Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Esta investigación fue apoyada por la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico y Tecnológico (CNPq) y Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), código financiero 001. Agradecemos a nuestros colaboradores en el Laboratorio de Maria Rita dos Santos y Passos-Bueno's y a la Instalación de Pez Cebra del Departamento de Genética y Biología Evolutiva, en el Instituto de Biociencia de la Universidad de São Paulo. Agradecemos amablemente a Cristiane Naffah de Souza Breda y Theresa Raquel de Oliveira Ramalho por los comentarios y sugerencias sobre el manuscrito. Agradecemos mucho y agradecemos a Marcio Villar Martins, del equipo multimedia del Instituto de Ciencias Biomédicas, la grabación, edición y producción de este vídeo.

Los procedimientos descritos en este protocolo fueron previamente aprobados para ser utilizados en el modelo de pez cebra por el Comité de Ética de Uso Animal del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de São Paulo.
1. Inducción AKI por inyección intraperitoneal cisplatino
<ol><li>Preparar solución de trabajo de cisplatino diluyendo la solución de stock a 850 μg/mL en 0,9% NaCl. Manténgase a temperatura ambiente, protegido de la luz. PRECAUCIÓN: El fabricant recomienda la manipulación de cisplatino con equipo de protección personal (EPI) que incluye gafas, guantes y bata de laboratorio. Almacene la solución de stock a temperatura ambiente, protegida de la luz.</li>
	<li>Preparar 150 mg/L de anestésico MS-222 (Tricaine) en agua del sistema45. Anestesiopeizar pez cebra adulto (5-9 meses) por inmersión durante aproximadamente 1-2 min. NOTA: Los peces anestesiados efectivamente deben ser irresponsables de tocar. Para probar anestesia efectiva, presione suavemente la aleta caudal para observar la reacción. PRECAUCIÓN: La tricarina es un irritante para la piel y los ojos, utilice EPÍ para manipular.</li>
	<li>El uso de una cuchara de plástico transfiere el pescado a una superficie absorbente, como toallas de papel, para eliminar el exceso de agua alrededor del cuerpo. Luego, con la cuchara de plástico transferir el pescado a una placa de Petri sobre una báscula y pesar el pescado. Tome nota del peso del pescado, ya que será necesario para los cálculos de dosis. NOTA: Absorber el exceso de agua de los peces evita sobreestimar el peso del animal, no se seque en exceso ya que es perjudicial para los peces.</li>
	<li>Para lograr la dosis final de 120 μg/g de peso, divida los μg de la dosis final (120 μg) por el μg de la solución de trabajo de cisplatino (850 μg) y convierta este número en microlitros (μL) multiplicándose durante 1000, para obtener el volumen de 120 μg de cisplatino (141,2 μL). A continuación, multiplique este número (141,2 μL) para que el peso del pez (g) obtenga el volumen final que se va a inyectar.</li>
	<li>Con una cuchara de plástico, transfiera el pescado sobre una esponja húmeda con un poco de corte para sostenerlo, con el lado ventral hacia arriba. La esponja debe mojarse con anestesia en el agua del sistema.</li>
	<li>Llene una jeringa de insulina de 31 G 1,0 ml con el volumen calculado de solución de trabajo de cisplatino.</li>
	<li>Inserte la aguja en la porción intraperitoneal del animal cerca de la aleta pélvica, en un ángulo poco profundo para evitar perforar las vísceras(Figura 2A). A continuación, inyecte lentamente la solución.</li>
	<li>Después de la inyección coloque el pez en un tanque para recuperarse de la anestesia. Observe a los peces en busca de signos de recuperación normal(por ejemplo, movimientos de natación, movimientos operculares). NOTA: El animal debe recuperarse en los próximos 3-5 minutos. Si es necesario, estimule el pescado moviéndolo con una cuchara de plástico, una pipeta de plástico Pasteur o colocándolo cerca de una manguera con burbujas.</li>
	<li>Para el control de peces, realice el mismo procedimiento inyectando una solución de 0,9% NaCl. Utilice el mismo cálculo después de la proporción de peso corporal: el volumen que se inyectará será de 141 μL multiplicado por el peso del pez (g).</li>
	<li>Monitoree la supervivencia de los peces al menos dos veces al día en los días siguientes(Figura 2B).</li>
</ol>2. Aislamiento renal y procesamiento de tejidos para la citometría de flujo de células inmunes
<ol><li>Para este procedimiento, utilice animales transgénicos marcados con células inmunes fluorescentes(por ejemplo,Tg (mpo:GFP)).</li>
	<li>Después de 24 CV de 120 μg/g de cisplatino, eutanasia a los animales por choque hipotérmico (enfriamiento rápido). NOTA: Se ha demostrado que el shock hipotérmico es más eficaz como método de eutanasia que la sobredosis de MS-222. El shock hipotérmico es menos estresante, rápido, consistente y más seguro para el personal que el uso de MS-222, ha descrito previamente46,47.</li>
	<li>En un tanque de cruce exterior preparar agua helada en una proporción de 5:1 de hielo al agua del sistema, poner el tanque interior con una pantalla sobre el hielo, esperar hasta que el agua alcance 2-4 ° C. NOTA: Los peces no deben estar en contacto directo con el hielo, ya que esto puede causar quemaduras térmicas y dolor.</li>
	<li>Transfiera animal al agua helada, espere al menos 10 minutos hasta que haya pérdida de orientación y sin movimiento opercular.</li>
	<li>Con una cuchara de plástico, coloque el pescado en toallas de papel para secar el exceso de agua.</li>
	<li>Transfiera el pescado a una placa de disección de 3% de agarose y tómelo bajo un estereoscopio con luz superior. Con tijeras, decapitar peces haciendo un corte rápido justo detrás de los ojos, y quitar la cabeza.</li>
	<li>Con tijeras finas hacer un corte desde el lado abierto a la cloaca y eliminar los órganos internos con fórceps finos.</li>
	<li>Utilice alfileres de insectos para pellizcar los lados de las paredes del cuerpo para abrir el cadáver y exponer el riñón unido a la columna vertebral.</li>
	<li>Desapese el riñón con fórceps finos y coloque el órgano en una placa de 6 pozos con una solución fría de 1x PBS/2% FBS. Sigue con hielo.</li>
	<li>Recoge el tejido con una pipeta de plástico Pasteur y pasa el tejido a través de un colador celular de 40 μm sobre un tubo de 50 ml, macerándolo suavemente con un émbolo de jeringa.</li>
	<li>Lave dos veces con 1 ml de 1x PBS/2% FBS y recoja las células en un tubo de 50 ml.</li>
	<li>Células centrífugas a 400 × g durante 5 min a 4 °C.</li>
	<li>Recoge cuidadosamente todo el sobrenadante con un micropipette de 1 ml y deséchalo. Añadir 500 μL de PBS frío 1x para resuspend las células y colocarlas en tubos de citometría de flujo de 5 ml. Sigue con hielo.</li>
	<li>Contar células en la cámara Neubauer haciendo una dilución de 1:10 en Trypan Blue(por ejemplo,tomar 10 μL de la muestra y mezclar con 90 μL de Trypan Blue). Añadir 10 μL de la mezcla a una cámara Neubauer y contar las células bajo el microscopio. NOTA: Se esperan resultados óptimos con 1-5 x 106 celdas/ml y >80% de viabilidad. PRECAUCIÓN: Trypan blue es un agente cancerígeno, utilice PPE para manejar.</li>
	<li>Tome las células para ser leídas por un cytometer. A continuación, analice los resultados seleccionando la población de interés.</li>
</ol>3. Procesamiento de tejido renal adulto de pez cebra para ensayo TUNEL
<ol><li>Para este procedimiento, utilice animales de tipo salvaje(por ejemplo,AB, Tubinga, etc.) o un animal transgénico con un color fluorescente diferente al kit TUNEL, ya que una fluorescencia similar puede interferir con el análisis de TUNEL.</li>
	<li>Después de 24 CV de 120 μg/g de cisplatino, eutanasia a los animales por choque hipotérmico (enfriamiento rápido). Véase 2.3-2.4.</li>
	<li>Diseccionar los peces como se describe en 2.5-2.6; el riñón debe permanecer unido a la columna vertebral durante el procedimiento de fijación (explicado a continuación).</li>
	<li>Usando alfileres de insectos, pellizque los lados de las paredes del cuerpo para abrir el cadáver y fijarlo en una superficie de corcho para mantener el riñón expuesto. NOTA: Este procedimiento garantiza que el riñón permanezca en la posición correcta para su análisis posterior.</li>
	<li>A continuación, coloque la superficie del corcho con el riñón mirando hacia abajo en una placa de 6 pozos sobre una solución recién hecha de 4% paraformaldehído (PFA). Manténgalo durante la noche a 4 °C. PRECAUCIÓN: La PFA es cancerígena e irritante para las superficies de la piel y los mucosos. Prepare soluciones PFA bajo una campana química utilizando EPI, incluidos equipos de protección ocular.</li>
	<li>Al día siguiente, disecciona los riñones como en 2.8. Coloque los riñones en una placa Petri de 60 mm con 1x PBS y enjuague dos veces en 1 pbs.</li>
	<li>Preparar 2% de agarose para generar una matriz de soporte para el tejido.</li>
	<li>Deseche todos los 1 PBS restantes de la placa De Petri y vierta un 2% de agarose lentamente para cubrir todo el órgano. A continuación, coloque el riñón usando fórceps finos bajo un estereomicroscopio para evitar que el riñón se doble. Deje que la agarose se solidifique a temperatura ambiente. NOTA: Este procedimiento mantendrá la orientación y la forma del órgano a través del procesamiento histológico ya que la forma similar a la hoja del órgano hace que una tendencia a plegarse si no está dentro de una matriz de apoyo.</li>
	<li>Después de la solidificación de la agarose, utilice un bisturí para cortar la agarose alrededor del tejido, formando cubos pequeños y elimine el exceso de agarose alrededor del tejido.</li>
	<li>Coloque los cubos de agarose en un casete adecuado para el procesamiento histológico. NOTA: Los siguientes pasos se pueden realizar manualmente o en un procesador automático de tejidos.</li>
	<li>En primer lugar, procese el tejido en el cassette siguiendo los siguientes pasos durante 45 minutos cada uno a temperatura ambiente: un baño de 50% etanol, un baño de 70% etanol, dos baños consecutivos de 95% etanol, y tres baños consecutivos de etanol 100%. Después, procese el tejido en dos baños consecutivos de xileno y tres baños consecutivos de parafina; este último dura 1 hora cada uno a 60 °C. PRECAUCIÓN: Hacer cambios bajo una capucha química, vapores de etanol y xileno son irritantes y tóxicos.</li>
	<li>Para preparar bloques de parafina, derretir lentejas de parafina a 60 °C.</li>
	<li>Abra el cassette de plástico con el tejido en su interior y guárdalo en una placa caliente. Moldes metálicos de calentamiento para la parafina.</li>
	<li>Con pinzas coloque el tejido sobre un molde metálico para que la longitud del riñón sea paralela a la base del molde. Agregue la parafina, reasignar el tejido si es necesario.</li>
	<li>Cubra el molde con la base del cassette y agregue la parafina hasta que la rejilla esté cubierta. Deje solidificar a temperatura ambiente y luego coloque a -20 °C para un proceso de solidificación más rápido.</li>
	<li>Suelte el bloque de parafina del molde metálico alrededor de 20-30 minutos más tarde.</li>
	<li>Con un microtome, seccione el tejido incrustado en parafina a 5 μm de espesor. Utilice toboganes de vidrio silanizados o cargados positivamente para recoger el tejido.</li>
</ol>4. Ensayo TUNEL
NOTA: El siguiente protocolo utiliza un kit de detección de muerte de células in situ (tabla de materiales).
<ol><li>El tejido de dewax se desliza colocándolos en dos baños consecutivos de xileno durante 5 minutos. Luego rehidrata el tejido a través de una serie calificada de etanol: 100%-95%-70%-50%, durante 5 min cada uno.</li>
	<li>Coloque los toboganes en agua fría del grifo para enjuagar el etanol. Mantenga los toboganes en agua destilada.</li>
	<li>Prepara una cámara de incubadora oscura. Agregue toallas de papel húmeda en la parte inferior para mantener la humedad durante los pasos de incubación. NOTA: En falta de una cámara de incubadora es posible utilizar una placa Petri con papel húmedo en la parte inferior y dos palillos de dientes para colocar el tobogán.</li>
	<li>Preparar solución de trabajo proteinasa Kfresca: 10 μg/mL en tris/HCl de 10 mM, pH 7,4-8. NOTA: Proteinasa K se utiliza como agente de permeabilización, según lo recomendado por el fabricante.</li>
	<li>Coloque las diapositivas en la cámara de incubadora oscura y agregue la solución de trabajo Proteinase K hasta que cubra las muestras. Incubar durante 30 min a 37 °C.</li>
	<li>Mientras las muestras están incubando, prepare la mezcla de reacción TUNEL:Agregue 50 μL de Solución enzimática a 450 μL De solución de etiquetas. Protéjase de la luz. NOTA: El volumen a preparar se puede ajustar en la misma proporción de 1:10. El volumen se calcula en 50 μL de la mezcla para cada sección; esto puede cambiar dependiendo del tamaño de las muestras.</li>
	<li>Coge la cámara oscura y lava las diapositivas dos veces con 1x PBS.</li>
	<li>A continuación, seque la región alrededor de la muestra utilizando papel absorbente y agregue 50 μL de mezcla de reacción TUNEL sobre cada deslizamiento de tejido, extienda la solución para que toda la muestra esté cubierta. Incubar a 37 °C durante 2 h. Protéjase de la luz.</li>
	<li>Después de la incubación, enjuague el tobogán tres veces con 1x PBS y seque la región alrededor de la muestra usando toallas de papel.</li>
	<li>Añadir 50 μL de DAPI 1:1000 a las muestras, para la contrarrestensificación nuclear, e incubar durante 5 min a temperatura ambiente. Protéjase de la luz.</li>
	<li>Enjuague de nuevo tres veces con 1x PBS y seque la región alrededor de la muestra.</li>
	<li>Monte el tobogán con un medio hidrófilo anti-fundido, coloque un cubrecoche y selle con esmalte de uñas. Almacene las diapositivas horizontalmente, protegidas de la luz a 4 °C. NOTA: Las propiedades anti-fundido del medio de montaje son para preservar la fluorescencia de las muestras, pero es posible utilizar cualquier medio hidrófilo disponible. El paso final de sellado con esmalte de uñas es crucial para evitar la deshidratación.</li>
	<li>Visualice las muestras bajo un microscopio de fluorescencia. Para este tipo de pigmento fluorescente, utilice una longitud de onda de excitación en el rango de 520-560 nm (verde) y detección en el rango de 570-620 nm (rojo).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

La prevalencia de la enfermedad renal ha seguido aumentando en todo el mundo, convirtiéndose en un problema de salud pública mundial que afecta a millones de personasde 63 años. Encontrar una manera de tratar a las personas lesionadas renales es de suma importancia, así como entender más acerca de su etiología y progresión. Varios estudios han estado utilizando modelos animales para entender el daño renal. El riñón de pez cebra(Figura 1)ha sido estudiado durante años en biología del desarrollo e investigación de lesiones debido a sus capacidades auto-regeneradoras y similitud genética29,64. Aquí, presentamos un nuevo modelo AKI en peces cebra adultos utilizando las propiedades del cisplatino como agente nefrotoxic, detallando los pasos para lograr una reacción rápida y aguda con daños visibles tan pronto como 24 HPi(Figura 2). Además, aquí explicamos dos técnicas que ayudarán a la evaluación del daño tisular después de la inyección de cisplatino, la citometría de flujo y tunel(Figura 3).
Los modelos actuales de AKI en peces cebra adultos incluyen la inyección i.p. de gentamicina que induce daños extensos en la destrucción de nefrones y tubérculos, eventos de neonephrogénesis a partir del día 5, y la regeneración se completa 21 días después de la inyección65. Por otro lado, se estableció un modelo de lesión renal aguda asociada a la sepsis (S-AKI) por la infección con Edwardsiella tarda,ya que aumentó significativamente la expresión de marcadores AKI, como la proteína de unión a factores de crecimiento similar a la insulina-7 (IGFBP7), el inhibidor tisular de metaloproteinases 2 (TIMP-2), y la molécula de lesión renal-1 (KIM-1), en larvas y peces cebra adultos66. El pez cebra es conocido por ser un animal de alto rendimiento para la búsqueda de agentes terapéuticos y esto incluye el uso de probióticos y metabolitos derivados de microbiota para estudiar la función renal y la regeneración67. Sin embargo, los modelos disponibles podrían afectar directamente al resultado de estos tratamientos. Así, establecimos un método diferente para inducir AKI en el pez cebra adulto(Figura 4),utilizando cisplatino como un agente nefrotoxico conocido que no tendría efectos directos conocidos en la microbiota de los peces, al igual que el modelo de gentamicina por ser un antibiótico, o la infección con E. tarda,por ser un modelo de sepsis. Sin embargo, al mismo tiempo que estábamos desarrollando nuestro protocolo de cisplatino, otro grupo también exploró los efectos nefrotoxicos del cisplatino en el pez cebra adulto, simplificando la dosis a 10-20-30 μg por animal68. Aunque también mostraron efecto dependiente de la dosis de cisplatino en la supervivencia, recomendamos precaución en el uso de una sola cantidad de cisplatino para todos los peces, ya que el pez cebra de la misma edad puede tener tamaños y peso muy diferentes y esto podría inducir variaciones en los resultados69,70. Creemos que es importante ajustar la dosis al peso correspondiente del animal, como se hace en ratones y este estudio.
En nuestros experimentos con peces cebra adultos, cisplatino mostró un efecto dosis-respuesta. Esto se visualizó mediante el seguimiento de la tasa de supervivencia de los animales después de la inyección de cisplatino (Figura 5). Utilizamos la supervivencia como una forma de estimar la intensidad de la dosis de cisplatino y no como una medida de nefrotoxicidad, ya que ningún otro signo físico es visible durante el tiempo de monitoreo. Esto puede ser comparable con roedores, en los que la gravedad de la lesión renal puede ser modulada por la dosis y frecuencia de la inyección de cisplatino15,logrando dosis letales con mayores concentraciones de cisplatino71. Dead también se ve en los días siguientes en el modelo larvario de cisplatino72. Dado que nuestro objetivo era inducir una lesión aguda en pocos días, seleccionamos la dosis de 120 μg/g de cisplatino como es posible observar daño renal 24 h después de la inyección, sin embargo, esto se puede ajustar dependiendo de los objetivos del estudio.
En los seres humanos, AKI es clínicamente diagnosticado por disminución de la tasa de filtración glomerular (GFR), creatinina sérica elevada, y nitrógeno urea en la sangre3. En el pez cebra, el repertorio de modelos AKI incluye algunos modelos genéticamente condicionales73,74 y algunos modelos relacionados con fármacos65,72,pero como algunos de los parámetros funcionales de AKI no se pueden medir en peces cebra debido a dificultades técnicas(por ejemplo, recolección de sangre), la mayoría de las investigaciones adoptan técnicas morfológicas y visuales para observar las características de AKI1,75 como nuestro estudio.
En roedores, cisplatino entra en las células epiteliales en los túbulos proximales y sombríos, dentro de la célula se somete a activación metabólica y se vuelve altamente reactivo actuando sobre orgánulos celulares e induciendo cambios en la estructura celular. Estos cambios pueden inducir apoptosis y autofagia e incluso necrosis, a dosis muy altas. En respuesta a este daño, muchas citoquinas se liberan y los leucocitos son reclutados que conducen a la inflamación y afectan la funcionalidad del órgano15. Esto pone de relieve la importancia de evaluar qué tipo de células se pueden encontrar en el riñón lesionado, como residentes o células inmunes infiltradas. Aquí mostramos cómo evaluar esto por citometría de flujo, utilizando las líneas de reportero inmune transgénico disponibles hoy en día(Tabla 1). Cisplatino aumentó el porcentaje de neutrófilos(mpo:GFP células positivas) en el riñón 24 h después de la inyección (Figura 6). En el caso del pez cebra, el riñón es el nicho de HSC que dan lugar a diferentes tipos de células sanguíneas. Sin embargo, muchos granulocitos y macrófagos normalmente circulan en la sangre. En nuestro ejemplo, utilizamos la línea transgénica mpo:GFP que expresa GFP bajo el promotor de la mieloperoxidasa de neutrófilos52. Estudios originales de la línea transgénica mpo:GFP demostraron la expresión de mieloperoxidasa en diferentes estados de maduración neutrófila76, pero nuestra estrategia de puerta se centró en la fracción de granulocitos que comprende células maduras procedentes de la sangre52,de esta manera nuestro análisis incluye células infiltradas y células no residentes. Esto es importante tener en cuenta al aislar la población celular deseada.
Como se explicó anteriormente, la apoptosis es el marcador más clásico de AKI relacionado con cisplatino. Aquí, demostramos un protocolo simple para la localización de células muertas por el ensayo TUNEL. Inyección de cisplatino aumentó el número de células apoptóticas 24 hpi (Figura 7). Esto se puede cuantificar fácilmente contando directamente las células muertas del tejido. No obstante, para la identificación de la muerte específica de las células se puede utilizar anticuerpos contra la célula deseada(por ejemplo, células tubulares), o el uso de una línea de reportero transgénico junto con esta técnica. En comparación con el modelo inducido por gentamicina de AKI, cisplatino parece ser un modelo más grave, ya que la apoptosis de gentamicina fue mayor en el tercer día después de la inyección65.
A pesar de tener una variedad de efectos secundarios, cisplatino todavía es ampliamente utilizado en la terapia contra el cáncer, debido a su eficacia contra varios tipos de cánceres, incluyendo carcinomas, tumores de células germinales, linfomas, y sarcomas77. La nefrotoxicidad se produce en un tercio de los pacientes en tratamiento con cisplatino10,por lo que la búsqueda de estrategias que puedan disminuir este efecto y aumentar la renoprotección es imprescindible. Creemos que los métodos y técnicas presentados en este manuscrito ayudarán a dilucidar los mecanismos de lesión renal y encontrar dianas terapéuticas que pueden ser esenciales para mejorar la calidad de vida de las personas que sufren de complicaciones renales, predominantemente las relacionadas con el uso de cisplatino.

Los riñones son responsables de varias funciones fisiológicas importantes que mantienen la homeostasis, como la filtración de sangre, la eliminación del exceso de residuos y la regulación de las concentraciones de iones1. El daño del tejido renal puede conducir a una afección heterogénea llamada Lesión Renal Aguda (AKI), que clínicamente se describe como una rápida disminución de la función renal causada por la destrucción y muerte de células epiteliales tubulares, lesión celular endotelial e infiltración de leucocitos 2,3. AKI es una condición que se prevé que ocurra en el 8-16% de los ingresos hospitalarios4,con una alta tasa de mortalidad que oscila entre el 20 y el 50% en la Unidad de Cuidados Intensivos (UCI)5. Esta dolencia se asocia con un aumento de la estancia hospitalaria y un uso considerable de los recursos financieros5. Los factores eológicos incluyen deshidratación, shock, infecciones, sepsis, enfermedad cardiovascular y medicamentos nefrotoxicos6. La nefrotoxicidad se define como una lesión renal inducida por fármacos, causando efectos como AKI, tubulopatías y glomerulopatías7. La nefrotoxicidad afecta a dos tercios de los pacientes de la UCI, ya que aproximadamente el 20% de los medicamentos prescritos en la UCI se consideran nefrotoxicoscos8,9,esto incluye antiinflamatorios no esteroideos (AINE), antibióticos como vancomicina y aminoglicosidos, y agentes quimioterapéuticos como el metotrexato y la cisplatino7. Cisplatino es uno de los medicamentos de quimioterapia más potentes y comunes, utilizados en el tratamiento de tumores sólidos, como la cabeza y el cuello, testicular, ovárico y vejiga10. En el riñón, el cisplatino se interioriza en el tubo convolucional proximal (PCT) a través del transportador catiónico orgánico 2 (OCT-2) y en altas concentraciones se une al ADN desencadenando vías de muerte celular7,10,11,12. La acumulación de este fármaco en el riñón contribuye a la nefrotoxicidad con la muerte y la inflamación13. Este efecto secundario perjudicial afecta enormemente la vida y el pronóstico de un tercio de los pacientes con cáncer sometidos a tratamiento con cisplatino, por lo que es imprescindible la investigación de nuevas terapias que pueden reducir la nefrotoxicidad sin perder el efecto asesino en las células cancerosas10.
Debido a este efecto nefrotoxico, cisplatino se utiliza comúnmente como un inductor de AKI en modelos animales experimentales, como se describe hacia adelante. En roedores, el primer modelo AKI inducido por cisplatino fue reportado en 197114, pero en la actualidad, muchos protocolos diferentes han surgido utilizando los efectos dependientes de la dosis y acumulativos de cisplatino15. Así, dependiendo de la dosis y número de aplicaciones, diferentes grados de gravedad de la lesión renal pueden ser inducidos16,17,18,19,20,21. El método más frecuente consiste en una inyección intraperitoneal (i.p.) de una dosis de cisplatino seguida de eutanasia en los días siguientes. En este protocolo clásico, una sola dosis nefrotoxica alta de cisplatino (10-13 mg/kg en ratones y/o 3-8 mg/kg en ratas) induce cambios histológicos severos, como la pérdida de borde de cepillo y desechos celulares dentro del lúmenes tubulares, pocos días después de la inyección de cisplatino. La gravedad de los cambios histológicos depende de la dosis, y se observan signos de regeneración 7 días después de la inyección de cisplatino16,17.
Aunque los modelos de roedores están bien establecidos, decidimos aprovechar las características de otro vertebrado, centrando nuestros estudios en el pez cebra(Danio rerio). Este pez ha sido ampliamente utilizado para modelar enfermedades humanas, debido a su pequeño tamaño, fertilización externa, altas tasas de reproducción, desarrollo rápido, transparencia de los embriones y larvas, bajo costo de mantenimiento, anatomía similar a los mamíferos (con algunas excepciones), alta capacidad de regeneración de tejidos, comportamiento social, 70% de similitud genética con los seres humanos y 84% con los genes asociados a enfermedades humanas22. Streisinger et al.23,24,25 iniciaron los estudios con peces cebra que confirmaron la viabilidad de utilizar este organismo modelo para el análisis genético del desarrollo de vertebrados. En la investigación renal, el pez cebra ha surgido no sólo en estudios de desarrollo, sino también como una herramienta genética en la búsqueda de nuevos genes vinculados a las condiciones renales26. Además, la capacidad de regeneración sin formación de cicatrices y la capacidad de generar nefrones a lo largo de su vida, llamada neonephrogenesis, hacen del pez cebra un modelo animal clave para la investigación de regeneración27,28. Además, la disponibilidad de modelos experimentales para diferentes enfermedades renales, incluyendo lesiones renales agudas y crónicas, demuestran la versatilidad de este organismo experimental26,29. Al igual que en los mamíferos, los progenitores renales del pez cebra se derivan del mesodermo intermedio. Estos progenitores renales generan los propensos que posteriormente se desarrollarán a los mesoneforos, que se mantendrán como un órgano maduro hasta la edad adulta29,30.
El riñón adulto de pez cebra se encuentra en la pared dorsal del cuerpo, entre la vejiga de natación y la columna vertebral29. Desde una vista ventral, el pez cebra se puede segmentar en tres regiones (Figura 1A):cabeza (H), tronco (Tr) y cola (Ta)29. Al igual que los mamíferos, el pez cebra tiene los nefrones como unidades funcionales del riñón, que se dividen en segmentos de tubérculos(Figura 1A):corpuscle renal (RC), tubérculo convolucional proximal (PCT), tubérculo recto proximal (PST), distal temprano (DE), distal tardío (DL) y conducto de recogida (CD)29. Zebrafish comparte conservación genética y similitudes estructurales con nefrones humanos(Figura 1B),pero carece de algunas conformaciones como el tubérculo intermedio, también conocido como el bucle de Henle (LH)29,31. Los peces de agua dulce como el pez cebra normalmente están rodeados por un medio con muy baja osmolaridad, debido a esto, tienden a ser hiperosmóticos y dependen de las branquias, la piel en las primeras etapas, y el riñón para regular la osmolaridad y la excreción de agua32. La filtración de sangre de la aorta dorsal por los propensos a los afán comienza alrededor de 48 h después de la fertilización (HPF)33,34. El riñón del pez cebra no es sólo un órgano de excreción de residuos metabólicos, sino que también funciona como un órgano hematopoyético desde 4 días después de la fertilización (dpf) hasta la edad adulta y es equivalente a la médula ósea en mamíferos35. Durante el desarrollo, las células madre hematopoyéticas (HSC) sembrarán el riñón, se auto-renovarán y generarán linfajes de células mieloides, eritroides y linfoides, manteniendo factores de transcripción, moléculas de señalización y programas genéticos altamente conservados con mamíferos36,37. Los estudios han revelado que la mayoría de las células eritroides, trombocíticas, mieloides y linfoides del sistema inmunitario humano están presentes en el pez cebra37,38. Las características únicas de este animal y las características conservadas con el riñón humano hicieron que este organismo modelo fuera ventajoso en la investigación de la función renal, lesión y regeneración.
Aunque el riñón del pez cebra está bien estudiado y algunos modelos de AKI ya están disponibles en larvas y peces cebra adultos28,en el momento del establecimiento de este protocolo no había evidencia de un modelo AKI no antibiótico inducido químicamente en peces cebra adultos. Además de esto, nuestro laboratorio se centra en probar bacterias probióticas y compuestos derivados de microbiota para estudiar la regeneración y el daño renal, por lo que concentramos nuestros esfuerzos en la creación de un nuevo modelo AKI inducido por cisplatino en peces adultos. El artículo en vídeo presentado en este manuscrito muestra los procedimientos para un nuevo modelo de inducción AKI utilizando una inyección i.p. de 120 cisplatino ug por g de animal (120 μg/g) (Figura 2A). Esta dosis se basó inicialmente en estudios de AKI inducidos por cisplatino en modelos murinos que rondaba los 10 mg/kg (equivalentes a 10 μg/g)14,15,16,17, sin embargo, esta dosis no fue suficiente para inducir daño renal relacionado con la nefrotoxicidad (datos no mostrados). Por lo tanto, aumentamos la dosis a los utilizados en este estudio (Figura 2B). Nuestro trabajo reveló un efecto dependiente de la dosis de cisplatino en la tasa de supervivencia después de la inyección con la inducción de daño del tejido renal 24 HPI como se muestra por la pérdida de estructura tubular, aumento de la infiltración inflamatoria, y alta tasa de muerte celular. Aquí, describimos dos técnicas para analizar el desarrollo de AKI inducida por cisplatino: citometría de flujo, para analizar la infiltración celular, y TUNEL, para medir la muerte celular. La citometría de flujo es una tecnología que mide las características físicas (tamaño y granularidad) y químicas (compuestos fluorescentes) de las células. Dentro del citómetro, la suspensión celular pasa a través de un líquido de vaina que organiza las células en una sola línea, lo que les permite pasar a través de un rayo láser una célula a la vez(Figura 3A). Un detector delante del haz de luz medirá la dispersión hacia adelante (FSC), que se correlaciona con el tamaño de la célula, y los detectores a un lado medirán la dispersión lateral (SSC) que se correlaciona con la granularidad de las células. Otros detectores medirán la fluorescencia de partículas, proteínas fluorescentes o células etiquetadas con anticuerpos39,40. Como los anticuerpos comerciales para el pez cebra son escasos hoy en día, el uso de reporteros de animales y biomarcadores fluorescentes permite mejorar este análisis e identificar diversas poblaciones celulares41,42,43. Otra herramienta utilizada en este protocolo fue el ensayo terminal de transferencia de desoxinucleótilo (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL). El ensayo TUNEL es un método de detección de apoptosis en etapa tardía que se basa en la capacidad del TdT para identificar adn fragmentado y etiquetarlo con desoxinucleótidos etiquetados con un marcador fluorescente que más tarde se puede visualizar y cuantificar mediante microscopía44 (Figura 3B). Teniendo en cuenta que una de las características más llamativas de la AKI es la inducción de la apoptosis en las células renales tubulares3,esta técnica es extremadamente ventajosa ya que se puede analizar mediante citometría de flujo y/o microscopía.
Los enfoques presentados en este artículo permiten la observación del estado de AKI y ofrecen un nuevo modelo agudo para estudiar los trastornos de AKI que pueden ser útiles para la investigación de nuevas dianas terapéuticas en AKI relacionada con cisplatino.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

La cisplatino se utiliza comúnmente como quimioterapia. Aunque tiene efectos positivos en individuos tratados con cáncer, cisplatino puede acumularse fácilmente en el riñón debido a su bajo peso molecular. Tal acumulación causa la muerte de células tubulares y puede inducir el desarrollo de lesión renal aguda (AKI), que se caracteriza por una rápida disminución en la función renal, daño tisular, y la infiltración de células inmunes. Si se administra en dosis específicas cisplatino puede ser una herramienta útil como inductor AKI en modelos animales. El pez cebra ha aparecido como un modelo interesante para estudiar la función renal, la regeneración renal y las lesiones, ya que las estructuras renales conservan similitudes funcionales con los mamíferos. El pez cebra adulto inyectado con cisplatino muestra una menor supervivencia, muerte de células renales y un aumento de los marcadores de inflamación después de 24 h después de la inyección (HPI). En este modelo, la infiltración de células inmunes y la muerte celular se pueden evaluar mediante la citometría de flujo y el ensayo TUNEL. Este protocolo describe los procedimientos para inducir AKI en peces cebra adultos mediante inyección intraperitoneal de cisplatino y posteriormente demuestra cómo recoger el tejido renal para el procesamiento de citometría de flujo y el ensayo TUNEL de muerte celular. Estas técnicas serán útiles para entender los efectos del cisplatino como agente nefrotoxico y contribuirán a la expansión de los modelos AKI en peces cebra adultos. Este modelo también se puede utilizar para estudiar la regeneración renal, en la búsqueda de compuestos que tratan o previenen el daño renal y para estudiar la inflamación en AKI. Además, los métodos utilizados en este protocolo mejorarán la caracterización del daño tisular y la inflamación, que son dianas terapéuticas en las comorbilidades asociadas a los riñones.

El riñón del pez cebra es un órgano pigmentado plano situado en la pared dorsal y su unidad funcional básica, el nefrón, se conserva con mamíferos (Figura 1). La particularidad de tener un solo riñón con una alta capacidad de regeneración hace de este organismo modelo una excelente opción para la lesión renal modelo. Los protocolos presentados en este trabajo están diseñados para inducir AKI mediante la inyección intraperitoneal (i.p.) de cisplatino en peces cebra adultos(Figura 2)y posteriormente ser analizados por dos técnicas detalladas antes: citometría de flujo (Figura 3A) y TUNEL (Figura 3B). Un diagrama de flujo de todo el proceso se representa en la Figura 4. Las dosis de cisplatino se aplicaron inicialmente sobre la base de las descritas en los modelos de ratón15,16,17, en los que la norma utilizada es de 10-13 mg de cisplatino por kg de animal (mg/kg). Sin embargo, el pez cebra demostró ser más resistente al cisplatino que el ratón (datos no mostrados), y la dosis final se incrementó. Cuando evaluamos la tasa de supervivencia de los animales, los experimentos mostraron un efecto dependiente de la dosis de cisplatino (Figura 5A). Debido a esto, recomendamos seguir las instrucciones exactamente como se explica en este protocolo y monitorear la tasa de supervivencia de los animales constantemente como una medida de reproducibilidad, antes de recoger cualquier material. Después de la inyección de 120 μg/g de cisplatino(Figura 5A,línea roja),se observó una disminución en la supervivencia de alrededor del 30% de los animales en las primeras 24 h y la supervivencia disminuyó gradualmente hasta llegar a alrededor del 20% de los animales vivos en el día 5 después de la inyección, luego estabilizado(Figura 5A). La toxicidad de cisplatino no se vio afectada por el sexo de los animales, ya que los machos y las hembras tienen curvas de supervivencia similares(Figura 5B).
El análisis de la cinética de la AKI inducida por cisplatino mostró un aumento de la inflamación y la muerte celular en el riñón 24 HPI. Una de las formas más rápidas y cuantitativas de evaluar la inflamación es la citometría de flujo, pero dada la falta de anticuerpos contra los antígenos de pez cebra disponibles comercialmente para esta técnica, es necesario utilizar una línea transgénica con un marcador inmune. Hoy en día, muchas líneas de pez cebra que etiquetan las células inmunes son accesibles(Tabla 1). Estas líneas se pueden utilizar individualmente o en combinación, dado el repertorio suficiente para el análisis48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Esto simplifica enormemente la técnica ya que no es necesario ningún paso de incubación de anticuerpos, por el contrario, después del aislamiento de las células por separación mecánica, la lectura directa en el citómetro es posible.
Como se mencionó anteriormente, el riñón del pez cebra no es sólo un órgano de filtración de sangre con funciones homeostáticas, sino también el sitio anatómico de hematopoyesis en adultos, equivalente a la médula ósea en mamíferos33,34,35. De esta manera cuando lo analizamos por citometría de flujo es posible diferenciar las poblaciones celulares comparables a la sangre humana61,62 (Figura 6A),esto nos permite identificar las poblaciones celulares inicialmente por tamaño y granularidad y excluir los desechos. En este caso, utilizamos una línea transgénica llamada Tg(mpo:GFP)52 que expresa una proteína fluorescente verde (GFP) junto con la enzima mieloperoxidasa, que está presente en los neutrófilos. Sabiendo esto, nuestra estrategia de puerta se basó en la separación inicial de la población del granulocito (Figura 6B). Después de esto, se excluyeron las células de doblete, ya que pueden alterar significativamente el análisis y conducir a conclusiones inexactas. Un doblete es un único evento que consta de 2 partículas independientes y se puede excluir seleccionando una altura de dispersión hacia delante (FSC-H) frente a una gráfica de densidad de área de dispersión directa (FSC-A) (Figura 6C). Después de este paso, se identificaron y seleccionaron las celdas que expresaron el marcador fluorescente (Figura 6D). Por último, las estadísticas de población se extrajeron del análisis y se trazaron como porcentaje de células (Figura 6E).
Una de las características más destacadas de la nefrotoxicidad cisplatino es la muerte celular tubular10,y para visualizar fácilmente esto utilizamos el ensayo TUNEL para la detección de apoptosis. Este método recomienda el uso de células y tejidos de tipo salvaje que carecen de marcadores fluorescentes, ya que la fluorescencia paralela interferiría con el análisis, en el caso del pez cebra se recomienda utilizar líneas de tipo salvaje, como AB, Tübingen, TAB, o una línea transgénica con una proteína fluorescente que no interfiere con el color de fluorescencia TUNEL. La técnica TUNEL permite el análisis a través de citometría de flujo o microscopía. La microscopía tiene la ventaja de conservar la estructura del tejido, lo que permite ver qué células están muriendo. Bajo el microscopio fluorescente, los núcleos brillantes de las células apoptóticas se pueden diferenciar fácilmente del fondo. Los animales inyectados con cisplatino(Figura 7B)tienen más células muertas que el control(Figura 7A)a 24 CV. La cuantificación final se hizo con la opción de contador celular de FIJI Software y mostró estadísticamente más células muertas en riñones tratados con cisplatino que en los controles (Figura 7C)
El protocolo descrito en este manuscrito mostró cómo utilizar cisplatino como inductor de AKI en peces cebra adultos, que es dosificante, rápido y confiable. Sobre la base de los datos obtenidos de las tasas de supervivencia y la medición de signos de nefrotoxicidad de cisplatino incluyendo inflamación (detectada por citometría de flujo) y muerte celular (detectada por ensayo TUNEL), proponemos este modelo para el estudio de la nefrotoxicidad cisplatino, así como para futuros tratamientos en enfermedades relacionadas con AKI.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig01.jpg"> Figura 1: Estructura y comparación de peces cebra y riñones humanos. R. (1) Vista lateral de un pez cebra adulto con el riñón representado en marrón oscuro situado en la pared dorsal del pez, entre la vejiga de natación (sb) y la columna vertebral. (2) Vista ventral del riñón que muestra nefrones (amarillo) conectados al conducto de recogida (azul). Las diferentes regiones del riñón están marcadas: cabeza (H), tronco (Tr) y cola (Ta). (3) Esquemático que representa a los nefrones de pez cebra y sus segmentos etiquetados y coloreados para que coincidan con las regiones genéticamente conservadas con el nefrón humano. B. (1) Vista sagital de un riñón humano. (2) Esquemático que representa un nefrón humano con segmentos etiquetados y coloreados. RC: cuerpo renal; PCT: tubérculo convolución proximal; PST: tubérculo recto proximal; TL: extremidad delgada; LH: Bucle de Henle; TAL: extremidad ascendente gruesa; DE: distal temprano; DL: distal tarde; DCT: tubérculo distal enrevesado; CD: recogida de conductos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig02.jpg"> Figura 2: Diseño experimental para AKI inducido por cisplatino. R. Vista lateral y ventral del pez cebra adulto apuntando la posición de la aguja durante el procedimiento de inyección. La aguja penetra en un ángulo de 20-30° desde el vientre y se inserta lentamente paralela a la pared ventral evitando perforar las vísceras. B. Diseño experimental de AKI inducido por cisplatino: (1) Inyección de cisplatino 120 μg/g por animal en el día cero. (2) Antes de intentar el paso 3, se recomienda el monitoreo de supervivencia de peces después de la inyección desde el primer día hasta el día diez. (3) Disecciones renales un día después de la inyección de cisplatino para técnicas de procesamiento posteriores. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig03.jpg"> Figura 3: Mecanismos de citometría de flujo y técnicas TUNEL. R. Visión general del citómetro de flujo: una suspensión de las células se centra hidrodinámicamente en una sola línea por un fluido de vaina, haciendo que las células pasen una por una delante de un rayo láser. Los detectores delante y en el lado miden la dispersión hacia adelante (FSC), la dispersión lateral (SSC) y la fluorescencia de las células. B. Principio de ensayo TUNEL. La terminal dexnucleótido transferasa (TdT) media la adición de un dUTP marcado fluorescente a 3'-OH extremos de un ADN fragmentado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig04.jpg"> Figura 4: Diagrama de flujo de técnicas representadas. R. Un diagrama de flujo que muestra los pasos a seguir al elegir analizar el tejido renal a través de la citometría de flujo (naranja) o TUNEL (azul), al inducir AKI mediante inyección de cisplatino (gris). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig05.jpg"> Figura 5: Seguimiento de supervivencia de los peces inyectados de cisplatino. R. Tasa de supervivencia de diferentes dosis de inyecciones de cisplatino (25 - 50 - 112.5 - 120 μg/g). Prueba de rango de registro (Mantel-Cox), ** p < 0,01. B. Tasa de supervivencia de machos frente a hembras inyectadas con 120 μg/g de cisplatino. Prueba de rango de registro (Mantel-Cox), *** p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig06.jpg"> Figura 6: Estrategia de puerta para la línea transgénica de peces cebra. R. Parcela de densidad de células renales adultas de pez cebra, poblaciones separadas por tamaño (FSC-A) y granularidad (SSC-A). Diferentes poblaciones son seleccionadas por óvalos/círculos de color. Rosa: Eritroide; Negro: linfoide; Amarillo: Precursores; Rojo: Granulocitos. B. Parcela de densidad de área de dispersión lateral (SSC-A) y área de dispersión hacia adelante (FSC-A) para la selección de la población de granulocitos en el riñón. C. Parcela de densidad de dispersión hacia adelante alta (FSC-H) y área de dispersión hacia adelante (FSC-A) para la selección de la población de singletes dentro de la puerta de granulocitos. D. Gráfica de densidad de área de dispersión hacia adelante (FSC-A) y FITC-A:MPO para la selección de células positivas mpo:GFP (neutrófilos) en el riñón. Una población positiva se considera alrededor de 103 encendidos, de intensidad de fluorescencia. E. Gráfico del porcentaje de células positivas mpo:GFP (neutrófilos) en Control frente a animales cisplatino, 24 hpi . Prueba tno a la que se desea. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig07.jpg"> Figura 7: Ensayo TUNEL de peces inyectados de cisplatino. R. Microfotógrafos de riñón adulto fijo 24 h después de 120 μg/g de inyección de cisplatino. Los controles se inyectan con 0,9% NaCl. Las células positivas tunel (células apoptóticas) están manchadas de rojo (flechas blancas). DAPI (azul) se utiliza como contramanifesta nuclear. Barra de escala: 50 μm. 20x de ampliación. B. Gráfico que muestra la cuantificación del número de células muertas en el riñón por campo 20x. T -testsin aparar, * p < 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Línea transgénica</td>
			<td>Tipo de celda etiquetado</td>
			<td>Referencias</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(spi1:EGFP)pA301</td>
			<td>Células mieloides</td>
			<td>200348 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(zpu1:GFP)</td>
			<td>Células mieloides</td>
			<td>200449 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mhc2dab:GFP)sd6</td>
			<td>monocitos</td>
			<td>201150 </td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lysC:DsRED2)</td>
			<td>Neutrófilos</td>
			<td>200751 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpo:GFP)</td>
			<td>Neutrófilos</td>
			<td>200652 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:mCherry)</td>
			<td>Macrófagos</td>
			<td>201153 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:Dendra2)</td>
			<td>Macrófagos</td>
			<td>201354 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lck:GFP)</td>
			<td>Células T</td>
			<td>200455 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TgBAC(ikaros:EGFP)</td>
			<td>Células T</td>
			<td>200956 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag1:GFP)</td>
			<td>Células T</td>
			<td>199957 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag2:GFP)</td>
			<td>Células T</td>
			<td>200158 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg (CD79:GFP)</td>
			<td>Células B</td>
			<td>201759 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(CD45:DsRed)</td>
			<td>leucocitos</td>
			<td>200860 
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: Líneas transgénicas de pez cebra para células inmunes. Tabla que reanuda los nombres de las líneas de reportero de pez cebra con el tipo respectivo de célula inmune etiquetada y los artículos de referencia donde se construyeron. Una combinación de estas líneas de pez cebra puede ofrecer nuevas posibilidades de selección celular por citometría de flujo.

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Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Este protocolo describe los procedimientos para inducir lesiones renales agudas (AKI) en peces cebra adultos utilizando cisplatino como agente nefrotoxico. Detallamos los pasos para evaluar la reproducibilidad de la técnica y dos técnicas para analizar la inflamación y la muerte celular en el tejido renal, la citometría de flujo y tunel, respectivamente.

Modelo de lesión renal aguda inducida por cisplatino en pez cebra adulto

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

El objetivo general de este procedimiento, se explica el uso de cisplatino como agente nefrotoxico en peces cebra adultos, analizando la inflamación, y la muerte celular en el tejido renal. Para lograr esto y los peces cebra adultos se anestesian y pesan para inyectar en una dosis específica de cisplatino en la cavidad peritoneal. Después de controlar la mortalidad, el riñón se disecciona y las células están aisladas para la citometría de flujo o fijas y diseccionadas para ser analizadas por ensayo fluorescente TUNEL.Los siguientes procedimientos pueden ayudar a responder preguntas clave en el campo renal utilizando los efectos nefrotoxicos del cisplatino como herramienta para desarrollar un modelo de lesión renal aguda y peces cebra adultos. Este modelo se puede utilizar para la exploración de nuevas dianas terapéuticas en la protección renal, así como para dilucidar el mecanismo de regeneración en el riñón de pez cebra. Cisplatino es un agente de quimioterapia utilizado para tratar una variedad de cáncer.Sin embargo, puede acumularse fácilmente en el riñón, generando muerte celular, inflamación y disminuir la función renal. El efecto de cisplatino depende de la dosis, por lo que puede reducir nuestro aumento de la dosificación dependiendo de sus objetivos. Las técnicas utilizadas aquí para analizar la inflamación y la muerte celular no son exclusivamente para la difusión del modelo de enfermedad.La citometría de flujo en peces cebra puede ayudar a dilucidar los estados inflamatorios del animal de forma cuantitativa, mientras que en TUNEL decimos que puede aclarar la presencia de células pobladas en los contextos fisiológico y patológico. Antes de comenzar el experimento, prepare la solución de trabajo de cisplatino diluyendo la solución de stock a 820 microgramos por mil en cloruro de sodio al 0,9%. A continuación, anestesia otro pez cebra y seca el exceso de agua en algunas toallas de papel.Pesar el pescado colocándolos en una báscula, tomando nota del peso. Haga los cálculos para conocer el volumen exacto que desea inyectar. Para lograr la dosis de 120 microgramos por gramos de peso, utilice la siguiente fórmula.Divida la dosis final por la dosis de la solución de trabajo y convierta este número en microlitros, multiplicándose por 1000 para obtener el volumen de 120 microgramos de cisplatino. A continuación, multiplique este número por el peso de los peces para obtener el volumen final que se va a inyectar. Coloque un pez sobre una esponja húmeda, con una taza pequeña para sostenerlo.Con el lado ventral hacia arriba y llenar una jeringa de insulina con un volumen calculado de cisplatino. Inserte la aguja en la línea media ventral en un ángulo poco profundo, tirando suavemente de la pared ventral hacia arriba para evitar perforar los órganos internos. Y luego inyectar la solución.Después de la inyección, coloque un pez en un tanque para recuperarse de la anestesia, y espere a signos de recuperación como nadar y movimientos apropiados. Monitoree para que los peces dos veces al día para los próximos días. A esta dosis, la cisplatino induce alrededor del 30% de la mortalidad en las primeras 24 horas.Eutanasia los peces y seca el exceso de agua en una toalla de papel. Después de extraer la cabeza y los órganos internos, utilice agujas de disección para fijar las paredes del cuerpo. Localice el riñón en la pared dorsal del pez y use fórceps para separar el riñón.Coloque el riñón en una placa de seis pozos con una solución fría de un PBS 1X, 2% FBS y manténgalo en hielo. A continuación, recoja el tejido con un poco de líquido y páselo a través de un colador de células de 40 micras, y macere suavemente el tejido con un émbolo de jeringa. Lave dos veces con un PBS 1X, 2% FBS.Y recoger las células en un tubo de halcón de 50 mils. A continuación, centrífuga durante cinco minutos a 400 G.Careful recoger el sobrenadante con una pipeta y desecharlo. Agregue 500 microlitros de PBS frío 1X para volver a suspender las células y colocarlas en un tubo de citometría de flujo de cinco mils.Mantenlos en hielo. Tome 10 microlitros de la muestra y mézclala con 90 microlitros de color azul tripán en un tubo Eppendorf. Añadir 10 microlitros de la mezcla a una cámara Neobauer y contar células en el microscopio.Tome las celdas para ser leídas por un cytometer y luego analice los resultados seleccionando la población de sus intereses. Para este procedimiento, eutanasia un pez y elimina los órganos internos que dejan el riñón unido al cuerpo. A continuación, ancle las paredes del cuerpo a una superficie de corcho y colóquela gradualmente sobre la solución de fijación.Mantenlo a cuatro grados durante la noche. Al día siguiente, disecciona el riñón con la cep fina. Trata de no interrumpirlo.Colóquelo en una pequeña placa de Petri o en un tubo Eppendorf con 1X PBS para enjuagar. Cambie el PBS y prepare el 2% de agarose para generar una matriz de soporte para el riñón antes de procesarlo sólidamente. Deseche todos los PBS restantes y vierta la agarose lentamente.A continuación, coloque el riñón con fórceps finos para evitar que se doble. Deje que la agarose se solidifique a temperatura ambiente. Después de la solidificación de la agarose, use un bisturí para cortar Agarose alrededor de los riñones formando un cubo pequeño.Coloque los cubos de agarose dentro de un casete histológico y envíelo para su procesamiento histológico para incrustar el tejido en la parafina. Los bloques de parafina, luego cortaremos en cinco secciones de espesor de micras. Descerar se desliza y mantenerlos en agua destilada.Prepare una cámara de incubadora oscura, poniendo toallas de papel mojado en la parte inferior. Coloque las diapositivas en la cámara oscura y agregue Proteinase K para la permeabilización del tejido. Incubar durante 30 minutos a 37 grados centígrados.Mientras se incuban muestras, prepare la mezcla de reacción TUNEL, añadiendo 50 microlitros de solución enzimática en 450 microlitros de solución de etiquetas. Y mantenerse protegido de la luz. Coge la cámara oscura y lava la rebanada dos veces con un PBS 1X.A continuación, seque los toboganes y sobre la mezcla de reacción TUNEL. E incubar a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de la incubación, lave estas diapositivas de nuevo con un PBS 1X.Y agregue DAPI para la tinción del contador de núcleos. Incubación a temperatura ambiente durante cinco minutos, protegida de la luz. Enjuague tres veces con un PBS 1X.Y luego, moldear las diapositivas con un medio hidrófilo anti-fundido. Coloque un resbalón de cubierta. Y sellar con esmalte de uñas.Visualice las muestras en un microscopio fluorescente. En este gráfico, es posible ver que la cisplatino tiene un efecto de respuesta de dosis sobre la supervivencia de los peces, en comparación con un control inyectado sólo con cloruro de sodio al 0,9%. La línea roja en este gráfico representa una dosis de 120 microgramos por gramos utilizados en este video.Esta dosis se puede aplicar a hombres y mujeres, ya que no se encontró ninguna diferencia estadística entre ellos. La citometría de flujo permite cuantificar diferentes células presentes en un tejido. Las poblaciones de células hematopoyéticas se identifican en el riñón de varios peces por tamaño o dispersión hacia adelante y dispersión de granularidad o tamaño.De esta manera, es posible separar las poblaciones en eritrocitos, linfocitos, granulocitos y precursores hematopoyéticos. Aquí, la estrategia actual de la puerta que selecciona los granulocitos, singletes y células positivas MPO permite encontrar la población de los neutrófilos en el riñón marcado por la expresión de fluorescencia de la mieloperoxidasa. En este caso, la inyección de cisplatino indujo el aumento en el porcentaje de neutrófilos presentes en el riñón.El ensayo TUNEL permite detectar células apoptóticas en un tejido observando la caída del tejido del riñón por un microscopio de fluorescencia, es posible ver una señal apoptótica dentro de los núcleos de algunas células, aquí en rojo. Contrastado por una mancha nuclear en un DAPI de este tipo aquí en azul. Inyección de cisplatino aumentó la presencia de células apoptóticas en el riñón, que son posibles de cuantificar manualmente o utilizando un software de imagen.Al final de este video usted debe ser capaz de saber cómo inyectar y ajustar la dosis de cisplatino para inducir lesiones renales agudas en peces cebra adultos. Y cómo diseccionar el riñón para diferentes propósitos. La citometría de flujo es una excelente herramienta que le ayudará a entender el perfil de diferentes tipos de células dependientes de la disponibilidad de líneas de tragenclave en su laboratorio.Recuerde considerar el color de las líneas de transportadores si desea utilizar anticuerpos para etiquetar todos sus tipos de celdas. El ensayo TUNEL es una herramienta sencilla que nos permite detectar células y tejidos apoptóticos, y puede ser analizado no sólo por microscopía, sino también por citometría de flujo. Recuerde, utilice siempre equipos de protección personal durante todo el procedimiento.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

La presión de la ventilación controlada para inducir la lesión pulmonar aguda en ratones

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

Investigación

Medicina

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

Un In vivo Modelo de roedores de la contracción inducida por la lesión y la monitorización no invasiva de la recuperación

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

The Spared Nerve Injury SNI Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

La lesión del nervio Salvados (SNI) Modelo de alodinia mecánica inducida en ratones

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Evaluación de los cambios teratogénicos en un modelo de pez cebra de la exposición fetal al alcohol

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

La isquemia-reperfusión modelo de lesión renal aguda y post lesión fibrosis en ratones

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

Un posible modelo de pez cebra de la enfermedad renal poliquística: Derribo de<em&gt; Wnt5a</em&gt; Causas Los quistes en el pez cebra Riñones

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis inducida por isquemia focal como un modelo de lesión de médula espinal en ratones

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Lavado inducida por agotamiento de surfactante en los cerdos como modelo del síndrome de distrés respiratorio agudo (SDRA)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

La traqueostomía abierta ácido gástrico aspiración modelo murino de lesión pulmonar aguda Resultados en máxima no letal aguda lesión pulmonar

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...