 μg/mLに希釈して 、シスプラチン加工溶液 を調製します。光から保護された室温で保ちます。 注意:製造者は、ゴーグル、手袋、ラボコートを含む個人的な保護具(PPE)でシスプラチンの操作をお勧めします。ストック溶液を光から保護した室温で保管してください。</li>
	<li>システム水45に150 mg /L MS-222(トリケーヌ)麻酔薬を準備します。約1〜2分間浸漬することにより、成体ゼブラフィッシュ(5~9ヶ月)を麻酔します。 注:効果的に麻酔魚はタッチに応答しない必要があります。効果的な麻酔をテストするには、コーダルフィンを軽く押して反応を観察します。 注意:トリケーヌは皮膚や目に刺激を与え、PPEを使用して操作します。</li>
	<li>プラスチック製のスプーンを使用して、魚をペーパータオルなどの吸収性の表面に移し、体の周りの余分な水を取り除きます。その後、プラスチックスプーンでスケール上のペトリ皿に魚を転送し、魚の重量を量ります。それは線量の計算のために必要になりますので、魚の重量に注意してください。 注:魚から余分な水を吸収すると、動物の体重を過大評価を防ぎ、魚に偏見があるので過度に乾燥しないでください。</li>
	<li>最終的な重量の120 μg/gの線量を達成するために、最終用量(120 μg)のμgをシスプラチン作動溶液(850 μg)のμg(850 μg)に割り、1000を掛けてマイクロリットル(μL)に変換し、120μgのシスプラチン(141.2μL)の体積を得た。次に、この数値(141.2 μL)を魚の重量(g)に掛けて、最終的な体積を注入します。</li>
	<li>プラスチック製のスプーンで、腹側を上にして、それを保持するために少しカットして濡れたスポンジに魚を転送します。スポンジは、システム水の麻酔薬で濡れている必要があります。</li>
	<li>31 G 1.0 mL インスリン注射器に、計算されたシス プラチン作業溶液の量を充填します。</li>
	<li>骨盤ひれの近くの動物の腹腔内部分に、内臓を穿刺しないように浅い角度で針を挿入する(図2A)。その後、ゆっくりと溶液を注入します。</li>
	<li>注射後、魚を水槽に入れて麻酔から回復します。正常な回復の兆候(例えば、 水泳の動き、腹膜運動)のために魚を見てください。 注:動物は次の3-5分で回復する必要があります。必要に応じて、プラスチックのスプーン、パスツールプラスチックピペットで移動するか、気泡でホースの近くに置くことによって、魚を刺激します。</li>
	<li>対照魚の場合は、0.9%NaClの溶液を注入して同じ手順を実行します。体重の割合に従って同じ計算を使用する:注入される容積は141 μL魚の重量(g)を掛けたものになる。</li>
	<li>次の日に少なくとも1日2回魚の生存を監視する(図2B)。</li>
</ol>2. 免疫細胞のフローサイトメトリーのための腎臓の分離と組織処理
<ol><li>この手順では、免疫細胞蛍光標識トランスジェニック動物(例えば、Tg(mpo:GFP)を使用してください。</li>
	<li>120 μg/g シスプラチンの24 hpiの後、動物を低熱ショック(急速冷え)によって安楽死させる。 注:低熱ショックはMS-222過剰摂取よりも安楽死法としてより効果的であることが実証されています。低熱ショックは、MS-222の使用よりも、ストレスが少なく、速く、一貫性があり、人員にとって安全である、46、47を以前に説明した。</li>
	<li>外側の交差タンクでは、氷とシステムの水の5:1比で氷水を準備し、氷の上にスクリーンを持つ内側のタンクを入れて、水が2〜4°Cに達するまで待ちます。 注:魚は熱熱や痛みを引き起こす可能性があるため、氷と直接接触してはいけません。</li>
	<li>動物を氷水に移し、配向が失われ、眼の動きがなくなるまで少なくとも10分待ちます。</li>
	<li>プラスチック製のスプーンで、余分な水を乾燥させるためにペーパータオルの上に魚を置きます。</li>
	<li>魚を3%アガロース解剖プレートに移し、上光を持つステレオスコープの下に持って行きます。はさみで、目のすぐ後ろで速い切り傷を作る魚の首を切り落とし、頭を取り除きます。</li>
	<li>細かいはさみで開いた側からクロアカに切り取り、細かい鉗子で内臓を取り除きます。</li>
	<li>昆虫ピンを使用して、ボディウォールの側面をつまんで死体を開き、バックボーンに取り付けられた腎臓を露出させます。</li>
	<li>腎臓を細かい鉗子で取り外し、1x PBS/2%FBSの冷たい溶液で6ウェルプレートに臓器を入れる。氷の上に置いておきなさい。</li>
	<li>パスツールプラスチックピペットで組織をピックアップし、50 mLチューブ上の40 μmの細胞ストレーナーを通して組織を通過させ、注射器プランジャーでそっと浸漬します。</li>
	<li>1x PBS/2%FBSの1 mLで2回洗浄し、50 mLチューブに細胞を集めます。</li>
	<li>遠心分離細胞は400×gで5分間4°Cで5分間。</li>
	<li>慎重に1 mLのマイクロピペットですべての上清を拾い、それを捨てます。500 μLのコールド1x PBSを加えて細胞を再懸濁し、5 mLフローサイトメトリーチューブに入れます。氷の上に置いておきなさい。</li>
	<li>トリパンブルーで1:10希釈を行うノイバウアーチャンバーのセル数を数えます(例えば、サンプルの10 μLを取り、トリパンブルーの90 μLと混合します)。混合物の10 μLをノイバウアーチャンバーに加え、顕微鏡下で細胞を数えます。 注: 最適な結果は、1-5 x 106 個のセル/mL と >80% の生存率で期待されます。 注意:トリパンブルーは発がん性薬剤であり、PPEを使用して処理します。</li>
	<li>細胞計で読み取る細胞を取る。次に、対象となる母集団を選択した結果を分析します。</li>
</ol>3. TUNELアッセイ用の成体ゼブラフィッシュ腎臓組織の処理
<ol><li>この手順では、同様の蛍光がTUNELの分析を妨げる可能性があるとして、野生型動物(例えば、AB、テュービンゲンなど)またはTUNELキットとは異なる蛍光色のトランスジェニック動物を使用してください。</li>
	<li>120 μg/g シスプラチンの24 hpiの後、動物を低熱ショック(急速冷え)によって安楽死させる。2.3-2.4を参照してください。</li>
	<li>2.5-2.6 に記載されているように魚を解剖;腎臓は固定手順の間にバックボーンに付着したままにする必要があります(以下の説明)。</li>
	<li>昆虫のピンを使用して、体の壁の側面をつまんで死体を開き、コルクの表面に固定して腎臓を露出させます。 注:この手順は、腎臓が後で分析するために適切な位置に残っていることを保証します。</li>
	<li>その後、腎臓を下に向けたコルク表面を6ウェルプレートに置き、4%パラホルムアルデヒド(PFA)の新しく作られた溶液の上に置きます。4°Cで一晩保管してください。 注意:PFAは皮膚および粘液表面に発がん性があり、刺激性である。目の保護装置を含むPPEを使用して化学フードの下でPFAソリューションを準備します。</li>
	<li>翌日、腎臓を2.8のように解剖する。1x PBSで60mmのペトリ皿に腎臓を入れ、1x PBSで2回洗いすります。</li>
	<li>2%アガロースを準備し、組織の支持マトリックスを生成する。</li>
	<li>ペトリ皿から残りのすべての1x PBSを捨て、臓器全体を覆うためにゆっくりと2%アガロースを注ぎます。次に、腎臓を折り畳むのを防ぐために、体型顕微鏡下で微細な鉗子を使用して腎臓を配置します。アガロースを室温で固めます。 注:この手順は、器官の葉のような形が支持マトリックスの中になければ折り畳む傾向を引き起こすので、組織学的処理を通じて器官の向きと形状を維持します。</li>
	<li>アガロース固化後、メスを使って組織の周りにアガロースを切断し、小さな立方体を形成し、組織の周りにアガロースの過剰を除去する。</li>
	<li>アガロースキューブを組織学的処理に適したカセットに入れます。 メモ:次の手順は、手動または自動ティッシュプロセッサで行うことができます。</li>
	<li>まず、カセット内の組織を室温で45分間処理し、それぞれ45分間、50%エタノールの浴1浴、70%エタノールの浴1浴、95%エタノールの2つの連続浴、および100%エタノールの3つの連続した浴を処理する。その後、キシレンの2つの連続した浴とパラフィンの3つの連続した浴で組織を処理します。後者は60°Cでそれぞれ1時間続きます。 注意:化学フードの下で変更を加え、エタノールとキシレンからの蒸気は刺激性と有毒です。</li>
	<li>パラフィンブロックを調製するために、パラフィンレンズ豆を60°Cに溶融する。</li>
	<li>プラスチックカセットを内部のティッシュで開け、暖かい皿の上に置いてください。パラフィン用のウォームアップメタル金型。</li>
	<li>ピンセットを使用すると、腎臓の長さが金型ベースに平行になるように、金属モールドの上に組織を配置します。パラフィンを加え、必要に応じて組織を再割り当てします。</li>
	<li>カセットのベースで金型を覆い、グリッドが覆われるまでパラフィンを追加します。室温で固め、次に-20°Cで置き、より速い凝固プロセスを行います。</li>
	<li>20~30分後に、金属モールドからパラフィンブロックを放出します。</li>
	<li>ミクロトームを用いて、パラフィンに埋め込まれた組織を5μmの厚さに切り離す。組織を収集するために、シラナイズまたは正に帯電したガラススライドを使用してください。</li>
</ol>4. チューンルアッセイ
注: 次のプロトコルは、In Situ 細胞死検出キット (材料表) を使用します。
<ol><li>脱ワックス組織は、5分間キシレンの2つの連続した浴場に置くスライド。次に、エタノールの等級シリーズを通して組織を水分補給する:100%-95%-70%-50%、それぞれ5分間。</li>
	<li>冷たい水道水を流してエタノールをすすいでください。スライドを蒸留水に入れます。</li>
	<li>暗いインキュベーターチャンバーを準備します。インキュベーションの段階で水分を保つために底部に濡れたペーパータオルを追加します。 注:インキュベーターチャンバーの欠如では、底部に湿った紙とスライドを配置するために2つのつまようじでペトリ皿を使用することが可能です。</li>
	<li>新鮮な プロテイナーゼKの作業ソリューションを準備する:10 mMトリス/HCl、pH 7.4-8で10 μg/mL。 注:プロテイナーゼKは、製造者が推奨するパーメアビライゼーション剤として使用されます。</li>
	<li>暗いインキュベーターチャンバーにスライドを置き、サンプルをカバーするまで プロテアーゼK作業溶液 を追加します。37°Cで30分間インキュベートします。</li>
	<li>サンプルがインキュベートされている間 、TUNEL反応混合物を調製する: 酵素溶液50 μLを450 μLラベル溶液に加えます。光から守る。 メモ:準備するボリュームは、同じ1:10の割合で調整することができます。体積は各セクションの混合物の50 μLであると計算されます。これはサンプルのサイズによって変わる可能性があります。</li>
	<li>暗い部屋を拾い、1x PBSでスライドを2回洗います。</li>
	<li>次に、吸収性紙を用いて試料の周りの領域を乾燥し、各組織スライド上に50μLの TUNEL反応混合物 を加え、サンプル全体が覆われるように溶液を広げる。37°Cで2時間インキュベートする。光から守る。</li>
	<li>インキュベーション後、スライドを1x PBSで3回すすいで、ペーパータオルを使ってサンプルの周りの領域を乾燥させます。</li>
	<li>サンプルに50 μLのDAPI 1:1000を加え、核カウンター染色を行い、室温で5分間インキュベートします。光から守る。</li>
	<li>1x PBSで再び3回リンスし、サンプルの周りの領域を乾燥させます。</li>
	<li>スライドを抗フェード親水媒体で取り付け、カバースリップを置き、マニキュアで密封します。スライドを水平に保管し、4 °Cで光から保護します。 注:取り付け培地のアンチフェード特性は、サンプルの蛍光を維持するためにありますが、利用可能な任意の親水性媒体を使用することが可能です。マニキュアによる最終シーリングステップは、脱水を避けるために重要です。</li>
	<li>蛍光顕微鏡でサンプルを可視化します。このタイプの蛍光顔料の場合、520~560nm(緑色)の範囲で励起波長を使用し、570-620nm(赤色)の範囲で検出します。</li>
</ol>

著者らは開示するものは何もない。

腎臓病の罹患率は世界的に増加し続けており、何百万人もの人々に影響を与える世界的な公衆衛生問題となっています63.腎臓の負傷した個人を治療する方法を見つけることは、彼らの病因と進行についてもっと理解するだけでなく、最も重要です。いくつかの研究は、腎損傷を理解するために動物モデルを使用しています。.ゼブラフィッシュ腎臓(図1)は、自己再生能力と遺伝的類似性29,64のために、発生生物学および傷害研究において長年研究されてきた。ここでは、シスプラチンの特性を腎毒性剤として使用した成体ゼブラフィッシュに新しいAKIモデルを提示し、速くて急性反応を達成するためのステップを、すぐに24hpiと同時に目に見える損傷で達成するための手順を詳述する(図2)。また、シスプラチン注射後の組織損傷、フローサイトメトリー、TUNELの評価に役立つ2つの技術を説明する(図3)。
成人ゼブラフィッシュの現在のAKIモデルには、腎管および尿細管破壊に大きな損傷を誘発するゲンタマイシンのi.p.注射が含まれ、腎症事象は5日目から始まり、再生成は注射後21日までに完了する65日後である。一方、敗血症関連急性腎障害(S-AKI)のモデルは、ドセジエラ・タルダ感染により確立され、インスリン様成長因子結合タンパク質-7(IGFBP7)、メタロプロテイナーゼ2(TIMP-2)の組織阻害剤、および腎臓損傷分子-1(KIM-1)、および成人ゼブラ66例のAKIマーカーの発現が有意に増加した。ゼブラフィッシュは、治療薬の探索のためのハイスループット動物であることで知られており、これには、腎機能および再生67を研究するためのプロバイオティクスおよび微生物叢由来代謝産物の使用が含まれる。しかし、利用可能なモデルは、これらの治療の結果に直接影響を与える可能性があります。そこで、エピタキビガニ属のゼブラフィッシュ(図4)において、抗生物質のゲンタマイシンモデルやE.タルダ感染と同様に、魚の微生物叢に直接の影響を及ぼさない既知の腎毒性物質としてシスプラチンを用いて、敗血症モデルとしてAKIを誘導する別の方法を確立した。しかし、シスプラチンプロトコルを開発すると同時に、別のグループは、成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンの腎毒性効果を検討し、動物1匹あたり10〜20〜30μgの用量を簡素化した。また、シスプラチン用量依存効果を示したが、同じ年齢のゼブラフィッシュはサイズや重量が大きく異なり、結果69,70のばらつきを引き起こす可能性があるため、すべての魚に単一量のシスプラチンを使用する場合には注意が必要です。我々は、マウスとこの研究で行われているように、動物の対応する重量に用量を調整することが重要であると考えています。
成体ゼブラフィッシュの実験では、シスプラチンは用量反応効果を示した。シスプラチン注射後の動物の生存率をモニタリングして可視化した(図5)。モニタリング時間中に他の物理的な徴候が見えないため、シスプラチンの用量の強度を推定する方法として生存を使用しました。これは、げっ歯類と比較して、シスプラチン注射15の投与量および頻度によって腎臓損傷の重症度を調節することができる、シスプラチン71の高濃度で致死量を達成する。死んだはシスプラチン72の幼虫モデルで次の日にも見られる。数日で急性損傷を引き起こすことを目的としていたので、注射後24時間で腎臓の損傷を観察できるように120μg/gのシスプラチンを選択したが、これは研究の目的に応じて調整することができる。
ヒトにおいて、AKIは、血液凝濾速度(GFR)の低下によって臨床的に診断され、血清クレアチニン、及び血尿素窒素3を上昇させた。ゼブラフィッシュでは、AKIモデルのレパートリーには、遺伝的条件モデル73、74、およびいくつかの薬物関連モデル65、72が含まれていますが、技術的な困難(例えば、血液採取)のためにゼブラフィッシュでAKI機能パラメータの一部を測定できないため、ほとんどの研究ではAKI1,75の特徴を観察するために形態学的および視覚的な技術を採用しています。
げっ歯類では、シスプラチンは近位および遠位細管の上皮細胞に入り、細胞内では代謝活性化を受け、細胞小器官に対して反応性が高くなり、細胞構造の変化を誘発する。これらの変化は、アポトーシスとオートファジー、さらには壊死を非常に高用量で誘発することができます。この損傷に対して、多くのサイトカインが放出され、白血球が発徴されて炎症を引き起こし、器官15の機能性に影響を及ぼす。これは、住民や浸潤免疫細胞として、負傷した腎臓にどのような種類の細胞が見つかるかを評価することの重要性を強調しています。ここでは、現在入手可能なトランスジェニック免疫レポーターラインを用いて、フローサイトメトリーでこれを評価する方法を示した(表1)。シスプラチンは、注射後24時間の腎臓における好中球(mpo:GFP陽性細胞)の割合を増加させる(図6)。ゼブラフィッシュの場合、腎臓は異なる血液細胞タイプを生み出すHSCのニッチである。それにもかかわらず、多くの顆粒球およびマクロファージは、通常、血液中を循環している。この例では、好中球52の骨髄ペルオキシダーゼのプロモーター下でGFPを発現するmpo:GFPトランスジェニックラインを用いた。mpo:GFPトランスジェニックラインの元の研究は、好中球成熟76の異なる状態におけるミエロペルオキシダーゼの発現を実証したが、我々のゲート戦略は、血液52から来る成熟細胞を含む顆粒球分数に焦点を当てたが、このように我々の分析は浸潤細胞を含み、居住細胞ではない。これは、望ましい細胞集団を単離する際に考慮することが重要である。
上述したように、アポトーシスは、シスプラチン関連AKIの最も古典的なマーカーである。ここでは、TUNELアッセイによる死細胞の局在化のための簡単なプロトコルを実証した。シスプラチン注射は、24hpiのアポトーシス細胞の数を増加させる(図7)。これは、組織から死んだ細胞を直接数えることによって容易に定量することができる。それにもかかわらず、細胞特異的死の同定のために、所望の細胞(例えば、管状細胞)に対する抗体の使用、またはトランスジェニックレポーターラインの使用は、この技術と共に使用することができる。AKIのゲンタマイシン誘発モデルと比較すると、シスプラチンは注射後3日目にゲンタマイシンアポトーシスが高かったため、より重篤なモデルのようです。
種々の副作用を有するにもかかわらず、シスプラチンは癌の治療において、癌腫、生殖細胞腫瘍、リンパ腫、肉腫77を含む様々なタイプの癌に対する有効性のために、依然として広く使用されている。腎毒性はシスプラチン10による治療中の患者の3分の1で起こり、したがって、この効果を減少させ、再ノノプロテクションを増加させることができる戦略の探索が不可欠である。この原稿に記載されている方法と技術は、腎臓損傷のメカニズムを解明し、主にシスプラチンの使用に関連する腎合併症に苦しむ個人の生活の質を向上させるために不可欠な治療目標を見つけるのに役立つと考えています。

腎臓は、ホメオスタシスを維持するいくつかの重要な生理機能を担っています, 例えば、血液ろ過, 過剰な残基の除去, イオン濃度の調節1.腎組織の損傷は急性腎障害(AKI)と呼ばれる異種状態につながり得、尿細管上皮細胞の破壊および死、内皮細胞損傷、および白血球浸潤2,3の破壊および死亡によって引き起こされる腎機能の急速な低下として臨床的に説明される。AKIは入院4の8-16%で起こると予測される状態で、集中治療室(ICU)5では20~50%の高い死亡率を有する。この病気は、入院の増加と財源のかなりの使用に関連しています5.病因因子は、脱水、ショック、感染症、敗血症、心血管疾患、および腎毒性薬物6を含む。腎毒性は、薬物によって誘発される腎損傷と定義され、AKI、チューブロパシー、および糸球体症として作用を引き起こす7。腎毒性はICU患者の3分の2に影響を及ぼし、ICUで処方される薬物の約20%が腎毒性8、9と見なされ、これは非ステロイド性抗炎症薬(NsaIDs)、バンコマイシンおよびアミノグリコシドなどの抗生物質、およびメトトレキサートおよびシスプラチンのような化学療法剤を含む7。シスプラチンは、最も強力で一般的な化学療法薬の1つであり、頭頸部、精巣、卵巣、および膀胱10などの固形腫瘍の治療に使用される。腎臓において、シスプラチンは、近位畳み込み管(PCT)中に有機カチオン性トランスポーター2(OCT-2)を介して内在化され、高濃度では、DNA誘発細胞死経路7、10、11、12に結合する。腎臓におけるこの薬物の蓄積は、死および炎症13との腎毒性に寄与する。この有害な副作用は、シスプラチン治療を受けている癌患者の3分の1の生命および予後に非常に影響を及ぼすので、癌細胞10に対する殺死効果を失うことなく腎毒性を低下させることができる新しい治療法の研究が不可欠である。
この腎毒性作用のために、シスプラチンは、前方に記述されるように、実験動物モデルにおけるAKIのインダクタとして一般的に使用される。げっ歯類では、シスプラチンによって誘導された最初のAKIモデルが1971年14年に報告されたが、現在、シスプラチン15の用量依存および累積効果を用いて多くの異なるプロトコルが出現している。それにより、投与量および適用数に応じて、腎臓損傷の重症度の異なる等級は、16、17、18、19、20、21を誘発することができる。最も頻繁な方法は、腹腔内(すなわち)シスプラチンの1回の注射と次の日の安楽死からなる。この古典的なプロトコルでは、シスプラチン(マウスでは10-13 mg/kgおよび/またはラットでは3-8mg/kg)の単一の高い腎毒性用量は、シスプラチン注射の数日後に、管状内のブラシ境界および細胞破片の喪失などの重度の組織学的変化を誘発する。組織学的変化の重症度は用量依存性であり、そして、シスプラチン注射16、17の7日後に再生の徴候が観察される。
げっ歯類モデルは確立されていますが、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)に焦点を当てて、別の脊椎動物の特性を活用することにしました。この魚は、その小さなサイズ、外部受精、高い繁殖率、急速な発達、胚および幼虫の透明性、低維持コスト、哺乳類と同様の解剖学(いくつかの例外を除く)、組織再生能力の高さ、社会的行動、人間との遺伝的類似性の70%、ヒト疾患関連遺伝子の84%のために、ヒト疾患のモデリングに広く使用されている。Streisingerら23,24,25は、脊椎動物の開発の遺伝子解析のためにこのモデル生物を利用することの実践性を確認したゼブラフィッシュを用いて研究を開始した。腎臓研究では、ゼブラフィッシュは発達研究だけでなく、腎臓の状態に関連する新しい遺伝子を探索する遺伝的ツールとしても出現している。さらに、瘢痕形成のない再生能力と、その生涯を通じて腎細胞を生成する能力は、腎生知と呼ばれ、ゼブラフィッシュを再生研究27,28の主要動物モデルにする。さらに、急性および慢性腎障害を含む異なる腎臓病の実験モデルの入手可能性は、この実験生物26、29の多様性を示す。哺乳類と同様に、ゼブラフィッシュの腎前駆体は中間中皮に由来する。このような腎前駆物質は、後にメサネフロスに発症する傾向のある咽頭を生成し、これは成人期まで成熟した器官として維持される29、30。
成体ゼブラフィッシュ腎臓は、体の背壁に位置し、水泳膀胱と背骨29の間にある。腹側の観点から、ゼブラフィッシュは3つの領域(図1A)に分けることができる(図1A)、頭部(H)、幹(Tr)、尾部(Ta)29)。哺乳類と同様に、ゼブラフィッシュは腎臓の機能単位として腎膜を有し、尿細管セグメント(図1A):腎肉体(RC)、近位状の複雑な尿管(PCT)、近位直流細管(PST)、遠位早期(DE)、後期遠位(DL)および採取ダクト(CD)299に分かれている。ゼブラフィッシュは、ヒトのネフロン(図1B)と遺伝的保全および構造的類似性を共有するが、中間細管のようないくつかの立体構造を欠いているが、ヘンレ(LH)29,31のループとしても知られている。ゼブラフィッシュのような淡水魚は、通常、非常に低い浸透性を有する培地に囲まれ、このため、彼らは、エラ、初期段階での皮膚、および浸透性および水排泄を調節する腎臓に依存する傾向がある。自発性の大動脈からの血液の濾過は、約48時間の受精後(hpf)33,34から始まる。ゼブラフィッシュの腎臓は、代謝廃棄物排泄器官であるだけでなく、4日後の受精後(dpf)から成人期までの造血器官としても働き、哺乳動物35の骨髄と同等である。造血幹細胞(HSC)は、腎臓に種子を付け、自己改修し、骨髄、赤血球、リンパ系の細胞系統を生成し、転写因子、シグナル伝達分子、および哺乳類36,37と高度に保存された遺伝プログラムを維持する。研究は、ヒト免疫系のエリスロイド、血小板、骨髄、およびリンパ球細胞のほとんどがゼブラフィッシュ37、38に存在することを明らかにした。この動物のユニークな特徴と人間の腎臓との保存された特徴は、このモデル生物を腎機能、傷害、および再生の研究において有利にした。
ゼブラフィッシュの腎臓はよく研究されており、AKIのいくつかのモデルはすでに幼虫と成体ゼブラフィッシュ28で利用可能ですが、このプロトコルの確立時点では、成体ゼブラフィッシュに化学的に誘発された非抗生物質のAKIモデルの証拠はありませんでした。また、我々の研究室では、再生や腎損傷を研究するためにプロバイオティクス細菌や微生物由来化合物の試験に注力し、成人魚に新しいシスプラチン誘発のAKIモデルを作り出すことに力を注いできました。この原稿に示すビデオ記事は、動物のg当たり120 ugシスプラチン(120 μg/g)のi.p.注入を用いたAKI誘導の新しいモデルの手順を示しています(図2A)。この用量は、10mg/kg(10μg/gに相当)14、15、16、17の周りを行ったマウスモデルでシスプラチンによって誘発されたAKIの研究に基づいていたが、この用量は腎毒性に関連する腎臓損傷を誘発するのに十分ではなかった(データは示されていない)。したがって、この研究で使用されたものに用量を増加させた(図2B)。我々の研究は、尿管構造の喪失、炎症浸潤の増加、および高い細胞死率によって示されるように、腎臓組織損傷24 hpiの誘導による注射後の生存率におけるシスプラチンの用量依存効果を明らかにした。ここでは、シスプラチン誘発のAKIの開発を分析する2つの技術を、フローサイトメトリー、細胞浸潤解析、チューンル、細胞死を測定する方法を説明する。フローサイトメトリーは、細胞の物理的な(サイズと粒度)と化学的(蛍光化合物)特性を測定する技術です。細胞の細胞の中では、細胞懸濁液はシース流体を通って、細胞を1行に整理し、一度に1つのセルにレーザービームを通過することを可能にする(図3A)。光線の前にある検出器は、細胞サイズと相関するフォワードスキャッタ(FSC)を測定し、側面の検出器は細胞の粒度に相関する側面散乱(SSC)を測定します。他の検出器は、粒子、蛍光タンパク質、または抗体標識細胞39,40からの蛍光を測定する。ゼブラフィッシュの市販抗体は現在では乏しいので、動物レポーターや蛍光バイオマーカーの使用は、この分析を改善し、多様な細胞集団41、42、43を同定することを可能にする。このプロトコルで使用される別のツールは、末端デオキシヌクレオチジルトランスファーーゼ(TdT)dUTPニックエンドラベリング(TUNEL)アッセイでした。TUNELアッセイは、断片化したDNAを識別し、後で顕微鏡44で可視化および定量することができる蛍光マーカーでタグ付けされたデオキシヌクレオチドで標識するTdTの能力に依存する後期アポトーシス検出方法である(図3B)。AKIの最も顕著な特徴の1つは、尿細管腎細胞3におけるアポトーシスの誘導であり、この技術は、フローサイトメトリーおよび/または顕微鏡検査によって分析することができるので、非常に有利である。
本稿で紹介するアプローチは、AKIの状態を観察し、シスプラチン関連のAKIにおける新しい治療目標の研究に役立つAKI障害を研究するための新しい急性モデルを提供する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

シスプラチンは、一般的に化学療法として使用されます。癌治療を受けた人にはプラスの効果がありますが、シスプラチンは低分子量のため腎臓に容易に蓄積することができます。このような蓄積は、管状細胞の死を引き起こし、急性腎障害(AKI)の発症を誘発する可能性があり、これは腎機能の急速な低下、組織損傷、および免疫細胞の浸潤によって特徴付けられる。シスプラチンを特定の用量で投与する場合は、動物モデルにおけるAKIインデューサとして有用なツールとすることができる。ゼブラフィッシュは、腎組織が哺乳類との機能的類似性を保存するので、腎機能、腎臓再生、および傷害を研究するための興味深いモデルとして登場しました。シスプラチンを注射した成体ゼブラフィッシュは、生存率の低下、腎細胞死、および24時間後の炎症マーカーの増加を示す(hpi)。このモデルでは、免疫細胞の浸潤と細胞死をフローサイトメトリーおよびTUNELアッセイにより評価することができる。このプロトコルは、腹腔内シスプラチン注射によって成体ゼブラフィッシュにAKIを誘導する手順を説明し、その後、フローサイトメトリー処理および細胞死TUNELアッセイのために腎組織を収集する方法を示す。これらの技術は、シスプラチンの腎毒性剤としての効果を理解するのに役立ち、成体ゼブラフィッシュにおけるAKIモデルの拡大に寄与する。このモデルは、腎臓の再生を研究するためにも使用することができます, 治療または腎臓の損傷を防ぐ化合物の検索で、AKIの炎症を研究します.さらに、このプロトコルで使用される方法は、組織の損傷および炎症の特徴付けを改善し、これは腎臓関連の併存疾患における治療標的である。

ゼブラフィッシュの腎臓は、後壁とその基本的な機能ユニットに位置する平らな色素性器官であり、ネフロンは、哺乳動物と共に保存される(図1)。再生能力の高い腎臓が1つだけあるという特殊性は、このモデル生物をモデル腎臓損傷に対する優れた選択にします。本研究で提示されるプロトコルは、成人ゼブラフィッシュ中のシスプラチンの腹腔内(i.p.)注入によってAKIを誘導し、後で前に詳述した2つの技術によって分析されるように設計されている:フローサイトメトリー(図3A)とTUNEL(図3B)。図4に、プロセス全体のフローチャートを示します。シスプラチンの用量は、最初にマウスモデル15、16、17に記載のものに基づいて適用され、使用される標準は動物の1kg当たり10〜13mgのシスプラチン(mg/kg)である。しかし、ゼブラフィッシュはマウスよりもシスプラチンに対する耐性が高いことが示され(データは示せず)、最終投与量が増加した。動物の生存率を評価した場合、実験ではシスプラチンの用量依存効果を示した(図5A)。そのため、材料を収集する前に、このプロトコルで説明されているとおりに正確に指示に従い、再現性の尺度として動物の生存率を常に監視することをお勧めします。i.p. 120 μg/gシスプラチン(図5A、赤色線)の注入後、最初の24時間で約30%の生存率の減少が観察され、5日目の生きた動物の約20%に達するまで徐々に減少し、次いで安定化した(図5A)。シスプラチン毒性は、動物の性別の影響を受けず、オスとメスは生存曲線が似ているため(図5B)。
シスプラチン誘発の運動学の分析は、腎臓24 hpiにおける炎症および細胞死の増加を示した。炎症を評価する最も速く定量的な方法の1つはフローサイトメトリーであるが、この技術のために市販されているゼブラフィッシュ抗原に対する抗体の欠如を考えると、免疫マーカーを有するトランスジェニックラインを用いる必要がある。今日では、免疫細胞を標識する多くのゼブラフィッシュラインがアクセス可能である(表1)。これらのラインは、1人で使用することも、組み合わせて、分析のために十分なレパートリーを与えられる48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60.これは、抗体インキュベーションステップが必要ないため、この技術を非常に単純化し、逆に、機械的分離によって細胞を単離した後、細胞計上の直接読み取りが可能である。
前述したように、ゼブラフィッシュの腎臓は、恒食機能を有する血液濾過器官であるだけでなく、成人における造血の解剖学的部位であり、哺乳動物33、34、35の骨髄と同等である。このようにしてフローサイトメトリーで分析すると、ヒト血液61、62(図6A)に匹敵する細胞集団を区別することができ、これにより、細胞集団をサイズと粒度で最初に同定し、破片を除外することができる。この場合、好中球に存在する酵素ミエロペルオキシダーゼと共に、緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するTg(mpo:GFP)52というトランスジェニックラインを用いた。これを知って、私たちのゲート戦略は、顆粒球の人口の初期分離に基づいていました(図6B)。その後、ダブレット細胞は分析を著しく変化させ、不正確な結論を導くことができるので、除外されました。ダブレットは、2つの独立した粒子から成る単一の事象であり、前方散乱高さ(FSC-H)と前方散乱領域(FSC-A)密度プロット(図6C)を選択して除外することができる。このステップの後、蛍光マーカーを発現した細胞を同定し、選択した(図6D)。最後に、母集団統計を分析から抽出し、細胞の割合としてプロットした(図 6E)。
シスプラチン腎毒性の最も顕著な特徴の1つは、尿細管細胞死10であり、これを容易に可視化するために、アポトーシス検出にTUNELアッセイを用いた。この方法では、蛍光マーカーを含まない野生型細胞や組織を使用することを推奨しており、並行蛍光は分析を妨げるため、ゼブラフィッシュの場合は、AB、テュービンゲン、TAB、またはTUNEL蛍光色を妨げない蛍光タンパク質を有するトランスジェニックラインなどの野生型ラインを使用することが推奨される。TUNEL技術は流れのサイトメトリーか顕微鏡によって分析を可能にする。顕微鏡は組織構造を保存する利点があり、どの細胞が死んでいるのかを見ることができます。蛍光顕微鏡下では、アポトーシス細胞の明るい核を背景から容易に分化することができます。シスプラチン(図7B)を注射した動物は、24hpiでコントロール(図7A)よりも死細胞が多い。最終的な定量は、フィジーソフトウェアのセルカウンターオプションで行われ、シスプラチン処理された腎臓ではコントロールよりも統計的に多くの死細胞を示した(図7C)
本稿に記載されたプロトコルは、用量回答者で、速く、信頼性の高い、成人ゼブラフィッシュにおけるAKIの誘導体としてシスプラチンを使用する方法を示した。シスプラチンの生存率から得られたデータと、炎症(フローサイトメトリーによって検出)および細胞死(TUNELアッセイによって検出)を含むシスプラチンの腎毒性の兆候の測定に基づいて、このモデルを提案し、また、AKI関連疾患における将来の治療法に関する研究を提案する。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig01.jpg"> 図1:ゼブラフィッシュとヒト腎臓の構造と比較A. (1)魚の背壁に位置する暗褐色に表される腎臓を有する成体ゼブラフィッシュの側面図、水泳膀胱(sb)と骨格の間。(2)腎臓の腹側図は、採取ダクトに接続された腎(黄色)を示す(青色)。腎臓の異なる領域には、頭(H)、トランク(Tr)、および尾部(Ta)のフラグが立てられます。(3)ゼブラフィッシュのネフロンとそのセグメントを表す模式図は、遺伝的保存領域とヒトのネフロンと一致するように標識され、着色された。 (1) ヒト腎臓の矢状視(2)標識と色付きのセグメントを持つ人間のニーフロンを描いた模式図。RC: 腎コーパスクル;PCT: 近位畳細管;PST: 近位ストレート細管;TL: 細い四肢;LH:ヘンレのループ;TAL: 太い上昇肢;DE: 遠位早期;DL: 遠位遅れ;DCT: 遠位畳細管;CD:ダクトを集める。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig02.jpg"> 図2: シスプラチン誘導AKIの実験計画A. 注射手順中に針の位置を指す成体ゼブラフィッシュの側面および腹側図。針は腹から20〜30°の角度で浸透し、内臓を穿刺することを避けて腹側壁にゆっくりと平行に挿入される。 B. シスプラチン誘導AKIの実験設計:(1)ゼロ日に動物1匹につきシスプラチン120μg/gの注入。(2)ステップ3を試みる前に、注射後の魚類の生存モニタリングは1日目から10日目まで推奨される。(3)さらなる処理技術のためのシスプラチン注射の翌日の腎臓切離。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig03.jpg"> 図3:フローサイトメトリーとTUNEL技術のメカニズムA. フローサイトメーターの概要:細胞の懸濁液は、シース流体によって単一のラインに流体力学的に焦点を当て、細胞がレーザービームの前に1つずつ通過する原因となります。前方および側面の検出器は、前方散乱(FSC)、側散乱(SSC)、および細胞の蛍光を測定する。 B. TUNELアッセイの原理。末端デオキシヌクレオチジルトランスレファーゼ(TdT)は、断片化したDNAの3'-OH末端に蛍光印dUTPを添加することを媒介する。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig04.jpg"> 図4: 表現された手法のフローチャートA. シスプラチン注射(灰色)によってAKIを誘導する際に、フローサイトメトリー(オレンジ)またはTUNEL(青)を通して腎臓組織を分析することを選択する際に従う手順を示すフローチャート。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig05.jpg"> 図5:シスプラチン注入魚の生存モニタリングA. シスプラチン注射の異なる投与量の生存率(25 - 50 - 112.5 - 120 μg/g)。ログランク(マンテルコックス)テスト、** p < 0.01。 B. 120 μg/g シスプラチンを注射したオスとメスの生存率ログランク(マンテルコックス)テスト、***p<0.001。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig05large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig06.jpg"> 図6:遺伝子導入ゼブラフィッシュラインのゲート戦略A. ゼブラフィッシュ成体腎臓細胞の密度プロットは、集団がサイズ(FSC−A)および粒度(SSC−A)によって分離される。色付きの楕円/円によって、異なる母集団が選択されます。ピンク:エリスロイド;黒: リンパ球;黄色: 前駆体;赤:顆粒球。 B. 腎臓における顆粒球集団の選択に対する側散乱領域(SSC-A)および前方散乱面積(FSC-A)の密度プロット。 C. 顆粒球ゲート内のシングルト集団を選択するための前方散乱高(FSC-H)および前方散乱面積(FSC-A)の密度プロット。 D. 腎臓における mpo:GFP 陽性細胞(好中球)の選択のための前方散乱領域(FSC-A)およびFITC-A:MPOの密度プロット。陽性集団は、蛍光強度の約103 オンと考えられる。 E. コントロール対シスプラチン動物における mpo:GFP 陽性細胞(好中球)の割合のグラフ、24 hpi.ペアになっていない t-test です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig06large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig07.jpg"> 図7: 魚を注入したシスプラチンのTUNELアッセイA. 120 μg/g シスプラチン注射後の固定成人腎臓24時間のマイクロ写真。コントロールは、0.9% NaCl で注入されます。TUNEL陽性細胞(アポトーシス細胞)は赤色(白色矢印)で染色される。DAPI(青)は、核カウンターステインとして使用される。スケールバー:50 μm 20倍の倍率。 B. 腎臓内の死細胞数を20xフィールドで定量したグラフ。ペアになっていない t-test、 * p < 0.05 です。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig07large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>トランスジェニックライン</td>
			<td>セルの種類 ラベル付き</td>
			<td>参照</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(スパイ1:EGFP)pA301</td>
			<td>骨髄細胞</td>
			<td>ワード ら 200348
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(zpu1:GFP)</td>
			<td>骨髄細胞</td>
			<td>2004年
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mhc2dab:GFP)Sd6</td>
			<td>単球</td>
			<td>ウィッタマー ら 201150年</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lysC:DsRED2)</td>
			<td>好 中球</td>
			<td>ホール ら 200751
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpo:GFP)</td>
			<td>好 中球</td>
			<td>マティアス ら 200652
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:mCherry)</td>
			<td>マクロファージ</td>
			<td>エレット ら 201153
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:デンドラ2)</td>
			<td>マクロファージ</td>
			<td>ハービー ら 201354
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lck:GFP)</td>
			<td>T細胞</td>
			<td>ランゲナウ ら 200455
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TgBAC(イカロス:EGFP)</td>
			<td>T細胞</td>
			<td>バジョグリ ら 200956
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(ラグ1:GFP)</td>
			<td>T細胞</td>
			<td>ジェッセン ら 199957
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(ラグ2:GFP)</td>
			<td>T細胞</td>
			<td>ジェッセン ら 200158
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg (CD79:GFP)</td>
			<td>B細胞</td>
			<td>劉 ら 201759
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(CD45:DSRed)</td>
			<td>白血球</td>
			<td>ベルトラン ら 200860
</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:免疫細胞のゼブラフィッシュトランスジェニックライン それぞれの種類の免疫細胞ラベル付けとそれらが構築された参照物を持つゼブラフィッシュレポーターラインの名前を再開する表。これらのゼブラフィッシュラインの組み合わせは、フローサイトメトリーによる細胞選択の新しい可能性を提供することができます。

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Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

このプロトコルは、腎毒性物質としてシスプラチンを使用して、成体ゼブラフィッシュに急性腎損傷(AKI)を誘導する手順を記述する。この技術の再現性を評価するステップと、腎組織、フローサイトメトリー、TUNELの炎症と細胞死を分析する2つの技術を詳述した。

成体ゼブラフィッシュにおけるシスプラチンによる急性腎損傷モデル

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

この手順の全体的な目標は、成体シマウマ魚における腎毒性剤としてのシスプラチンの使用、炎症、および腎臓組織における細胞死を分析する方法を説明する。これを達成するために、成体シマウマの魚は麻酔をして、腹腔内のシスプラチンの特定の用量で注入するために計量されます。モニター死亡率の後、腎臓を解剖し、細胞を分離してフローサイトメトリーを調べ、あるいは、蛍光TUNELアッセイによって分析するために解剖する。以下の手順は、急性腎損傷モデルおよび成人シマウマ魚を開発するためのツールとしてシスプラチンの腎毒性効果を使用して腎分野の主要な質問に答えるのに役立ちます。このモデルは、腎保護における新しい治療標的の探索に使用できるだけでなく、シマウマの魚の腎臓の再生のメカニズムを解明する。シスプラチンは、様々な癌を治療するために使用される化学療法剤である。しかし、腎臓に容易に蓄積し、細胞死、炎症を発生させ、腎機能を低下させることができる。シスプラチンの効果は用量に依存します, あなたの目的に依存して投与の私たちの増加を下げることができます..炎症や細胞死を分析するためにここで使用される技術は、疾患モデルの普及のためだけではありません。シマウマ魚のフローサイトメトリーは、動物の炎症状態を定量的な方法で解明するのに役立ちますが、TUNELでは生理学的および病理学的文脈におけるポプト化された細胞の存在を明確にすることができます。実験を開始する前に、ストック溶液を0.9%塩化ナトリウムで1milあたり820マイクログラムに希釈してシスプラチン加工液を調製します。次に、別のシマウマの魚を麻酔し、いくつかのペーパータオルの余分な水を乾かします。魚の重量を量る、重量の注意を取って、スケールでそれらを配置します。注入する正確なボリュームを知るために計算を行います。体重グラム当たり120マイクログラムの用量を達成するには、次の式を使用してください。最終的な用量を作業溶液の用量で割り、この数をマイクロリットルに変換し、1000を掛けてシスプラチンの120マイクログラムの体積を得る。次に、この数値に魚の重量を掛けて、注入する最終的な体積を得ます。濡れたスポンジの上に魚を置き、それを保持するために小さなカップを入れて。腹側を上にして、シスプラチンの計算された量でインスリン注射器を満たす。腹側の正中線に浅い角度で針を挿入し、腹側壁を優しく引き上げて内臓を穿刺しないようにします。そして、ソリューションを注入します。注射後、魚を水槽に入れて麻酔から回復し、水泳や適切な動きなどの回復の兆しを待ちます。その魚を1日2回監視します。この用量では、シスプラチンは最初の24時間で約30%の死亡率を誘導する。魚を安楽死させ、ペーパータオルで余分な水を乾かします。頭部と内臓を取り外した後、解剖針を使用して身体の壁を固定します。魚の裏壁に腎臓を見つけ、鉗子を使って腎臓を取り外します。1つの1X PBS、2%FBSの冷却溶液で6つのウェルプレートに腎臓を入れ、氷の上に保ちます。次に、液体で組織をピックアップし、40ミクロンの細胞ストレーナーを通過し、注射器プランジャーで組織を穏やかに浸漬します。1回の1X PBS、2%FBSで2回洗浄します。そして、50ミルハヤブサチューブに細胞を収集します。その後、400 G.慎重にピペットで上清をピックアップし、それを捨てるで5分間遠心分離機。500マイクロリットルの冷たい1X PBSを加えて細胞を再中断し、5ミルフローサイトメトリーチューブに入れます。氷の上に保管してください。サンプルを10マイクロリットル取り、エペンドルフチューブに90マイクロリットルのトリパンブルーと混ぜます。混合物の10マイクロリットルをネオバウアーチャンバーに加え、顕微鏡で細胞を数えます。細胞を読み取る細胞をサイトメーターで取り、興味のある母集団を選択した結果を分析します。この手順では、魚を安楽死させ、腎臓を体内に取り付けたまま内臓を取り除きます。次に、コルクの表面にボディの壁を固定し、固定溶液の上にフェージングを配置します。一晩で4度に保ちます。翌日、細かい鉗剤で腎臓を解剖する。それを混乱させないようにしてください。1X PBSの小さなシャーレまたはエペンドルフチューブに入れ、洗いすります。PBSを変更し、彼らがしっかりと処理する前に腎臓の支持マトリックスを生成するために2%アガロースを準備します。残りのPBSをすべて捨て、アガロースをゆっくりと注ぎます。次に、腎臓を細かい鉗子で配置し、折り畳むのを防ぎます。アガロースを室温で固めます。アガロース固化後、メスを使って小さな立方体を形成する腎臓の周りにアガロースを切断する。アガロースキューブを組織学的カセットの中に入れ、組織をパラフィンに埋め込むために組織学的処理のために送ります。パラフィンブロックは、その後、5ミクロンの厚さのセクションにカットします。ワックスを取り出し、蒸留水に入れておきます。暗いインキュベーターチャンバーを準備し、底に濡れたペーパータオルを置きます。スライドを暗室に入れ、組織の透過性のためにプロテアーゼKを加えます。37°Cで30分間インキュベートします。サンプルをインキュベートしながら、TUNEL反応混合物を調製し、450マイクロリットルのラベル溶液に50マイクロリットルの酵素溶液を添加して調製する。そして、光から保護してください。暗い部屋を拾い、1つの1X PBSでスライスを2回洗います。次に、スライドを乾燥させ、TUNEL反応混合物上で乾燥させます。そして、2時間摂氏37度でインキュベートします。インキュベーション後、このスライドを1回の1倍PBSで再び洗います。そして核カウンター染色のためのDAPIを加える。光から保護された5分間室温でインキュベート。1回1X PBSで3回リンスします。そして、アンチフェード親水性培地でスライドを成形します。カバースリップを置きます。そして、マニキュアでシール。蛍光顕微鏡でサンプルを可視化します。このグラフでは、0.9%の塩化ナトリウムのみを注入した対照と比較して、シスプラチンが魚の生存に対する用量応答効果を有することを確認することができる。このグラフの赤い線は、このビデオで使用されるグラム当たり120マイクログラムの線量を表しています。これらの用量は、男性と女性に適用することができます, それらの間に統計的な違いは見つからなかったので、.フローサイトメトリーは、組織に存在する異なる細胞を定量化することを可能にする。造血細胞集団は、サイズまたは前方散乱および粒度またはサイズ散乱によっていくつかの魚の腎臓で同定される。このようにして、赤血球、リンパ球、顆粒球、造血前駆体で集団を分離することが可能です。ここで、顆粒球、シングルトおよびMPO陽性細胞を選択する現在のゲート戦略は、骨髄ペルオキシダーゼの蛍光発現によって特徴付ける腎臓における好中球の集団を見つけることを可能にする。この場合、シスプラチンの注射は、腎臓に存在する好中球の割合の増加を誘導した。TUNELアッセイは、蛍光顕微鏡で腎臓の組織スライドを観察することによって組織中のアポトーシス細胞を検出することを可能にし、いくつかの細胞の核内のアポトーシスシグナルを赤色で見ることができる。このようなDAPIの核染色によって対照的に、ここは青で。シスプラチン注射は、腎臓におけるアポトーシス細胞の存在を増加させ、手動でまたは画像ソフトウェアを使用して定量することができる。このビデオの最後に、あなたは、成人シマウマの魚の急性腎臓損傷を誘発するためにシスプラチンの用量を注入し、調整する方法を知ることができるはずです.そして、異なる目的のために腎臓を解剖する方法。フローサイトメトリーは、ラボ内のトラトラベスラインの可用性に依存するさまざまな細胞タイプのプロファイルを理解するのに役立つ優れたツールです。抗体を使用してすべての細胞タイプにラベルを付ける場合は、トランスポーターラインの色を考慮してください。TUNELアッセイは、アポトーシス細胞や組織を検出できるシンプルなツールで、顕微鏡だけでなくフローサイトメトリーでも解析できます。必ず、手順全体で個人用保護具を使用してください。

Research

JoVE Journal

Medicine

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