Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Это исследование было поддержано Фондом Ампаро и Пескиса-де-Сан-Паулу - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Конселью Национальный де Десенвольвименто Циентафико е Текнолигико (CNPq) и Корденаньо де Аперфьяцомменто де Пессоаль де Невель Верхне (CAPES), финансовый код 001. Мы благодарим наших сотрудников в лаборатории Марии Риты душ Сантуш электронной Passos-Буэно и Зебрафиш фонда генетики и эволюционной биологии Департамента, в Институте бионауки Университета Сан-Паулу. Мы благодарим Кристиану Наффу де Соуза Бреду и Терезу Ракель де Оливейру Рамальо за комментарии и предложения по рукописи. Мы высоко ценим и благодарим Марсио Вильяра Мартинса из мультимедийной команды Института биомедицинских наук за запись, издание и производство этого видео.

Авторов нечего раскрывать.

Распространенность заболеваний почек продолжает расти во всем мире, становясь глобальной проблемой общественного здравоохранения, которая затрагивает миллионылюдей 63. Поиск способа лечения почек раненых лиц имеет первостепенное значение, а также понять больше об их этиологии и прогрессии. Несколько исследований были с использованием моделей животных, чтобы понять повреждения почек. Зебрафиш почки (Рисунок 1) был изучен в течение многих лет в биологии развития и травмы исследований из-за его самовосхвестьюспособности и генетическое сходство 29,64. Здесь мы представляем новую модель AKI у взрослых зебр, используя свойства цисплатина в качестве нефротоксического агента, подробно описывая шаги для выполнения быстрой и острой реакции с повреждением видимых, как только 24 hpi (Рисунок 2). Более того, здесь мы объясним два метода, которые помогут дать оценку повреждению тканей после инъекции цисплатина, цитометрии потока и TUNEL(рисунок 3).
Текущие модели AKI у взрослых зебры включают в себя i.p. инъекции гентамицина, который вызывает значительные повреждения в нефрона и трубочки уничтожения, неонэфронез события начинаются с 5-го дня, и регенерация завершена на 21 дней послеинъекции 65. С другой стороны, модель сепсиса связанных острой травмы почек (S-AKI) была создана в результате инфекции с Edwardsiella tarda, так как значительно увеличилось выражение маркеров АКИ, таких как инсулиноподобный фактор роста связывания белка-7 (IGFBP7), ингибитор тканей металлопротеиназы 2 (TIMP-2), и молекулы травмы почек-1 (КИМ-1), у личиноки взрослых зебры. Зебрафиш известен как высокопрофильное животное для поиска терапевтических агентов, и это включает в себя использование пробиотиков и микробиоты полученных метаболитов для изучения функции почек ирегенерации 67. Однако имеющиеся модели могут непосредственно повлиять на результаты этих методов лечения. Таким образом, мы создали другой метод, чтобы вызвать АКИ у взрослых зебры (Рисунок 4), используя цисплатин как известный нефротоксический агент, который не будет иметь прямого известного воздействия на микробиоту рыбы, как и гентамицин модель за то, что антибиотик, или инфекции С. Tarda, за то, что сепсис модели. Однако, в то же время, что мы разрабатывали наш протокол цисплатина, другая группа также исследовала нефротоксические эффекты цисплатина у взрослых зебры, упрощая дозу до 10-20-30 мкг на животное68. Хотя они также показали, цисплатин доза зависит эффект в выживании, мы рекомендуем осторожность в использовании одного количества цисплатина для всех рыб, как зебрафиш с того же возраста может иметь очень разные размеры и вес, и это может вызвать измененияв результатах 69,70. Мы считаем важным приспособить дозу к соответствующему весу животного, как это делается у мышей и это исследование.
В наших экспериментах со взрослыми зебрами цисплатин проявлял эффект доза-ответ. Это было визуализировано путем мониторинга выживаемости животных после инъекции цисплатина(рисунок 5). Мы использовали выживаемость как способ оценки интенсивности дозы цисплатина, а не как меру нефротоксичности, так как никакой другой физический признак не виден во время мониторинга. Это может быть сопоставимо с грызунами, в которых тяжесть травмы почек может быть модулирована дозировкой и частотой инъекции цисплатина15,достигая смертельных доз с более высокими концентрациями цисплатина71. Мертвые также видели в последующие дни в личинок модели цисплатина72. Так как наша цель состояла в том, чтобы вызвать острую травму в течение нескольких дней, мы выбрали дозу 120 мкг/г цисплатина, как это возможно наблюдать повреждение почек 24 ч после инъекции, однако, это может быть скорректировано в зависимости от целей исследования.
У людей, AKI клинически диагностируется снижением скорости гломерулярной фильтрации (GFR), повышенный креатинин сыворотки, и азот мочевиныкрови 3. В зебрафиш, репертуар моделей AKI включает в себя некоторыегенетически-условные модели 73,74 и некоторые связанные снаркотиками модели 65,72, но, как некоторые из функциональных параметров AKI не могут быть измерены на зебрафиш из-за технических трудностей (например, сбор крови), большинство исследований принимает морфологические и визуальные методы для наблюдения за особенностями AKI1, 75, таких как наше исследование.
У грызунов цисплатин попадает в эпителиальные клетки проксимальных и дистальных труб, внутри клетки происходит метаболическая активация и становится высокореактивным, действующим на клеточные органеллы и вызывающим изменения в структуре клеток. Эти изменения могут вызвать апоптоз и аутофагию и даже некроз, в очень высоких дозах. В ответ на это повреждение, многие цитокины высвобождаются и лейкоциты набираются приводит к воспалению и влияет на функциональность органа15. Это подчеркивает важность оценки того, какой тип клеток можно найти в травмированной почке, как жители или проникли иммунных клеток. Здесь мы показали, как оценить это по цитометрии потока, используя трансгенные иммунные линии репортера доступны в настоящее время(таблица 1). Цисплатин увеличил процент нейтрофилов(mpo:GFP положительных клеток) в почках 24 ч после инъекции(рисунок 6). В случае зебры, почки нишу HSCs, которые дают возможность различных типов клеток крови. Тем не менее, многие гранулоциты и макрофаги обычно циркулируют в крови. В нашем примере мы использовали трансгенную линию mpo:GFP, которая выражает GFP под промоутером миелопероксидазы нейтрофилов52. Оригинальные исследования mpo:GFP трансгенной линии продемонстрировали выражение миелопероксидазы в различных состояниях нейтрофиловогосозревания 76, но наша стратегия ворот сосредоточена на фракции гранулоцитов, которая включает в себя зрелыеклетки, поступающие из крови 52, таким образом, наш анализ включает в себя проникли клетки, а не резидентных клеток. Это важно учитывать при изоляции желаемой популяции клеток.
Как поясняется выше, апоптоз является самым классическим маркером АКИ, связанного с цисплатином. Здесь мы продемонстрировали простой протокол локализации мертвых клеток с помощью анализа TUNEL. Инъекция цисплатина увеличила количество апоптотических клеток на 24 л.с.(рисунок 7). Это можно легко количественно, подсчитывая непосредственно мертвые клетки из ткани. Тем не менее, для идентификации клеточной смерти можно использовать использование антител против желаемой клетки(например, трубчатых клеток) или использование трансгенной линии репортера вместе с этой техникой. По сравнению с гентамицин-индуцированной модели АКИ, цисплатин, кажется, более тяжелая модель, так как апоптоз гентамицина был выше на третий день послеинъекции 65.
Несмотря на различные побочные эффекты, цисплатин по-прежнему широко используется в терапии рака, из-за его эффективности против различных видов рака, в том числе карциномы, опухоли зародышевых клеток, лимфомы, исаркомы 77. Нефротоксичность встречается у одной трети пациентов влечении цисплатином 10, таким образом, поиск стратегий, которые могут уменьшить этот эффект и увеличить ренопротекторию является обязательным. Мы считаем, что методы и методы, представленные в этой рукописи, помогут прояснить механизмы травмы почек и найти терапевтические цели, которые могут иметь важное значение для улучшения качества жизни людей, которые страдают от почечных осложнений, в основном связанных с использованием цисплатина.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

Цисплатин обычно используется в качестве химиотерапии. Хотя он имеет положительный эффект у людей, лечения рака, цисплатин может легко накапливаться в почках из-за его низкой молекулярной массы. Такое накопление приводит к гибели трубчатых клеток и может вызвать развитие острой травмы почек (АКИ), которая характеризуется быстрым снижением функции почек, повреждение тканей и проникновение иммунных клеток. При введении в определенных дозах цисплатин может быть полезным инструментом в качестве индуктора AKI в животных моделях. Зебрафиш появился в качестве интересной модели для изучения функции почек, регенерации почек и травм, так как почечные структуры сохраняют функциональное сходство с млекопитающими. Взрослые зебры, введенные с цисплатином показывает снижение выживаемости, гибель клеток почек, и увеличение маркеров воспаления после 24 ч после инъекции (hpi). В этой модели инфильтрация иммунных клеток и гибель клеток могут быть оценены с помощью цитометрии потока и анализа TUNEL. Этот протокол описывает процедуры, чтобы вызвать АКИ у взрослых зебры путем внутриперитонеальной инъекции цисплатина, а затем демонстрирует, как собрать почечную ткань для обработки цитометрии потока и клеточной смерти TUNEL анализа. Эти методы будут полезны для понимания последствий цисплатина как нефротоксического агента и будут способствовать расширению моделей AKI у взрослых зебр. Эта модель также может быть использована для изучения регенерации почек, в поисках соединений, которые лечат или предотвращают повреждение почек и для изучения воспаления в АКИ. Кроме того, методы, используемые в этом протоколе улучшит характеристику повреждения тканей и воспаления, которые являются терапевтическими целями в связанных с почками сопутствующих заболеваний.

Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Этот протокол описывает процедуры, чтобы вызвать острую травму почек (AKI) у взрослых зебры с использованием цисплатина в качестве нефротоксического агента. Мы подробно шаги для оценки воспроизводимости техники и два метода для анализа воспаления и гибели клеток в почечной ткани, цитометрии потока и TUNEL, соответственно.

Острая модель травмы почек, вызванная Цисплатином у взрослых зебрафиш

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Общая цель этой процедуры, объясняется использование цисплатина в качестве нефротоксического агента у взрослых рыб зебры, анализируя воспаление, и гибель клеток в почечной ткани. Для достижения этой цели и взрослые рыбы зебры анестезируется и взвешивается, чтобы ввести в специфическую дозу цисплатина в брюшной полости. После мониторинга смертности, почки рассекают и клетки изолированы для цитометрии потока или фиксированной и вскрытой для анализа флуоресцентных АНАЛИЗ.Следующие процедуры могут помочь ответить на ключевые вопросы в области почек с использованием нефротоксических эффектов цисплатина в качестве инструмента для разработки модели острой травмы почек и взрослых рыб-зебр. Эта модель может быть использована для исследования новых терапевтических целей в почечной защите, а также прояснить механизм регенерации в почках рыб зебры. Цисплатин является химиотерапевтическим агентом, используемым для лечения различных видов рака.Однако, может легко накапливаться в почках, генерации клеточной смерти, воспаления, и уменьшить функцию почек. Эффект цисплатина зависит от дозы, так что вы можете снизить наше увеличение дозирования зависит от ваших целей. Методы, используемые здесь для анализа воспаления и клеточной смерти, не предназначены исключительно для распространения модели болезни.Цитометрия потока у рыб-зебр может помочь прояснить воспалительные состояния животного в количественном выражении, в то время как в TUNEL мы говорим, может прояснить наличие poptosed клеток в физиологическом и патологическом контексте. Перед началом эксперимента подготовьте рабочий раствор цисплатина, разбавляя раствор бульона до 820 микрограммов на мил в 0,9% хлорида натрия. Затем обезболить другую рыбу зебры и высушить избыток воды на некоторых бумажных полотенец.Взвешивайте рыбу, помещая их на весы, принимая к сведению вес. Сделайте расчеты, чтобы знать точный объем для инъекций. Для достижения дозы 120 микрограммов на грамм веса, используйте следующую формулу.Разделите окончательную дозу на дозу рабочего раствора и преобразуй это число в микролитеры, умножая на 1000, чтобы получить объем 120 мкг цисплатина. Затем умножьте это число на вес рыбы, чтобы получить окончательный объем, который будет введен. Поместите рыбу на влажную губку, с маленькой чашкой, чтобы держать его.С брюшной стороны вверх и заполнить инсулин шприц с расчетным объемом цисплатина. Вставьте иглу на брюшной средней линии под мелким углом, осторожно потянув брюшной стенки, чтобы избежать прокола внутренних органов. А потом впрыснуть раствор.После инъекции поместите рыбу в бак, чтобы оправиться от анестезии, и ждать признаков восстановления, таких как плавание и соответствующие движения. Монитор для этого рыбы два раза в день в течение следующих дней. При такой дозе цисплатин вызывает около 30% смертности в первые 24 часа.Усыпание рыбы и высушить избыток воды в бумажном полотенце. После удаления головы и внутренних органов, использовать вскрытия иглы, чтобы закрепить стенки тела. Найдите почку в спинной стенке рыбы и используйте типсы, чтобы отсоединить почку.Поместите почку в шесть хорошо пластины с холодным раствором одного 1X PBS, 2%FBS и держать на льду. Затем возьмите ткань с некоторой жидкостью и передать его через 40 микрон-клеточный ситечко, и осторожно macerate ткани со шприцем поршень. Вымойте дважды с одним 1X PBS, 2%FBS.И соберите клетки в соколиной трубке в 50 миль. Затем центрифуга в течение пяти минут при 400 Г.Осторожно пикап супернатант с пипеткой и отбросить его. Добавьте 500 микролитров холодного 1X PBS, чтобы повторно приостановить клетки и поместить их в пятимилю течь цитометрии трубки.Держите их на льду. Возьмите 10 микролитров образца и смешайте его с 90 микролитров трипан-голубого цвета в трубке Эппендорфа. Добавьте 10 микролитров смеси в камеру Neobauer и подсчитайте клетки в микроскопе.Возьмите клетки для чтения цитометром, а затем проанализировать результаты выбора населения ваших интересов. Для этой процедуры усытворяйте рыбу и удаляйте внутренние органы, оставляя почку прикрепленной к телу. Затем прикрепите стенки кузова к поверхности пробки и поместите ее на поэтапное решение фиксации.Держите его на четыре градуса на ночь. На следующий день, вскрыть почку с тонкой типп. Старайтесь не нарушать его.Поместите его в небольшую чашку Петри или Эппендорф трубку с 1X PBS для полоскания. Изменение PBS и подготовить 2%agarose для создания матрицы поддержки для почек, прежде чем они прочно процесса. Отбросьте все оставшиеся PBS и залить агарозу медленно.Затем, положение почки с тонкой типсов для предотвращения его сложить. Пусть агароз затвердеет при комнатной температуре. После затвердевания агарозы используйте скальпель, чтобы разрезать агарозу вокруг почек, образуя мелкие кубики.Поместите кубики агарозы в гистологическую кассету и отправьте их на гистологическую обработку для встраивания ткани в парафин. Парафин блоков, мы затем сократить в пять микрон толщиной разделов. Де-воск слайды и держать их в дистиллированной воде.Подготовьте темную камеру инкубатора, положив мокрые бумажные полотенца на дно. Поместите слайды в темную камеру и добавьте протеиназу K для протеабилизации ткани. Инкубация в течение 30 минут при 37 градусах Цельсия.В то время как образцы инкубированы, подготовить смесь реакции TUNEL, добавив 50 микролитров ферментного раствора на 450 микролитров этикетки раствора. И держать защищены от света. Возьмите темную камеру и мыть ломтик дважды с одним 1X PBS.Затем высушите слайды и на смеси реакции TUNEL. И инкубировать при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. После инкубации, мыть эти слайды снова с одним 1X PBS.И добавить DAPI для ядра счетчик окрашивания. Инкубация при комнатной температуре в течение пяти минут, защищенная от света. Промыть три раза с одним 1X PBS.А потом, плесень слайды с анти-fade гидрофильной среде. Поместите крышку скольжения. И печать с лаком для ногтей.Визуализуууу в образцах флуоресцентного микроскопа. На этом графике можно увидеть, что цисплатин имеет эффект реакции дозы на выживание рыб, по сравнению с контролем, введенным только с 0,9% хлорида натрия. Красная линия на этом графике представляет собой дозу 120 микрограмм на грамм, используемую в этом видео.Эти дозы могут быть применены к мужчинам и женщинам, так как статистической разницы между ними обнаружено не было. Цитометрия потока позволяет количественно оценить различные клетки, присутствующие в ткани. Популяции гематопоэтических клеток идентифицируются в почках нескольких рыб по размеру или форварду рассеяния и детализации или рассеяния размеров.Таким образом, можно разделить популяции в эритроцитах, лимфоцитах, гранулоцитах и гематопоэтических прекурсорах. Здесь текущая стратегия ворот, выбираюющая гранулоциты, синглеты и положительные клетки МПО, позволяет найти популяцию нейтрофилов в почках, отмеченных флуоресценцией экспрессии миелопероксидазы. В этом случае инъекция цисплатина индуцировала увеличение доли нейтрофилов, присутствующих в почках.Анализ TUNEL позволяет обнаружить апоптотические клетки в ткани, наблюдая слайд ткани почки с помощью флуоресцентного микроскопа, можно увидеть апоптотический сигнал внутри ядер некоторых клеток, здесь, в красном цвете. Контрастные ядерного пятна в таком DAPI здесь в синем. Инъекции цисплатина увеличили присутствие апоптотических клеток в почках, которые можно количественно количественно вручную или с помощью программного обеспечения изображения.В конце этого видео вы должны быть в состоянии знать, как вводить и корректировать дозу цисплатина, чтобы вызвать острую травму почек у взрослых рыб зебры. И как вскрыть почку для разных целей. Цитометрия потока является отличным инструментом, который поможет вам понять профиль различных типов клеток в зависимости от наличия линий трагенклава в вашей лаборатории.Не забудьте рассмотреть цвет линий транспортеров, если вы хотите использовать антитела для обозначения всех своих типов клеток. Анализ TUNEL является простым инструментом, который позволяет нам обнаружить апоптотические клетки и ткани, и может быть проанализирован не только с помощью микроскопии, но и поток цитометрии. Помните, всегда используйте средства индивидуальной защиты в течение всей процедуры.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Давление контролируемой вентиляции, чтобы вызвать острого повреждения легких у мышей

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

В естественных условиях Грызунах сжимающих вызванного травмой и неинвазивного мониторинга Восстановления

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

The Spared Nerve Injury SNI Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

Пощадили повреждение нерва (SNI) Модель Индуцированные Механические аллодиния у мышей

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Оценка Тератогенные Изменения в модели данио рерио внутриутробного развития плода алкоголь

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ишемии-реперфузии Модель острого почечного повреждения и фиброза после травмы у мышей

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Возможно данио рерио Модель поликистоза почек: Нокдаун<em&gt; Wnt5a</em&gt; Причины кисты у рыбок данио почек

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Фототромбоза-индуцированной ишемии как модель с повреждением спинного мозга у мышей

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Промывание индуцированных Поверхностно Истощение в Свиней в качестве модели синдрома острой дыхательной недостаточности (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Открыть Трахеостомия Желудочный кислота Аспирация мышиной модели острого повреждения легких Результаты в Максимальный Острый несмертельного повреждения легких

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...

A Doxorubicin-induced Cardiomyopathy Model in Adult Zebrafish

Доксорубицин индуцированной кардиомиопатия модель в взрослых рыбок данио

The genetically accessible adult zebrafish (Danio rerio) has been increasingly used as a vertebrate model for understanding human diseases such as ...