Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) og Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finanskode 001. Vi takker våre samarbeidspartnere ved Laboratoriet til Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno's og Zebrafish Facility of the Genetics and Evolutionary Biology Department, i Bioscience Institute ved University of São Paulo. Vi takker Cristiane Naffah de Souza Breda og Theresa Raquel de Oliveira Ramalho for kommentarene og forslagene til manuskriptet. Vi setter stor pris på og takker Marcio Villar Martins, fra multimediateamet til Institute of Biomedical Sciences, for innspilling, utgave og produksjon av denne videoen.

Prosedyrene beskrevet i denne protokollen ble tidligere godkjent for bruk i sebrafiskmodellen av Animal Use Ethics Committee ved Institutt for biomedisinske vitenskaper ved Universitetet i São Paulo.
1. AKI-induksjon ved Cisplatin intraperitoneal injeksjon
<ol><li>Forbered cisplatin arbeidsløsning ved å fortynne lagerløsningen til 850 μg / ml i 0,9% NaCl. Oppbevars ved romtemperatur, beskyttet mot lys. FORSIKTIG: Fabrikanten anbefaler manipulering av cisplatin med personlig verneutstyr (PVU) inkludert vernebriller, hansker og labfrakk. Oppbevar lagerløsningen ved romtemperatur, beskyttet mot lys.</li>
	<li>Forbered 150 mg/L MS-222 (Tricaine) bedøvelse i systemvann45. Bedøv voksen sebrafisk (5-9 måneder) ved nedsenking i ca. 1-2 min. MERK: Effektivt bedøvet fisk bør være uansvarlig å berøre. For å teste effektiv anestesi, trykk forsiktig på kaudalfinen for å observere reaksjon. FORSIKTIG: Trikain er irriterende for hud og øyne, bruk PVU til å manipulere.</li>
	<li>Ved hjelp av en plastskje overføres fisken til en absorberende overflate, for eksempel papirhåndklær, for å fjerne overflødig vann rundt kroppen. Deretter, med plastskjeen, overfør fisken til en Petri-tallerken over en skala og vei fisken. Legg merke til fiskens vekt, da det vil være nødvendig for doseberegninger. MERK: Absorbering av overflødig vann fra fisk forhindrer overestimering av dyrets vekt, ikke overtørk siden det er fordomsfullt for fisken.</li>
	<li>For å oppnå den endelige dosen på 120 μg/g vekt, del μg av den endelige dosen (120 μg) per μg av cisplatin arbeidsløsningen (850 μg) og konverter dette tallet til mikroliter (μL) ved å multiplisere for 1000, for å få volumet på 120 μg cisplatin (141,2 μL). Multipliser deretter dette tallet (141,2 μL) for fiskens vekt (g) for å få det endelige volumet som skal injiseres.</li>
	<li>Med en plastskje, overfør fisken på en våt svamp med et lite kutt for å holde den, med ventralsiden opp. Svampen skal være våt med bedøvelse i systemvann.</li>
	<li>Fyll en 31 G 1,0 ml insulinsprøyte med beregnet volum cisplatin arbeidsløsning.</li>
	<li>Sett nålen inn i dyrets intraperitoneale del nær bekkenfinnen, i en grunn vinkel for å unngå å punktere viscera (Figur 2A). Injiser deretter løsningen langsomt.</li>
	<li>Etter injeksjon plasser fisken i en tank for å gjenopprette fra anestesi. Se fisken etter tegn på normal utvinning(f.eks. svømmebevegelser, operkulære bevegelser). MERK: Dyret skal komme seg i løpet av de neste 3-5 min. Om nødvendig stimulere fisken ved å flytte den med en plastskje, en Pasteur plastpipette, eller legg den nær en slange med bobler.</li>
	<li>For kontrollfisk, utfør samme prosedyre ved å injisere en løsning på 0,9% NaCl. Bruk samme beregning etter andelen kroppsvekt: volumet som skal injiseres vil bli 141 μL multiplisert med fiskens vekt (g).</li>
	<li>Overvåk overlevelsen av fisk minst to ganger om dagen i de påfølgende dagene (Figur 2B).</li>
</ol>2. Nyreisolasjon og vevsbehandling for strømningscytometri av immunceller
<ol><li>For denne prosedyren, bruk immuncelle-fluorescerende merkede transgene dyr (f.eks., Tg (mpo:GFP)).</li>
	<li>Etter 24 hk av 120 μg/g cisplatin, avlive dyr ved hypotermisk sjokk (rask kjøling). MERK: Hypotermisk sjokk har vist seg å være mer effektivt som eutanasimetode enn MS-222 overdose. Hypotermisk sjokk er mindre stressende, raskt, konsistent og tryggere for personell enn bruken av MS-222, har tidligere beskrevet46,47.</li>
	<li>I en ytre kryssingstank forbereder isvann i et 5:1-forhold mellom is og systemvann, legg den indre tanken med en skjerm over isen, vent til vannet når 2-4 °C. MERK: Fiskene skal ikke være i direkte kontakt med isen, da dette kan forårsake termiske brannskader og smerter.</li>
	<li>Overfør dyr til isvann, vent minst 10 min til det er tap av orientering og ingen operkulær bevegelse.</li>
	<li>Med en plastskje legger du fisken på papirhåndklær for å tørke av overflødig vann.</li>
	<li>Overfør fisken til en 3% agarose disseksjonsplate og ta den under et stereoskop med øvre lys. Med saks, halshugge fisk som gjør et raskt kutt like bak øynene, og fjern hodet.</li>
	<li>Med fin saks gjør et kutt fra den åpne siden til cloaca og fjern de indre organene med fine tang.</li>
	<li>Bruk insektpinner for å klemme sidene av kroppsveggene for å åpne slaktkroppen og eksponere nyrene festet til ryggraden.</li>
	<li>Løsne nyrene med fine tang og legg orgelet i en 6 brønnplate med en kald løsning på 1x PBS / 2% FBS. Hold deg på isen.</li>
	<li>Plukk opp vevet med en Pasteur plastpipette og før vevet gjennom en 40 μm cellesil over et 50 ml rør, og macerer det forsiktig med et sprøytestempel.</li>
	<li>Vask to ganger med 1 ml 1x PBS/2% FBS og samle cellene i et 50 ml rør.</li>
	<li>Sentrifuger celler ved 400 × g i 5 min ved 4 °C.</li>
	<li>Plukk forsiktig opp all supernatanten med en 1 ml mikropipette og kast den. Tilsett 500 μL kald 1x PBS for å resuspendere cellene og plassere dem i 5 ml strømningscytometrirør. Hold deg på isen.</li>
	<li>Tell celler i Neubauer-kammeret som gjør en 1:10 fortynning i Trypan Blue (f.eks.ta 10 μL av prøven og bland med 90 μL Trypan Blue). Tilsett 10 μL av blandingen til et Neubauer-kammer og tell celler under mikroskopet. MERK: Optimale resultater forventes med 1-5 x 106 celler /ml og >80% levedyktighet. FORSIKTIG: Trypan blue er et kreftfremkallende middel, bruk PPE til å håndtere.</li>
	<li>Ta cellene som skal leses av et cytometer. Analyser deretter resultatene som velger populasjonen av interesse.</li>
</ol>3. Behandling av voksen sebrafisk nyrevev for TUNEL analyse
<ol><li>For denne prosedyren, bruk villtype dyr (f.eks., AB, Tübingen, etc.) eller et transgent dyr med forskjellig fluorescerende farge enn TUNEL-settet, da lignende fluorescens kan forstyrre TUNELs analyse.</li>
	<li>Etter 24 hk av 120 μg/g cisplatin, avlive dyr ved hypotermisk sjokk (rask kjøling). Se 2.3-2.4.</li>
	<li>Disseker fisken som beskrevet i 2,5-2,6; nyrene må forbli festet til ryggraden under fikseringsprosedyren (forklart nedenfor).</li>
	<li>Bruk insektpinner, klem sidene av kroppsveggene for å åpne slaktkroppen og fest den på en korkoverflate for å holde nyrene utsatt. MERK: Denne prosedyren sikrer at nyrene forblir i riktig posisjon for senere analyse.</li>
	<li>Plasser deretter korkoverflaten med nyrene vendt ned i en 6 brønnplate over en nylaget løsning på 4% paraformaldehyd (PFA). Oppbevar den over natten ved 4 °C. FORSIKTIG: PFA er kreftfremkallende og irriterende for hud og slimete overflater. Forbered PFA-løsninger under en kjemisk hette ved hjelp av PVU, inkludert øyebeskyttelsesutstyr.</li>
	<li>Neste dag dissekerer nyrene som i 2,8. Legg nyrene i en 60 mm Petri-tallerken med 1x PBS og skyll to ganger i 1x PBS.</li>
	<li>Forbered 2% agarose for å generere en støttematrise for vevet.</li>
	<li>Kast alle gjenværende 1x PBS fra Petri-parabolen og hell 2% agarose sakte for å dekke hele orgelet. Plasser deretter nyrene ved hjelp av fine tang under et stereomikroskop for å forhindre at nyrene brettes. La agarose størkne ved romtemperatur. MERK: Denne prosedyren vil holde organets orientering og form gjennom histologisk behandling siden den bladlignende formen på orgelet forårsaker en tendens til å brettes hvis den ikke er inne i en støttende matrise.</li>
	<li>Etter agarose størkning, bruk en skalpell for å kutte agarose rundt vevet, danne små terninger, og fjern overskuddet av agarose rundt vevet.</li>
	<li>Plasser agarose kubene i en kassett egnet for histologisk behandling. MERK: Følgende trinn kan gjøres manuelt eller i en automatisk vevsprosessor.</li>
	<li>Først behandler du vevet i kassetten ved å følge de neste trinnene i 45 minutter hver ved romtemperatur: ett bad med 50% etanol, ett bad på 70% etanol, to påfølgende bad på 95% etanol og tre påfølgende bad på 100% etanol. Deretter behandler vevet i to påfølgende bad av Xylen og tre påfølgende bad av paraffin; sistnevnte varer 1 time hver ved 60 °C. FORSIKTIG: Gjør endringer under en kjemisk hette, damper fra etanol og xylen er irriterende og giftige.</li>
	<li>For å forberede parafinblokker, smelt parafin linser til 60 °C.</li>
	<li>Åpne plastkassetten med vevet inni og hold den på en varm tallerken. Oppvarming av metallformer til paraffin.</li>
	<li>Med pinsett plasser vevet over en metallform slik at nyrelengden er parallell med muggbasen. Tilsett paraffin, omfordel vevet om nødvendig.</li>
	<li>Dekk formen med bunnen av kassetten og legg til paraffin til rutenettet er dekket. La størkne ved romtemperatur og plasser deretter ved -20 °C for en raskere størkningsprosess.</li>
	<li>Løsne parafinblokken fra metallformen rundt 20-30 min senere.</li>
	<li>Med en mikrotom, seksjon vevet innebygd i paraffin til 5 μm tykkelse. Bruk silaniserte eller positivt ladede glasssklier for å samle vevet.</li>
</ol>4. TUNEL-analyse
MERK: Følgende protokoll bruker et In Situ Cell Death Detection Kit (materialfortegnelsestabell).
<ol><li>Dewax vev lysbilder plassere dem i to påfølgende bad av xylen i 5 min. Deretter rehydrerer vevet gjennom en gradert serie etanol: 100% -95% -70% -50%, i 5 min hver.</li>
	<li>Plasser sklier i rennende kaldt vann fra springen for å skylle av etanolet. Oppbevar skliene i destillert vann.</li>
	<li>Forbered et mørkt inkubatorkammer. Tilsett våte papirhåndklær på bunnen for å holde fuktigheten under inkubasjonstrinnene. MERK: Mangel på inkubatorkammer er mulig å bruke en Petri-tallerken med fuktig papir i bunnen og to tannpirkere for å plassere lysbildet.</li>
	<li>Forbered fersk Proteinase K arbeidsløsning:10 μg/ml i 10 mM Tris/HCl, pH 7,4-8. MERK: Proteinase K brukes som et permeabiliseringsmiddel, som anbefalt av fabrikanten.</li>
	<li>Plasser lysbildene i det mørke inkubatorkammeret og tilsett Proteinase K arbeidsløsning til dekselprøver. Inkuber i 30 min ved 37 °C.</li>
	<li>Mens prøver inkuberer, klargjør tunel reaksjonsblandingen: Tilsett 50 μL enzymoppløsning til 450 μL etikettløsning. Beskyttes mot lys. MERK: Volumet som skal klargjøres, kan justeres i samme andel på 1:10. Volumet beregnes til å være 50 μL av blandingen for hver seksjon; Dette kan endres avhengig av størrelsen på eksemplene.</li>
	<li>Plukk opp det mørke kammeret og vask lysbildene to ganger med 1x PBS.</li>
	<li>Tørk deretter regionen rundt prøven ved hjelp av absorberende papir og tilsett 50 μL TUNEL reaksjonsblanding over hvert vevssklie, spre løsningen slik at hele prøven er dekket. Inkuber ved 37 °C i 2 timer. Beskyttes mot lys.</li>
	<li>Etter inkubasjon, skyll lysbildet tre ganger med 1x PBS og tørk regionen rundt prøven ved hjelp av papirhåndklær.</li>
	<li>Tilsett 50 μL DAPI 1:1000 i prøvene, for kjernefysisk motspenning og inkuber i 5 minutter ved romtemperatur. Beskyttes mot lys.</li>
	<li>Skyll igjen tre ganger med 1x PBS og tørk regionen rundt prøven.</li>
	<li>Monter lysbildet med et anti-fade hydrofilt medium, legg en dekslelip og tetning med neglelakk. Oppbevar sklier horisontalt, beskyttet mot lys ved 4 °C. MERK: Monteringsmediets antifadeegenskaper er for å bevare fluorescensen til prøvene, men er mulig å bruke ethvert hydrofilt medium som er tilgjengelig. Det siste tetningstrinnet med neglelakk er avgjørende for å unngå dehydrering.</li>
	<li>Visualiser prøvene under et fluorescensmikroskop. For denne typen fluorescerende pigment, bruk en eksitasjonsbølgelengde i området 520-560 nm (grønn) og deteksjon i området 570-620 nm (rød).</li>
</ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Utbredelsen av nyresykdom har fortsatt å øke over hele verden, og blir et globalt folkehelseproblem som rammer millioner av mennesker63. Å finne en måte å behandle nyre skadede individer er av avgjørende betydning, så vel som å forstå mer om deres etiologi og progresjon. Flere studier har brukt dyremodeller for å forstå nyreskader. Sebrafisk nyre (Figur 1) har blitt studert i årevis i utviklingsbiologi og skadeforskning på grunn av sin selvregenererende kapasitet og genetiske likhet29,64. Her presenterer vi en ny AKI-modell i voksen sebrafisk ved hjelp av egenskapene til cisplatin som nefrotoksisk middel, som beskriver trinnene for å oppnå en rask og akutt reaksjon med skade synlig så snart 24 hpi (Figur 2). Videre forklarer vi her to teknikker som vil bidra til evaluering av vevsskaden etter cisplatinin-injeksjonen, strømningscytometri og TUNEL (figur 3).
Nåværende AKI-modeller i voksen sebrafisk inkluderer i.p. injeksjon av gentamicin som induserer omfattende skade i nephron og tubule ødeleggelse, neonephrogenesis hendelser starter fra dag 5, og regenerering er fullført med 21 dager etter injeksjon65. På den annen side ble en modell av sepsis-assosiert akutt nyreskade (S-AKI) etablert av infeksjonen med Edwardsiella tarda, siden betydelig økt uttrykket av AKI-markører, som insulinlignende vekstfaktorbindende protein-7 (IGFBP7), vevshemmer av metalloproteinaser 2 (TIMP-2) og nyreskademolekyl-1 (KIM-1), i larver og voksen sebrafisk6. Sebrafisken er kjent for å være et høygjennomstrømningsdyr for søking av terapeutiske midler, og dette inkluderer bruk av probiotika og mikrobiota-avledede metabolitter for å studere nyrefunksjon og regenerering67. De tilgjengelige modellene kan imidlertid direkte påvirke utfallet av disse behandlingene. Dermed etablerte vi en annen metode for å indusere AKI i voksen sebrafisk (figur 4), ved hjelp av cisplatin som et kjent nefrotoksisk middel som ikke ville ha direkte kjente effekter på fiskens mikrobiota, som gentamicinmodellen for å være et antibiotika, eller infeksjonen med E. tarda, for å være en sepsismodell. Men samtidig som vi utviklet cisplatinprotokollen vår, utforsket en annen gruppe også nefrotoksiske effekter av cisplatin hos voksen sebrafisk, og forenklet dosen til 10-20-30 μg per dyr68. Selv om de også viste cisplatin doseavhengig effekt i overlevelse, anbefaler vi forsiktighet ved bruk av en enkelt mengde cisplatin for alle fisk, da sebrafisk fra samme alder kan ha svært forskjellige størrelser og vekt, og dette kan indusere variasjoner i resultatene69,70. Vi tror det er viktig å justere dosen til dyrets tilsvarende vekt, som det gjøres hos mus og denne studien.
I våre eksperimenter med voksen sebrafisk viste cisplatin en doseresponseffekt. Dette ble visualisert ved å overvåke overlevelsesraten til dyrene etter cisplatinininjeksjon (figur 5). Vi brukte overlevelse som en måte å estimere intensiteten av dosen av cisplatin og ikke som et mål på nefrotoksisitet, da ingen andre fysiske tegn er synlige i løpet av overvåkingstiden. Dette kan sammenlignes med gnagere, hvor alvorlighetsgraden av nyreskaden kan moduleres ved dosering og hyppighet av cisplatin injeksjon15, oppnå dødelige doser med høyere konsentrasjoner av cisplatin71. Døde er også sett i de følgende dagene i larvalmodellen av cisplatin72. Siden vårt mål var å indusere en akutt skade på få dager, valgte vi 120 μg / g dose cisplatin som mulig for å observere nyreskade 24 timer etter injeksjonen, men dette kan justeres avhengig av målene i studien.
Hos mennesker diagnostiseres AKI klinisk ved redusert glomerulær filtreringshastighet (GFR), forhøyet serumkreatinin og blodurea nitrogen3. I sebrafisk inneholder repertoaret til AKI-modeller noen genetisk betingede modeller73,74 og noen legemiddelrelaterte modeller65,72, men som noen av AKI funksjonelle parametere kan ikke måles på sebrafisk på grunn av tekniske vanskeligheter(f.eks. blodsamling), vedtar de fleste forskning morfologiske og visuelle teknikker for å observere egenskapene til AKI1,75 som vår studie.
Hos gnagere kommer cisplatin inn i epitelcellene i de proksimale og distale tubuliene, inne i cellen gjennomgår metabolsk aktivering og blir svært reaktivt som virker på celleorganeller og induserer endringer i cellestrukturen. Disse endringene kan indusere apoptose og autofagi og til og med nekrose, ved svært høye doser. Som svar på denne skaden frigjøres mange cytokiner og leukocytter rekrutteres som fører til betennelse og påvirker funksjonaliteten til orgelet15. Dette understreker viktigheten av å vurdere hvilken type celler som finnes i den skadede nyren, som innbyggere eller infiltrerte immunceller. Her viste vi hvordan du vurderer dette ved strømningscytometri, ved hjelp av de transgene immunreporterlinjene som er tilgjengelige i dag (Tabell 1). Cisplatin økte prosentandelen nøytrofiler (mpo:GFP positive celler) i nyrene 24 timer etter injeksjonen (Figur 6). Når det gjelder sebrafisken, er nyrene nisjen til HSC-er som gir opphav til forskjellige blodcelletyper. Likevel sirkulerer mange granulocytter og makrofager normalt i blodet. I vårt eksempel brukte vi mpo: GFP transgen linje som uttrykker GFP under promotoren av myeloperoxidase av nøytrofiler52. Opprinnelige studier av mpo: GFP transgen linje demonstrert uttrykk for myeloperoxidase i ulike tilstander av nøytrofil modning76, men vår gate strategi fokusert på granulocytt brøkdel som består av modne celler som kommer fra blodet52, på denne måten vår analyse inkluderer infiltrerte celler og ikke bosatte celler. Dette er viktig å vurdere når du isolerer ønsket cellepopulasjon.
Som forklart ovenfor er apoptose den mest klassiske markøren for cisplatin-relatert AKI. Her demonstrerte vi en enkel protokoll for lokalisering av døde celler av TUNEL-analysen. Cisplatinininjeksjon økte antallet apoptotiske celler 24 hk (figur 7). Dette kan lett kvantifiseres ved å telle direkte de døde cellene fra vevet. Likevel, for identifisering av cellespesifikk død, kan bruk av antistoffer mot ønsket celle(f.eks. rørformede celler), eller bruk av en transgen reporterlinje brukes sammen med denne teknikken. Sammenlignet med den gentamicininduserte modellen av AKI, synes cisplatin å være en mer alvorlig modell, siden gentamicin apoptose var høyere på den tredje dagen etter injeksjon65.
Til tross for å ha en rekke bivirkninger, er cisplatin fortsatt mye brukt i kreftbehandling, på grunn av effektiviteten mot ulike typer kreft, inkludert karsinomer, bakteriecelletumorer, lymfomer og sarkomer77. Nefrotoksisitet forekommer hos en tredjedel av pasientene i behandling med cisplatin10, og dermed er søket etter strategier som kan redusere denne effekten og øke renoprotection viktig. Vi tror at metodene og teknikkene som presenteres i dette manuskriptet vil bidra til å belyse mekanismer for nyreskade og finne terapeutiske mål som kan være avgjørende for å forbedre livskvaliteten til personer som lider av nyrekomplikasjoner, hovedsakelig de som er relatert til bruk av cisplatin.

Nyrene er ansvarlige for flere viktige fysiologiske funksjoner som opprettholder homeostase, for eksempel blodfiltrering, fjerning av overflødige rester og regulering av ionkonsentrasjoner1. Skade på nyrevev kan føre til en heterogen tilstand kalt Akutt nyreskade (AKI), som klinisk beskrives som en rask reduksjon i nyrefunksjon forårsaket av ødeleggelse og død av rørformede epitelceller, endotelcelleskade og leukocyttinfiltrasjon 2,3. AKI er en tilstand som forventes å skje i 8-16% av sykehusinnleggelser4, med en høy dødelighet som varierer fra 20 til 50% på intensivavdelingen (intensivavdelingen)5. Denne sykdommen er forbundet med økt sykehusopphold og betydelig bruk av økonomiske ressurser5. Etiologiske faktorer inkluderer dehydrering, sjokk, infeksjoner, sepsis, kardiovaskulær sykdom og nefrotoksiske legemidler6. Nefrotoksisitet er definert som en nyreskade indusert av narkotika, forårsaker effekter som AKI, tubulopatier og glomerulopatier7. Nefrotoksisitet påvirker to tredjedeler av intensivpasienter, da omtrent 20% av legemidlene som er foreskrevet på intensivavdelingen, regnes som nefrotoksiske8,9, dette inkluderer ikke-steroide antiinflammatoriske legemidler (NSAIDs), antibiotika som vancomycin og aminoglykosider, og kjemoterapeutiske midler som metotreksat og cisplatin7. Cisplatin er et av de mest potente og vanlige kjemoterapimedisinene, som brukes til behandling av faste svulster, som hode og nakke, testikkel, eggstokk og blære10. I nyrene internaliseres cisplatin i det proksimale konvoluterte røret (PCT) gjennom den organiske kationiske transportøren 2 (OCT-2) og i høye konsentrasjoner binder seg til DNA-utløsende celledødsveier7,10,11,12. Akkumuleringen av dette stoffet i nyrene bidrar til nefrotoksisitet med død og betennelse13. Denne skadelige bivirkningen påvirker enormt livet og prognosen til en tredjedel av kreftpasienter som gjennomgår cisplatinbehandling, så det er viktig forskningen på nye terapier som kan senke nefrotoksisiteten uten å miste drapseffekten på kreftceller10.
På grunn av denne nefrotoksiske effekten brukes cisplatin ofte som en induktor av AKI i eksperimentelle dyremodeller, som beskrevet fremover. Hos gnagere ble den første AKI-modellen indusert av cisplatin rapportert i 197114, men for tiden har mange forskjellige protokoller dukket opp ved hjelp av de doseavhengige og kumulative effektene av cisplatin15. Dermed, avhengig av dosering og antall applikasjoner, kan forskjellige karakterer av alvorlighetsgraden av nyreskade induseres16,17,18,19,20,21. Den hyppigste metoden består av en intraperitoneal (i.p.) injeksjon av en dose cisplatin etterfulgt av eutanasi i de følgende dagene. I denne klassiske protokollen induserer en enkelt høy nefrotoksisk dose cisplatin (10-13 mg/kg hos mus og/eller 3-8 mg/kg hos rotter) alvorlige histologiske endringer, som tap av børstekant og celleavfall inne i den rørformede lumen, noen dager etter cisplatinininjeksjon. Alvorlighetsgraden av histologiske endringer er doseavhengig, og tegn på regenerering observeres 7 dager etter cisplatin injeksjon16,17.
Selv om gnagermodeller er godt etablert, bestemte vi oss for å dra nytte av egenskapene til en annen virveldyr, med fokus på sebrafisken (Danio rerio). Denne fisken har blitt mye brukt til modellering av menneskelige sykdommer, på grunn av sin lille størrelse, ekstern befruktning, høye reproduksjonshastigheter, rask utvikling, gjennomsiktighet av embryoer og larver, lav vedlikeholdskostnad, lignende anatomi som pattedyr (med noen unntak), høy vevsregenereringskapasitet, sosial atferd, 70% genetisk likhet med mennesker og 84% med menneskelige sykdommer-assosierte gener22. Streisinger et al.23,24,25 startet studiene med sebrafisk som bekreftet praktiseringen av å bruke denne modellorganismen for genetisk analyse av virveldyrutvikling. I nyreforskning har sebrafisken dukket opp ikke bare i utviklingsstudier, men også som et genetisk verktøy i søket etter nye gener knyttet til nyreforhold26. Videre gjør regenereringskapasiteten uten arrdannelse og evnen til å generere nefroner gjennom livet, kalt neonephrogenesis, sebrafisken til en nøkkeldyrmodell for regenereringsforskning27,28. Videre viser tilgjengeligheten av eksperimentelle modeller for forskjellig nyresykdom, inkludert akutt og kronisk nyreskade, allsidigheten til denne eksperimentelle organismen26,29. Som hos pattedyr, er renal forfedre av sebrafisken avledet fra mellomliggende mesoderm. Slike nyregenitorer genererer de utsattephros som senere vil utvikle seg til mesonephros, som vil bli opprettholdt som et modent organ til voksen alder29,30.
Den voksne sebrafisk nyre ligger på kroppens dorsale vegg, mellom svømmeblæren og ryggraden29. Fra ventral visning kan sebrafisken segmenteres i tre regioner (Figur 1A): hode (H), bagasjerom (Tr) og hale (Ta)29. Samme som pattedyr, har sebrafisken nephrons som funksjonelle enheter av nyrene, som er delt inn i tubule segmenter (Figur 1A): nyrekorpuskel (RC), proksimal konvolutert tubule (PCT), proksimal rett tubule (PST), distal tidlig (DE), sen distal (DL) og samle kanal (CD)29. Sebrafisk deler genetisk bevaring og strukturelle likheter med menneskelige nephrons (Figur 1B), men mangler noen konformasjoner som mellomliggende tubule, også kjent som løkken til Henle (LH)29,31. Ferskvannsfisk som sebrafisk er normalt omgitt av et medium med svært lav osmolaritet, på grunn av dette har de en tendens til å være hyperosmotiske og avhenger av gjellene, huden i tidlige stadier og nyrene for å regulere osmolaritet og vannutskillelse32. Filtreringen av blod fra dorsal aorta av pronephros begynner rundt 48 h etter befruktning (hpf)33,34. Nyrene i sebrafisken er ikke bare et metabolsk avfallsutskillelsesorgan, men fungerer også som et hematopoietisk organ fra 4 dager etter befruktning (dpf) til voksen alder, og det tilsvarer benmargen hos pattedyr35. Under utviklingen vil hematopoietiske stamceller (HSC) frø nyrene, selvrenovere og generere myeloid, erythroid og lymfoide celleavstamninger, opprettholde transkripsjonsfaktorer, signalmolekyler og høyt bevarte genetiske programmer med pattedyr36,37. Studier har avslørt at de fleste erythroid, trombocytiske, myeloide og lymfoide celler i det menneskelige immunsystemet er til stede i sebrafisk37,38. De unike egenskapene til dette dyret og de konserverte egenskapene med den menneskelige nyre gjorde denne modellorganismen fordelaktig i forskningen på nyrefunksjon, skade og regenerering.
Selv om zebrafiskens nyre er godt studert og noen modeller av AKI allerede er tilgjengelige i larve og voksen sebrafisk28, på tidspunktet for etableringen av denne protokollen var det ingen bevis for en kjemisk indusert ikke-antibiotika AKI-modell i voksen sebrafisk. Foruten dette fokuserer laboratoriet vårt på å teste probiotiske bakterier og mikrobiota-avledede forbindelser for å studere regenerering og nyreskade, og dermed konsentrerte vi vår innsats for å skape en ny cisplatin-indusert AKI-modell hos voksne fisk. Videoartikkelen som presenteres i dette manuskriptet demonstrerer prosedyrene for en ny modell av AKI-induksjon ved hjelp av en i.p. injeksjon av 120 ug cisplatin per g dyr (120 μg/g) (Figur 2A). Denne dosen var opprinnelig basert på studier av AKI indusert av cisplatin i murinmodeller som gikk rundt 10 mg / kg (tilsvarende 10 μg / g)14,15,16,17, men denne dosen var ikke tilstrekkelig til å indusere nyreskade relatert til nefrotoksisitet (data ikke vist). Dermed økte vi dosen til de som ble brukt i denne studien (Figur 2B). Vårt arbeid avdekket en doseavhengig effekt av cisplatin i overlevelsesrate etter injeksjon med induksjon av nyrevevsskade 24 hpi som vist ved tap av rørformet struktur, økt inflammatorisk infiltrat og høy grad av celledød. Her beskriver vi to teknikker for å analysere utviklingen av cisplatin-indusert AKI: flowcytometri, for å analysere celleinfiltrasjon og TUNEL, for å måle celledød. Flow cytometri er en teknologi som måler de fysiske (størrelse og granularitet) og kjemiske (fluorescerende forbindelser) egenskaper av cellene. Inne i cytometeret går cellefjæringen gjennom en kappevæske som organiserer cellene i en enkelt linje, slik at de kan passere gjennom en laserstråle en celle om gangen (Figur 3A). En detektor foran lysstrålen vil måle Forward Scatter (FSC), som korrelerer med cellestørrelsen, og detektorer til siden vil måle sidespredningen (SSC) som korrelerer med cellenes granularitet. Andre detektorer vil måle fluorescensen fra partikler, fluorescerende proteiner eller antistoffmerkede celler39,40. Ettersom kommersielle antistoffer for sebrafisk er knappe i dag, gjør bruk av dyrereportere og fluorescerende biomarkører det mulig å forbedre denne analysen og identifisere forskjellige cellepopulasjoner41,42,43. Et annet verktøy som ble brukt i denne protokollen var Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) analyse. TUNEL-analysen er en senfase apoptosedeteksjonsmetode som er avhengig av TdTs evne til å identifisere fragmentert DNA og merke det med deoksynukleotider merket med en fluorescerende markør som senere kan visualiseres og kvantifiseres ved mikroskopi44 (figur 3B). Tatt i betraktning at en av de mest slående egenskapene til AKI er induksjon av apoptose i rørformede nyreceller3, er denne teknikken ekstremt fordelaktig siden den kan analyseres ved strømningscytometri og / eller mikroskopi.
Tilnærmingene som presenteres i denne artikkelen tillater observasjon av AKI-statusen og tilbyr en ny akutt modell for å studere AKI-lidelser som kan være nyttige for forskning av nye terapeutiske mål i cisplatin-relatert AKI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

Cisplatin brukes ofte som kjemoterapi. Selv om det har positive effekter hos kreftbehandlede individer, kan cisplatin lett akkumuleres i nyrene på grunn av sin lave molekylvekt. Slik akkumulering forårsaker død av rørformede celler og kan indusere utviklingen av akutt nyreskade (AKI), som er preget av en rask reduksjon i nyrefunksjon, vevsskade og immuncelleinfiltrasjon. Hvis det administreres i bestemte doser, kan cisplatin være et nyttig verktøy som AKI-induser i dyremodeller. Sebrafisken har dukket opp som en interessant modell for å studere nyrefunksjon, nyreregenerering og skade, da nyrestrukturer sparer funksjonelle likheter med pattedyr. Voksen sebrafisk injisert med cisplatin viser redusert overlevelse, nyrecelledød og økte betennelsesmarkører etter 24 timer etter injeksjon (hpi). I denne modellen kan immunceller infiltrasjon og celledød vurderes ved strømningscytometri og TUNEL-analyse. Denne protokollen beskriver prosedyrene for å indusere AKI i voksen sebrafisk ved intraperitoneal cisplatin injeksjon og deretter demonstrerer hvordan å samle nyrevev for strømning cytometri behandling og celle død TUNEL analyse. Disse teknikkene vil være nyttige for å forstå effekten av cisplatin som et nefrotoksisk middel og vil bidra til utvidelse av AKI-modeller i voksen sebrafisk. Denne modellen kan også brukes til å studere nyreregenerering, i søket etter forbindelser som behandler eller forhindrer nyreskade og for å studere betennelse i AKI. Videre vil metodene som brukes i denne protokollen forbedre karakteriseringen av vevsskade og betennelse, som er terapeutiske mål i nyrerelaterte komorbiditeter.

Nyrene i sebrafisken er et flatt pigmentert organ som ligger på dorsalveggen og dens grunnleggende funksjonelle enhet, nephron, er bevart med pattedyr (Figur 1). Spesielt ved å ha bare en nyre med høy regenereringskapasitet gjør denne modellorganismen til et utmerket valg for modell nyreskade. Protokollene som presenteres i dette arbeidet er utformet for å indusere AKI ved intraperitoneal (i.p.) injeksjon av cisplatin hos voksne sebrafisk (figur 2) og senere analyseres ved hjelp av to teknikker som er beskrevet før: flowcytometri (Figur 3A) og TUNEL (Figur 3B). Et flytskjema for hele prosessen er avbildet i figur 4. Dosene av cisplatin ble først brukt basert på de som er beskrevet i musemodeller15,16,17, der standarden som brukes er 10-13 mg cisplatin per kg dyr (mg / kg). Sebrafisken viste seg imidlertid å være mer motstandsdyktig mot cisplatin enn musen (data ikke vist), og den endelige dosen ble økt. Da vi evaluerte dyrenes overlevelsesrate, viste forsøkene en doseavhengig effekt av cisplatin (figur 5A). På grunn av dette anbefaler vi å følge instruksjonene nøyaktig som forklart i denne protokollen og overvåke overlevelsesraten til dyrene hele tiden som et mål på reproduserbarhet, før du samler noe materiale. Etter i.p. injeksjon av 120 μg/g cisplatin (Figur 5A, rød linje), ble det observert en reduksjon i overlevelse på rundt 30% av dyrene i de første 24 timer og overlevelsen redusert gradvis til de nådde rundt 20% av levende dyr på dag 5 etter injeksjon, deretter stabilisert ( Figur5A). Cisplatin toksisitet ble ikke påvirket av dyrets kjønn, siden menn og kvinner har lignende overlevelseskurver (Figur 5B).
Analyse av kinetikken til cisplatinindusert AKI viste økt betennelse og celledød i nyrene 24 hk. En av de raskeste og kvantitative måtene å evaluere betennelse på er strømningscytometri, men gitt mangel på antistoffer mot sebrafiskantigener tilgjengelig kommersielt for denne teknikken, er nødvendig å bruke en transgen linje med en immunmarkør. I dag er mange sebrafisklinjer som merker immunceller tilgjengelige (Tabell 1). Disse linjene kan brukes digitalt eller i kombinasjon, gitt nok repertoar til analyse48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Dette forenkler enormt teknikken siden det ikke er nødvendig noe antistoffinkubasjonstrinn, tvert imot, etter at cellene er isolert ved mekanisk separasjon, er direkte avlesning på cytometeret mulig.
Som nevnt tidligere er nyrene til sebrafisken ikke bare et blodfiltreringsorgan med homeostatiske funksjoner, men også det anatomiske stedet for hematopoiesis hos voksne, tilsvarende benmargen hos pattedyr33,34,35. På denne måten når vi analyserer det ved strømning cytometri er mulig å skille cellepopulasjoner som kan sammenlignes med det menneskelige blodet61,62 (figur 6A), lar dette oss identifisere cellepopulasjonene i utgangspunktet etter størrelse og granularitet og utelukke rusk. I dette tilfellet brukte vi en transgen linje kalt Tg(mpo:GFP)52 som uttrykker et grønt fluorescerende protein (GFP) sammen med enzymet myeloperoxidase, som er tilstede i nøytrofiler. Når vi visste dette, var portstrategien vår basert på den første separasjonen av granulocyttens befolkning (figur 6B). Etter dette ble doble celler utelukket, siden de kan endre analysen betydelig og føre til unøyaktige konklusjoner. En dobbel er en enkelt hendelse som består av to uavhengige partikler og kan utelates ved å velge en fremoverspredningshøyde (FSC-H) kontra et foroverspredningsområde (FSC-A) tetthetsplott (Figur 6C). Etter dette trinnet ble cellene som uttrykte fluorescerende markør identifisert og valgt (Figur 6D). Til slutt ble populasjonsstatistikken hentet ut fra analysen og tegnet inn som prosentandel av celler (Figur 6E).
En av de mest fremtredende egenskapene til cisplatin nefrotoksisitet er rørformet celledød10, og for å enkelt visualisere dette brukte vi TUNEL-analysen for apoptosedeteksjon. Denne metoden anbefaler å bruke ville celler og vev som mangler fluorescerende markører, siden parallell fluorescens vil forstyrre analysen, når det gjelder sebrafisk anbefales å bruke ville linjer, for eksempel AB, Tübingen, TAB eller en transgen linje med et fluorescerende protein som ikke forstyrrer TUNEL fluorescensfargen. TUNEL-teknikken tillater analysen via strømningscytometri eller mikroskopi. Mikroskopi har fordelen av å bevare vevsstrukturen, slik at man kan se hvilke celler som dør. Under det fluorescerende mikroskopet kan de lyse kjernene i apoptotiske celler lett skilles fra bakgrunnen. Dyr injisert med cisplatin (Figur 7B) har flere døde celler enn kontrollen (Figur 7A) ved 24 hk. Den endelige kvantifiseringen ble gjort med celletelleralternativet til FIJI Software og viste statistisk flere døde celler i cisplatinbehandlede nyrer enn i kontrollene (Figur 7C)
Protokollen beskrevet i dette manuskriptet viste hvordan man bruker cisplatin som induserer av AKI i voksen sebrafisk, som er dose-respondent, rask og pålitelig. Basert på dataene hentet fra overlevelsesrater og måling av tegn på nefrotoksisitet av cisplatin inkludert betennelse (påvist ved strømningscytometri) og celledød (påvist av TUNEL-analyse), foreslår vi denne modellen for studiet av cisplatin nefrotoksisitet samt for fremtidige behandlinger i AKI-relaterte sykdommer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig01.jpg"> Figur 1: Struktur og sammenligning av sebrafisk og menneskelige nyrer. A. (1) Lateral utsikt over en voksen sebrafisk med nyrene representert i mørk brun plassert i fiskens dorsale vegg, mellom svømmeblæren (sb) og ryggraden. (2) Ventral visning av nyrene som viser nefroner (gul) koblet til oppsamlingskanalen (blå). De forskjellige områdene i nyrene er flagget: hode (H), stamme (Tr) og hale (Ta). (3) Skjematisk som representerer sebrafisk nefroner og deres segmenter merket og farget for å matche genetiske bevarte regioner med menneskelig nefro. B. (1) Sagittal syn på en menneskelig nyre. (2) Skjematisk som skildrer en menneskelig nefron med segmenter merket og farget. RC: nyrekorpuskel; PCT: proksimal innviklet tubule; PST: proksimal rett tubule; TL: tynn lem; LH: Henles løkke; TAL: tykk stigende lem; DE: distal tidlig; DL: distal sent; DCT: distal innviklet tubule; CD: samle rør. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig01large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig02.jpg"> Figur 2: Eksperimentell design for cisplatinindusert AKI. A. Lateral og ventral visning av voksen sebrafisk som peker nålens posisjon under injeksjonsprosedyren. Nålen trenger inn i en 20-30 ° vinkel fra magen og settes sakte parallelt med ventralveggen for å unngå å punktere viscera. B. Eksperimentell design av cisplatin-indusert AKI: (1) Injeksjon av cisplatin 120 μg/g per dyr på dag null. (2) Før forsøk på trinn 3, anbefales overlevelsesovervåking av fisk etter injeksjon fra dag én til dag ti. (3) Nyre disseksjoner en dag etter cisplatin injeksjon for videre behandlingsteknikker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig02large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig03.jpg"> Figur 3: Mekanismer for strømningscytometri og TUNEL-teknikker. A. Oversikt over strømningscytometeret: En suspensjon av celler er hydrodynamisk fokusert på en enkelt linje av en hylsevæske, noe som får cellene til å passere en etter en foran en laserstråle. Detektorer foran og på siden måler fremoverspredningen (FSC), sidespredningen (SSC) og fluorescensen til cellene. B. Prinsippet om TUNEL-analyse. Terminal deoksynukleotidyloverføring (TdT) formidler tilsetningen av en fluorescerende merket dUTP til 3'-OH ender av et fragmentert DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig03large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig04.jpg"> Figur 4: Flytskjema for representerte teknikker. A. Et flytskjema som viser trinnene du må følge når du velger å analysere nyrevevet gjennom strømningscytometri (oransje) eller TUNEL (blå), når du induserer AKI ved cisplatinininjeksjon (grå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig04large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig05.jpg"> Figur 5: Overlevelsesovervåking av cisplatin injisert fisk. A. Overlevelsesrate for forskjellige doser av cisplatin injeksjoner (25 - 50 - 112,5 - 120 μg / g). Log-rank (Mantel-Cox)-test, ** p < 0,01. B. Overlevelsesrate for menn vs. kvinner injisert med 120 μg/g cisplatin. Log-rank (Mantel-Cox)-test, *** p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig05large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig06.jpg"> Figur 6: Portstrategi for transgen sebrafisklinje. A. Tetthet plott av sebrafisk voksne nyreceller, populasjoner er skilt etter størrelse (FSC-A) og granularitet (SSC-A). Ulike populasjoner velges av fargede ovaler/sirkler. Rosa: Erythroid; Svart: Lymfoid; Gul: Forløpere; Rød: Granulocytter. B. Tetthetsplott av sidespredningsområde (SSC-A) og fremoverspredningsområde (FSC-A) for valg av Granulocytterpopulasjon i nyrene. C. Tetthetsplott av fremover spredt høy (FSC-H) og fremover scatter område (FSC-A) for valg av singlets befolkning inne granulocyte gate. D. Tetthetsplott av fremoverspredningsområde (FSC-A) og FITC-A:MPO for valg av mpo:GFP positive celler (nøytrofiler) i nyrene. En positiv befolkning regnes som rundt 103 på, av fluorescensintensitet. E. Graf over prosentandelen av mpo:GFP positive celler (nøytrofiler) i Kontroll vs. Cisplatin dyr, 24 hpi . Ubetalt t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig06large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig07.jpg"> Figur 7: TUNEL-analyse av cisplatin injisert fisk. A. Mikrofotografer av fast voksen nyre 24 timer etter 120 μg/ g cisplatin injeksjon. Kontroller injiseres med 0,9 % NaCl. TUNEL positive celler (apoptotiske celler) er farget i rødt (hvite piler). DAPI (blå) brukes som kjernefysisk motstain. Skalastang: 50 μm. 20x forstørrelse. B. Graf som viser kvantifisering av antall døde celler i nyrene med 20x felt. Ubetalt t-test, * p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig07large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transgen linje</td>
			<td>Celletype merket</td>
			<td>Referanser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(spi1:EGFP)pA301</td>
			<td>Myeloid celler</td>
			<td>Avdeling et al. 200348
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(zpu1:GFP)</td>
			<td>Myeloid celler</td>
			<td>Hsu et al. 200449
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mhc2dab:GFP)sd6</td>
			<td>Monocytter</td>
			<td>Wittamer et al. 201150</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lysC:DsRED2)</td>
			<td>Nøytrofile</td>
			<td>Hall et al. 200751
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpo:GFP)</td>
			<td>Nøytrofile</td>
			<td>Mathias et al. 200652
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:mCherry)</td>
			<td>Makrofager</td>
			<td>Ellett et al. 201153
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:Dendra2)</td>
			<td>Makrofager</td>
			<td>Harvie et al. 201354
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lck:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Langenau et al. 200455
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TgBAC(ikaros:EGFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Bajoghli et al. 200956
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag1:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Jessen et al. 199957
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag2:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Jessen et al. 200158
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg (CD79:GFP)</td>
			<td>B-celler</td>
			<td>Liu et al. 201759
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(CD45:DsRed)</td>
			<td>Leukocytter</td>
			<td>Bertrand et al. 200860
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Sebrafisk transgene linjer for immunceller. Tabell som gjenopptar navnene på sebrafiskreporterlinjer med den respektive typen immuncelle merket og referanseartiklene der de ble konstruert. En kombinasjon av disse sebrafisklinjene kan gi nye muligheter for cellevalg ved strømningscytometri.

Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Denne protokollen beskriver prosedyrene for å indusere akutt nyreskade (AKI) hos voksne sebrafisk ved hjelp av cisplatin som nefrotoksisk middel. Vi detaljerte trinnene for å evaluere reproduserbarheten av teknikken og to teknikker for å analysere betennelse og celledød i henholdsvis nyrevevet, strømningscytometri og TUNEL.

Akutt nyreskademodell indusert av Cisplatin i voksen sebrafisk

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Det overordnede målet med denne prosedyren, forklares bruken av cisplatin som et nefrotoksisk middel i voksen sebrafisk, analyserer betennelse og celledød i nyrevev. For å oppnå denne og voksne sebrafisken bedøves og veies for å injisere i en bestemt dose cisplatin i bukhulen. Etter monitordødelighet blir nyrene dissekert og cellene er isolert for strømningscytometri eller fast og dissekert for å bli analysert av fluorescerende TUNEL-analyse.Følgende prosedyrer kan bidra til å svare på viktige spørsmål i nyrefeltet ved hjelp av nefrotoksiske effekter av cisplatin som et verktøy for å utvikle en akutt nyreskademodell og voksen sebrafisk. Denne modellen kan brukes til utforskning av nye terapeutiske mål i nyrebeskyttelse, samt belyse regenereringsmekanismen i sebrafiskren. Cisplatin er et kjemoterapimiddel som brukes til å behandle en rekke kreftformer.Imidlertid kan det lett akkumuleres i nyrene, generere celledød, betennelse og redusere nyrefunksjonen. Effekten av cisplatin er doseavhengig, slik at du kan redusere vår økning av dosering avhengig av dine mål. Teknikkene som brukes her for å analysere betennelse og celledød er ikke utelukkende for spredning av sykdomsmodellen.Strømningscytometri i sebrafisk kan bidra til å belyse dyrets inflammatoriske tilstander på en kvantitativ måte, mens vi ved TUNEL sier kan avklare tilstedeværelsen av poptosede celler i de fysiologiske og patologiske kontekstene. Før du starter eksperimentet, forberede cisplatin arbeidsløsning ved å fortynne lagerløsningen til 820 mikrogram per mil i 0,9% natriumklorid. Deretter bedøver du en annen sebrafisk og tørker av overflødig vann på noen papirhåndklær.Vei fisken ved å plassere dem på en skala, legg merke til vekten. Gjør beregningene for å vite det nøyaktige volumet som skal injiseres. For å oppnå dosen på 120 mikrogram per gram vekt, bruk neste formel.Del den endelige dosen med dosen av arbeidsløsningen og konverter dette tallet til mikroliter, ved å multiplisere for 1000 for å få volumet på 120 mikrogram cisplatin. Deretter multipliserer du dette tallet med fiskens vekt for å få det endelige volumet som skal injiseres. Legg en fisk på en våt svamp, med en liten kopp for å holde den.Med ventral side opp og fyll en insulin sprøyte med et beregnet volum cisplatin. Sett nålen på ventral midtlinje i en grunne vinkel, trekk forsiktig ventralveggen opp for å unngå punktering av indre organer. Og injiser deretter løsningen.Etter injeksjonen legger du en fisk i en tank for å gjenopprette fra anestesi, og vent på tegn på utvinning som svømming og passende bevegelser. Overvåk for det fiskene to ganger om dagen for de neste dagene. Ved denne dosen induserer cisplatin rundt 30% av dødeligheten de første 24 timene.Avlivet fisken og tørk av overflødig vann i et papirhåndkle. Etter å ha fjernet hodet og indre organer, bruk disseksjonsnåler for å feste kroppsveggene. Finn nyrene i fiskens dorsale vegg, og bruk tang for å løsne nyrene.Legg nyrene i en seks brønnplate med en kjølig løsning på en 1X PBS, 2% FBS og hold på is. Deretter plukker du opp vevet med litt væske og sender det gjennom en 40 mikroncellesil, og macerer forsiktig vevet med et sprøytestempel. Vask to ganger med en 1X PBS, 2% FBS.Og samle cellene i et 50 mils falkerør. Deretter sentrifugerer du i fem minutter ved 400 G.Forsiktig pickup supernatanten med en pipette og kast den. Tilsett 500 mikroliter kald 1X PBS for å suspendere cellene på nytt og plassere dem i et femmils strømningscytometrirør.Hold dem på is. Ta 10 mikroliter av prøven og bland den med 90 mikroliter trypanblå i et Eppendorf-rør. Tilsett 10 mikroliter av blandingen til et Neobauer-kammer og tell celler i mikroskopet.Ta cellene som skal leses av et cytometer, og analyser deretter resultatene som velger befolkningen av dine interesser. For denne prosedyren, euthanize en fisk og fjerne indre organer forlater nyrene festet til kroppen. Fest deretter kroppsveggene til en korkoverflate og plasser den fasing ned over fikseringsløsningen.Hold det fire grader over natten. Neste dag, disseker nyrene med fin tang. Prøv å ikke forstyrre det.Legg den i en liten petriskål eller Eppendorf-rør med 1X PBS for å skylle. Endre PBS og forberede 2% agarose å generere en støtte matrise for nyrene før de solid behandle. Kast all gjenværende PBS og hell agarose sakte.Plasser deretter nyrene med fine tang for å forhindre at den brettes. La agarose størkne ved romtemperatur. Etter agarose størkning, bruk en skalpell for å kutte Agarose rundt nyrene som danner en liten terninger.Plasser agarose kubene inne i en histologisk kassett og send den til histologisk behandling for å legge inn vevet i paraffin. Parafinblokkene, vi vil deretter kutte i fem mikron tykkelse seksjoner. De-voks glir og holder dem i destillert vann.Forbered et mørkt inkubatorkammer, legg våte papirhåndklær på bunnen. Plasser lysbildene i det mørke kammeret, og legg til Proteinase K for permeabilisering av vevet. Inkuber i 30 minutter ved 37 celsius grad.Mens prøver inkuberes, klargjør tunelreaksjonsblandingen ved å tilsette 50 mikroliter enzymoppløsning på 450 mikroliter etikettløsning. Og hold deg beskyttet mot lys. Plukk opp det mørke kammeret og vask skiven to ganger med en 1X PBS.Tørk deretter lysbildene og på TUNEL-reaksjonsblandingen. Og inkuber på 37 Celsius grad i to timer. Etter inkubasjon, vask disse lysbildene igjen med en 1X PBS.Og legg til DAPI for nuklei teller farging. Inkubering ved romtemperatur i fem minutter, beskyttet mot lys. Skyll tre ganger med en 1X PBS.Og deretter form lysbildene med et anti-fade hydrofilt medium. Sett en dekkslipp. Og forsegle med neglelakk.Visualiser prøvene i et fluorescerende mikroskop. I denne grafen er det mulig å se at cisplatin har en doseresponseffekt på fiskens overlevelse, sammenlignet med en kontroll som bare injiseres med 0,9% natriumklorid. Den røde linjen i denne grafen representerer en dose på 120 mikrogram per gram som brukes i denne videoen.Disse dosene kan brukes på menn og kvinner, da det ikke ble funnet noen statistisk forskjell mellom dem. Flow cytometri gjør det mulig å kvantifisere forskjellige celler som er tilstede i et vev. Hematopoietiske celler populasjoner er identifisert i flere fisk nyre etter størrelse eller fremover spredning og granularitet eller størrelse spredning.På denne måten er det mulig å skille bestandene i erytrocytter, lymfocytter, granulocytter og hematopoietiske forløpere. Her tillater den nåværende portstrategien å velge granulocytter, singlets og MPO positive celler å finne befolkningen i nøytrofiler i nyrene preget av fluorescensuttrykket til myeloperoxidase. I dette tilfellet induserte injeksjonen av cisplatin økningen i prosentandelen nøytrofiler som er tilstede i nyrene.TUNEL-analysen tillater å oppdage apoptotiske celler i et vev ved å observere vevssklie av nyrene ved et fluorescensmikroskop, det er mulig å se apoptotisk signal inne i kjernen av noen celler, her i rødt. I kontrast til en kjernefysisk flekk i en slik DAPI her i blått. Cisplatin injeksjon økte tilstedeværelsen av apoptotiske celler i nyrene, som er mulig å kvantifisere manuelt eller ved hjelp av en bildeprogramvare.På slutten av denne videoen bør du kunne vite hvordan du injiserer og justerer dosen av cisplatin for å indusere akutt nyreskade hos voksen sebrafisk. Og hvordan å dissekere nyrene til forskjellige formål. Flowcytometri er et utmerket verktøy som vil hjelpe deg å forstå profilen til forskjellige celletyper avhengig av tilgjengeligheten av tragenklavelinjer i laboratoriet ditt.Husk å vurdere fargen på transportørlinjene hvis du vil bruke antistoff for å merke alle celletypene deres. TUNEL-analysen er et enkelt verktøy som lar oss oppdage apoptotisk celle og vev, og kan analyseres ikke bare ved mikroskopi, men også ved strømningscytometri. Husk at bruk alltid personlig verneutstyr under hele prosedyren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

The Spared Nerve Injury SNI Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Vurdere Teratogene Endringer i en sebrafisk Model of Fetal Alcohol Exposure

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Iskemi-reperfusjon Modell av akutt nyreskade og Post Injury fibrose i Mus

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En Mulig Sebrafisk Modell av Polycystisk Nyresykdom: knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Årsaker Cyster i sebrafisk Nyrer

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis-indusert Focal iskemi som en modell av ryggmargsskader i Mus

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Kylling-indusert Surfaktantfritt Nedbryting i Pigs som en modell av den Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Åpne trakeostomi magesyre aspire Murine modell av akutt lungeskade Resultater i Maximal Akutt-dødelige lungeskade

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...