Name: acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish
Uploaded: 2021-05-15T13:00:00
Duration: 13 min 25 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Denna forskning stöddes av Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP (2015/21644-9; 2017/05264-7; 2017/05687-5; 2018/20722-4), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) och Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), finansiell kod 001. Vi tackar våra medarbetare vid Laboratoriet för Maria Rita dos Santos e Passos-Bueno's och Zebrafish Facility of the Genetics and Evolutionary Biology Department, vid Bioscience Institute vid Universitetet i São Paulo. Vi tackar Cristiane Naffah de Souza Breda och Theresa Raquel de Oliveira Ramalho för kommentarerna och förslagen om manuskriptet. Vi uppskattar och tackar Marcio Villar Martins, från multimediateamet vid Institute of Biomedical Sciences, för inspelningen, utgåvan och produktionen av denna video.

De förfaranden som beskrivs i detta protokoll har tidigare godkänts för att användas i zebrafiskmodellen av Animal Use Ethics Committee vid Institute of Biomedical Sciences vid universitetet i São Paulo.
1. AKI induktion av Cisplatin intraperitoneal injektion
<ol><li>Bered cisplatin arbetslösning genom att späda ut stamlösningen till 850 μg/ml i 0,9% NaCl. Förvaras i rumstemperatur, skyddad mot ljus. VARNING: Tyget rekommenderar manipulering av cisplatin med personlig skyddsutrustning (PPE) inklusive skyddsglasögon, handskar och labbrock. Förvara lagerlösningen i rumstemperatur, skyddad mot ljus.</li>
	<li>Bered 150 mg/L MS-222 (Tricaine) bedövningsmedel i systemvatten45. Söv vuxna zebrafisk (5-9 månader) genom nedsänkning i ca 1-2 min. OBS: Effektivt bedövad fisk bör vara oansvarig att röra vid. För att testa effektiv anestesi, tryck försiktigt på kaudalfenan för att observera reaktionen. VARNING: Tricaine är irriterande för hud och ögon, använd PPE för att manipulera.</li>
	<li>Använd en plastsked överför fisken till en absorberande yta, såsom pappershanddukar, för att ta bort överflödigt vatten runt kroppen. Överför sedan fisken till en petriskål över en skala och väg fisken med plastskeden. Notera fiskens vikt eftersom det kommer att vara nödvändigt för dosberäkningar. OBS: Att absorbera överflödigt vatten från fisk förhindrar överskattning av djurets vikt, torka inte för mycket eftersom det är skadligt för fisken.</li>
	<li>För att uppnå den slutliga dosen på 120 μg/g vikt, dividera μg av den slutliga dosen (120 μg) enligt cisplatinarbetslösningens μg (850 μg) och omvandla detta tal till mikroliter (μL) genom att multiplicera för 1000, för att få volymen 120 μg cisplatin (141,2 μL). Multiplicera sedan detta tal (141,2 μL) för fiskens vikt (g) för att få den slutliga volymen att injiceras.</li>
	<li>Med en plastsked överför du fisken på en våt svamp med ett litet snitt för att hålla den, med ventralsidan upp. Svampen ska vara våt med bedövningsmedel i systemvatten.</li>
	<li>Fyll en insulinspruta på 31 G 1,0 ml med den beräknade volymen cisplatinarbetslösning.</li>
	<li>För in nålen i djurets intraperitoneala del nära bäckenfenan, i en grund vinkel för att undvika att visceran punkteras (figur 2A). Injicera sedan långsamt lösningen.</li>
	<li>Efter injektion placera fisken i en tank för att återhämta sig från anestesi. Se upp för fisken efter tecken på normal återhämtning(t.ex. simrörelser, rörelserörelser). OBS: Djuret bör återhämta sig under de kommande 3-5 min. Om det behövs stimulera fisken genom att flytta den med en plastsked, en Pasteur plastpipett eller lägga den nära en slang med bubblor.</li>
	<li>För kontrollfisk, utför samma procedur genom att injicera en lösning på 0,9% NaCl. Använd samma beräkning efter kroppsviktens andel: volymen som ska injiceras kommer att vara 141 μL multiplicerad med fiskens vikt (g).</li>
	<li>Övervaka fiskens överlevnad minst två gånger om dagen under de följande dagarna (figur 2B).</li>
</ol>2. Njurisolering och vävnadsbehandling för flödescytometri i immunceller
<ol><li>För detta förfarande, använd immuncellsfluorescerande märkta transgena djur(t.ex.Tg (mpo:GFP)).</li>
	<li>Efter 24 hpi på 120 μg/g cisplatin avlivar du djur genom hypotermisk chock (snabb kylning). OBS: Hypotermisk chock har visat sig vara effektivare som dödshjälpsmetod än MS-222 överdosering. Hypotermisk chock är mindre stressande, snabb, konsekvent och säkrare för personalen än användningen av MS-222, har tidigare beskrivit46,47.</li>
	<li>I en yttre korsningstank förbered isvatten i ett 5:1-förhållande mellan is och systemvatten, sätt den inre tanken med en skärm över isen, vänta tills vattnet når 2-4 °C. OBS: Fiskar bör inte vara i direkt kontakt med isen, eftersom detta kan orsaka termiska brännskador och smärta.</li>
	<li>Överför djur till isvatten, vänta minst 10 minuter tills det finns förlust av orientering och ingen operkulär rörelse.</li>
	<li>Med en plastsked, placera fisken på pappershanddukar för att torka av överflödigt vatten.</li>
	<li>Överför fisken till en 3% agarose dissekeringsplatta och ta den under ett stereoscope med övre ljus. Med sax, halshugg fisk som gör ett snabbt snitt precis bakom ögonen och ta bort huvudet.</li>
	<li>Med fin sax gör ett snitt från den öppna sidan till cloaca och ta bort de inre organen med fina tång.</li>
	<li>Använd insektsstift för att nypa sidorna av kroppsväggarna för att öppna slaktkroppen och exponera njuren fäst vid ryggraden.</li>
	<li>Lossa njuren med fina tångar och placera organet i en 6 brunnsplatta med en kall lösning på 1x PBS/2% FBS. Håll dig på is.</li>
	<li>Plocka upp vävnaden med en Pasteur plastpipett och passera vävnaden genom en 40 μm cellsil över ett 50 ml-rör och macerera försiktigt med en sprutkolv.</li>
	<li>Tvätta två gånger med 1 ml 1x PBS/2% FBS och samla cellerna i ett 50 ml rör.</li>
	<li>Centrifugceller vid 400 × g i 5 min vid 4 °C.</li>
	<li>Plocka försiktigt upp all supernatant med en 1 ml mikropipett och kassera den. Tillsätt 500 μL kall 1x PBS för att återanvända cellerna och placera dem i 5 ml flödescytometrirör. Håll dig på is.</li>
	<li>Räkna celler i Neubauer-kammaren som gör en utspädning på 1:10 i Trypan Blue(t.ex.ta 10 μL av provet och blanda med 90 μL trypanblått). Tillsätt 10 μL av blandningen till en Neubauerkammare och räkna celler under mikroskopet. OBS: Optimala resultat förväntas med 1-5 x 106 celler/ml och >80% livskraft. VARNING: Trypan blue är ett cancerframkallande medel, använd personlig skyddsutrustning för att hantera.</li>
	<li>Ta cellerna för att läsas av en cytometer. Analysera sedan resultaten som väljer den intressepopulation som ska väljas.</li>
</ol>3. Bearbetning av vuxen zebrafisk njurvävnad för TUNEL-analys
<ol><li>För detta förfarande, använd vilda djur(t.ex.AB, Tübingen, etc.) eller ett transgent djur med annan fluorescerande färg än TUNEL-satsen, eftersom liknande fluorescens kan störa TUNEL: s analys.</li>
	<li>Efter 24 hpi på 120 μg/g cisplatin avlivar du djur genom hypotermisk chock (snabb kylning). Se 2.3-2.4.</li>
	<li>Dissekera fisken enligt beskrivningen i 2.5-2.6; njuren måste förbli fäst vid ryggraden under fixeringsproceduren (förklaras nedan).</li>
	<li>Använd insektsstift, nyp sidorna av kroppsväggarna för att öppna slaktkroppen och fästa den på en korkyta för att hålla njuren exponerad. OBS: Denna procedur säkerställer att njuren förblir i rätt position för senare analys.</li>
	<li>Placera sedan korkytan med njuren vänd nedåt i en 6 brunnsplatta över en nygjord lösning av 4% paraformaldehyd (PFA). Håll den över natten vid 4 °C. VARNING: PFA är cancerframkallande och irriterande för hud- och slemhinnor. Förbered PFA-lösningar under en kemisk huva med hjälp av personlig skyddsutrustning inklusive ögonskyddsutrustning.</li>
	<li>Nästa dag dissekerar njurarna som i 2,8. Placera njurarna i en 60 mm Petri-skål med 1x PBS och skölj två gånger i 1x PBS.</li>
	<li>Förbered 2% agarose för att generera en stödmatris för vävnaden.</li>
	<li>Kassera alla återstående 1x PBS från Petri-skålen och häll 2% agarose långsamt för att täcka hela organet. Placera sedan njuren med fina tångar under ett stereomikroskop för att förhindra att njuren viks. Låt agarose stelna vid rumstemperatur. OBS: Denna procedur kommer att hålla orienteringen och formen på organet genom histologisk bearbetning eftersom den bladliknande formen av organet orsakar en tendens att vika om det inte är inuti en stödjande matris.</li>
	<li>Efter agarose stelning, använd en skalpell för att skära agarose runt vävnaden, bilda små kuber och ta bort överskottet av agarose runt vävnaden.</li>
	<li>Placera agarosabitarna i en kassett som lämpar sig för histologisk bearbetning. OBS: Följande steg kan göras manuellt eller i en automatisk vävnadsprocessor.</li>
	<li>Bearbeta först vävnaden i kassetten enligt nästa steg i 45 minuter vardera vid rumstemperatur: ett bad på 50% etanol, ett bad av 70% etanol, två på varandra följande bad på 95% etanol och tre på varandra följande bad av 100% etanol. Därefter bearbeta vävnaden i två på varandra följande bad av Xylen och tre på varandra följande bad av paraffin; den senare varar 1 timme vardera vid 60 °C. VARNING: Gör ändringar under en kemisk huva, ångor från etanol och xylen är irriterande och giftiga.</li>
	<li>För att förbereda paraffinblock, smält paraffinlinser till 60 °C.</li>
	<li>Öppna plastkassetten med vävnaden inuti och håll den på en varm tallrik. Uppvärmning metallformar för paraffin.</li>
	<li>Med pincett placera vävnaden över en metallform så att njurlängden är parallell med mögelbasen. Tillsätt paraffin, omfördela vävnaden om det behövs.</li>
	<li>Täck formen med kassettens botten och tillsätt paraffin tills gallret är täckt. Låt stelna vid rumstemperatur och placera sedan vid -20 °C för en snabbare stelningsprocess.</li>
	<li>Släpp paraffinblock från metallformen cirka 20-30 min senare.</li>
	<li>Med en mikrotom, dela vävnaden inbäddad i paraffin till 5 μm tjocklek. Använd silaniserade eller positivt laddade glasrutschbanor för att samla upp vävnaden.</li>
</ol>4. TUNEL-analys
OBS: Följande protokoll använder ett In Situ Cell Death Detection Kit (Table of Materials).
<ol><li>Dewax vävnad glider placera dem i två på varandra följande bad av xylen i 5 min. Återfukta sedan vävnaden genom en graderad serie etanol: 100%-95%-70%-50%, i 5 min vardera.</li>
	<li>Placera diabilder i rinnande kallt kranvatten för att skölja av etanolen. Förvara rutschkanorna i destillerat vatten.</li>
	<li>Förbered en mörk inkubatorkammare. Tillsätt våta pappershanddukar på botten för att hålla fukten under inkubationsstegen. OBS: I brist på en inkubatorkammare är det möjligt att använda en Petri-skål med fuktigt papper i botten och två tandpetare för att placera bilden.</li>
	<li>Bered färsk Proteinase K arbetslösning:10 μg/ml i 10 mM Tris/HCl, pH 7,4-8. OBS: Proteinas K används som permeabiliseringsmedel, enligt tillverkarens rekommendation.</li>
	<li>Placera diabilderna i den mörka inkubatorkammaren och tillsätt Proteinase K arbetslösning tills de täcker proverna. Inkubera i 30 min vid 37 °C.</li>
	<li>Medan proverna inkuberar, förbered TUNEL-reaktionsblandningen: Tillsätt 50 μL enzymlösning till 450 μL-etikettlösning. Skydda mot ljus. OBS: Volymen som ska beredas kan justeras i samma 1:10-proportion. Volymen beräknas vara 50 μL av blandningen för varje sektion. Detta kan ändras beroende på provens storlek.</li>
	<li>Plocka upp den mörka kammaren och tvätta bilderna två gånger med 1x PBS.</li>
	<li>Torka sedan området runt provet med absorberande papper och tillsätt 50 μL TUNEL-reaktionsblandning över varje vävnadsrutschbana, sprid lösningen så att hela provet är täckt. Inkubera vid 37 °C i 2 timmar. Skydda mot ljus.</li>
	<li>Efter inkubation, skölj bilden tre gånger med 1x PBS och torka regionen runt provet med pappershanddukar.</li>
	<li>Tillsätt 50 μL DAPI 1:1000 till proverna, för kärnämnesdräckning och inkubera i 5 minuter vid rumstemperatur. Skydda mot ljus.</li>
	<li>Skölj igen tre gånger med 1x PBS och torka regionen runt provet.</li>
	<li>Montera rutschkanan med ett anti-fade hydrofilt medium, placera ett täckglas och försegla med nagellack. Förvara diabilder horisontellt, skyddade mot ljus vid 4 °C. OBS: Monteringsmediets anti-blekningsegenskaper är att bevara provexemplars fluorescens men är möjligt att använda alla tillgängliga hydrofila medier. Det sista tätningssteget med nagellack är avgörande för att undvika uttorkning.</li>
	<li>Visualisera proverna under ett fluorescensmikroskop. För denna typ av fluorescerande pigment, använd en excitation våglängd i intervallet 520-560 nm (grön) och detektion i intervallet 570-620 nm (röd).</li>
</ol>

Författarna har inget att avslöja.

Förekomsten av njursjukdom har fortsatt att öka över hela världen och blivit ett globalt folkhälsoproblem som påverkar miljontals människor63. Att hitta ett sätt att behandla njurskadade individer är av största vikt samt förstå mer om deras etiologi och progression. Flera studier har använt djurmodeller för att förstå njurskador. Zebrafisk njuren (Figur 1) har studerats i flera år i utvecklingsbiologi och skadeforskning på grund av dess självgenererande kapacitet och genetiska likhet29,64. Här presenterar vi en ny AKI-modell i vuxna zebrafiskar med cisplatins egenskaper som ett nefrotoxiskt medel, som beskriver stegen för att uppnå en snabb och akut reaktion med synliga skador så snart som 24 hpi (Figur 2). Dessutom förklarar vi här två tekniker som hjälper till att utvärdera vävnadsskadan efter cisplatininjektionen, flödescytometri och TUNEL (Figur 3).
Nuvarande AKI-modeller hos vuxna zebrafisk inkluderar i.p. injektion av gentamicin som inducerar omfattande skador i nephron och tubule förstörelse, neonephrogenesis händelser börjar från dag 5, och regenerering avslutas med 21 dagar efter injektion65. Å andra sidan fastställdes en modell av sepsis-associerade akut njurskada (S-AKI) av infektionen med Edwardsiella tarda, eftersom avsevärt ökade uttrycket av AKI-markörer, såsom insulinliknande tillväxtfaktorbindande protein-7 (IGFBP7), vävnadshämmare av metalloproteinaser 2 (TIMP-2) och njurskada molekyl-1 (KIM-1), i larver och vuxnazebrafiskar 66. Zebrafisken är känd för att vara ett höggenomströmningsdjur för sökning av terapeutiska medel och detta inkluderar användning av probiotika och mikrobiota-härledda metaboliter för att studera njurfunktion och regenerering67. De tillgängliga modellerna kan dock direkt påverka resultatet av dessa behandlingar. Således etablerade vi en annan metod för att inducera AKI hos vuxna zebrafiskar (Figur 4), med cisplatin som ett känt nefrotoxiskt medel som inte skulle ha direkta kända effekter på fiskens mikrobiota, liksom gentamicinmodellen för att vara ett antibiotikum, eller infektionen med E. tarda, för att vara en sepsismodell. Men samtidigt som vi utvecklade vårt cisplatinprotokoll undersökte en annan grupp också de nefrotoxiska effekterna av cisplatin hos vuxna zebrafiskar, vilket förenklade dosen till 10-20-30 μg per djur68. Även om de också visade cisplatin dosberoende effekt i överlevnad, rekommenderar vi försiktighet vid användning av en enda mängd cisplatin för alla fiskar, eftersom zebrafisk från samma ålder kan ha mycket olika storlekar och vikt och detta kan inducera variationer i resultaten69,70. Vi tycker att det är viktigt att justera dosen till djurets motsvarande vikt, som görs hos möss och denna studie.
I våra experiment med vuxna zebrafiskar visade cisplatin en dos-respons effekt. Detta visualiserades genom övervakning av djurens överlevnad efter cisplatininjektion (figur 5). Vi använde överlevnad som ett sätt att uppskatta intensiteten i dosen av cisplatin och inte som ett mått på nefrotoxicitet, eftersom inget annat fysiskt tecken är synligt under övervakningstiden. Detta kan vara jämförbart med gnagare, där svårighetsgraden av njurskadan kan moduleras genom doseringen och frekvensen av cisplatininjektion15, vilket uppnår dödliga doser med högre koncentrationer av cisplatin71. Död ses också under de följande dagarna i larvmodellen av cisplatin72. Eftersom vårt mål var att inducera en akut skada på några dagar, valde vi 120 μg/g dos cisplatin som möjligt för att observera njurskador 24 h efter injektionen, men detta kan justeras beroende på studiens mål.
Hos människor diagnostiseras AKI kliniskt av minskad glomerular filtreringshastighet (GFR), förhöjt serum kreatinin och blod urea kväve3. I zebrafisk innehåller repertoaren av AKI-modeller några genetiska villkorligamodeller 73,74 och vissa läkemedelsrelaterade modeller65,72, men eftersom några av AKI-funktionella parametrar inte kan mätas på zebrafisk på grund av tekniska svårigheter(t.ex. blodsamling), antar de flesta forskning morfologiska och visuella tekniker för att observera funktionerna i AKI1,75 som vår studie.
Hos gnagare kommer cisplatin in i epitelcellerna i de proximala och distala tubulerna, inuti cellen genomgår metabolisk aktivering och blir mycket reaktivt på cellorganeller och inducerar förändringar i cellstrukturen. Dessa förändringar kan inducera apoptos och autofagi och till och med nekros, vid mycket höga doser. Som svar på denna skada frigörs många cytokiner och leukocyter rekryteras vilket leder till inflammation och påverkar organets funktionalitet15. Detta belyser vikten av att bedöma vilken typ av celler som finns i den skadade njuren, som invånare eller infiltrerade immunceller. Här visade vi hur man bedömer detta genom flödescytometri, med hjälp av de transgena immunreporterlinjer som finns tillgängliga nuförtiden (Tabell 1). Cisplatin ökade andelen neutrofiler(mpo:GFP-positiva celler) i njuren 24 timmar efter injektionen (figur 6). När det gäller zebrafisken är njuren nischen av HSCs som ger upphov till olika blodcellstyper. Ändå cirkulerar många granulocyter och makrofager normalt i blodet. I vårt exempel använde vi mpo: GFP transgen linje som uttrycker GFP under promotorn av myeloperoxidas av neutrofiler52. Originalstudier av mpo:GFP transgen linje visade uttryck för myeloperoxidase i olika tillstånd av neutrofil mognad76 men vår gate strategi fokuserade på granulocyt fraktionen som består av mogna celler som kommer från blodet52, på så sätt vår analys inkluderar infiltrerade celler och inte bosatta celler. Detta är viktigt att tänka på när man isolerar önskad cellpopulation.
Som förklarats ovan är apoptos den mest klassiska markören för cisplatin-relaterade AKI. Här demonstrerade vi ett enkelt protokoll för lokalisering av döda celler genom TUNEL-analysen. Cisplatininjektion ökade antalet apoptotiska celler 24 hpi (figur 7). Detta kan lätt kvantifieras genom att direkt räkna de döda cellerna från vävnaden. För identifiering av cellspecifik död kan dock användning av antikroppar mot önskad cell(t.ex. rörceller) eller användning av en transgen reporterlinje användas tillsammans med denna teknik. Jämfört med den gentamicin-inducerade modellen av AKI, cisplatin verkar vara en allvarligare modell, eftersom gentamicin apoptos var högre den tredje dagen efter injektion65.
Trots att ha en mängd olika biverkningar, cisplatin används fortfarande i stor utsträckning i cancer terapi, på grund av dess effektivitet mot olika typer av cancer, inklusive carcinom, könsceller tumörer, lymfom, och sarkom77. Nefrotoxicitet förekommer hos en tredjedel av patienterna i behandling med cisplatin10, vilket innebär att sökandet efter strategier som kan minska denna effekt och öka avrotningen är absolut nödvändigt. Vi tror att de metoder och tekniker som presenteras i detta manuskript kommer att bidra till att belysa mekanismer för njurskada och hitta terapeutiska mål som kan vara avgörande för att förbättra livskvaliteten för individer som lider av njurkomplikationer, främst de som är relaterade till användningen av cisplatin.

Njurarna är ansvariga för flera viktiga fysiologiska funktioner som upprätthåller homeostas, såsom blodfiltrering, avlägsnande av överskott av rester och reglering av jonkoncentrationer1. Skador på njurvävnad kan leda till ett heterogent tillstånd som kallas akut njurskada (AKI), som kliniskt beskrivs som en snabb minskning av njurfunktionen orsakad av förstörelse och död av rörformiga epitelceller, endotelcellsskada och leukocytinfiltration 2,3. AKI är ett tillstånd som beräknas inträffa i 8-16% av sjukhusinläggningarna4, med en hög dödlighet som sträcker sig från 20 till 50% på intensivvårdsavdelningen (IVA)5. Denna sjukdom är förknippad med ökad sjukhusvistelse och betydande användning av ekonomiska resurser5. Åldersfaktorer inkluderar uttorkning, chock, infektioner, sepsis, hjärt-kärlsjukdom och nefrotoxiska läkemedel6. Nefrotoxicitet definieras som en njurskada som induceras av droger, vilket orsakar effekter som AKI, tubulopathies och glomerulopathies7. Nefrotoxicitet drabbar två tredjedelar av IVA-patienterna, eftersom cirka 20% av de läkemedel som föreskrivs på IVA anses nefrotoxiska8,9, detta inkluderar icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel (NSAID), antibiotika som vankomycin och aminoglykosider och kemoterapeutiska medel som metotrexat och cisplatin7. Cisplatin är en av de mest potenta och vanliga kemoterapiläkemedel, som används vid behandling av solida tumörer, såsom huvud och hals, testikel, äggstock och urinblåsa10. I njuren internaliseras cisplatin i det proximala invecklade röret (PCT) genom den organiska katjontransportören 2 (OCT-2) och i höga koncentrationer binder till DNA som utlöser celldödsvägarna7,10,11,12. Ackumuleringen av detta läkemedel i njuren bidrar till nefrotoxicitet med död och inflammation13. Denna skadliga biverkning påverkar enormt livet och prognosen för en tredjedel av cancerpatienter som genomgår cisplatinbehandling, så är absolut nödvändigt forskningen om nya terapier som kan sänka nefrotoxiciteten utan att förlora dödande effekt på cancerceller10.
På grund av denna nefrotoxiska effekt används cisplatin ofta som induktor för AKI i experimentella djurmodeller, som beskrivs framåt. Hos gnagare rapporterades den första AKI-modellen inducerad av cisplatin 197114, men för närvarande har många olika protokoll dykt upp med hjälp av dosberoende och kumulativa effekter av cisplatin15. Därmed, beroende på doseringen och antalet applikationer, olika grader av svårighetsgraden av njurskada kan induceras16,17,18,19,20,21. Den vanligaste metoden består av en intraperitoneal (dvs. injektion av en dos cisplatin följt av dödshjälp under de följande dagarna. I detta klassiska protokoll inducerar en enda hög nefrotoxisk dos cisplatin (10-13 mg/kg hos möss och/eller 3-8 mg/kg hos råttor) allvarliga histologiska förändringar, såsom förlust av penselkant och cellskräp inuti den rörformiga lumen, några dagar efter cisplatininjektionen. Svårighetsgraden av histologiska förändringar är dosberoende, och tecken på regenerering observeras 7 dagar efter cisplatininjektion16,17.
Även om gnagaremodeller är väletablerade, bestämde vi oss för att dra nytta av egenskaperna hos ett annat ryggradsdjur och fokuserade våra studier på zebrafisken (Danio rerio). Denna fisk har använts i stor utsträckning för modellering av mänskliga sjukdomar, på grund av dess lilla storlek, yttre befruktning, höga reproduktionshastigheter, snabb utveckling, transparens av embryon och larver, låg underhållskostnad, liknande anatomi som däggdjur (med vissa undantag), hög vävnadsregenereringskapacitet, socialt beteende, 70% av genetisk likhet med människor och 84% med mänskliga sjukdomar associerade gener22. Streisinger et al.23,24,25 startade studierna med zebrafisk som bekräftade genomförbarheten av att använda denna modellorganism för genetisk analys av ryggradsdjursutveckling. Inom njurforskningen har zebrafisken dykt upp inte bara i utvecklingsstudier utan också som ett genetiskt verktyg i sökandet efter nya gener kopplade till njurförhållanden26. Dessutom gör regenereringens kapacitet utan ärrbildning och förmågan att generera nephrons genom sitt liv, kallad neoneropogenes, zebrafisken till en viktig djurmodell för regenereringsforskning27,28. Dessutom visar tillgången till experimentella modeller för olika njursjukdomar, inklusive akut och kronisk njurskada, mångsidigheten hos denna experimentella organism26,29. Liksom hos däggdjur härleds zebrafiskens njure avkommare från mellanmsodermen. Sådana njure stamceller genererar pronephros som senare kommer att utvecklas till mesonephros, som kommer att upprätthållas som ett moget organ fram till vuxen ålder29,30.
Den vuxna zebrafisk njuren ligger på kroppens ryggvägg, mellan simblåsan och ryggraden29. Ur ventral vy kan zebrafisken segmenteras i tre regioner (Figur 1A): huvud (H), stam (Tr) och svans (Ta)29. Samma som däggdjur har zebrafisken nephrons som funktionella enheter av njuren, som är indelade i tubulesegment (Figur 1A): njurkorpuskel (RC), proximal invecklad tubule (PCT), proximal rak tubule (PST), distala tidigt (DE), sen distala (DL) och samlande kanal (CD)29. Zebrafisk delar genetisk bevarande och strukturella likheter med mänskliga nephrons(figur 1B) men saknar vissa konformationer som mellantunnan, även känd som slingan av Henle (LH)29,31. Sötvattenfiskar som zebrafisk är normalt omgivna av ett medium med mycket låg osmolaritet, på grund av detta tenderar de att vara hyperosmotiska och beror på gälarna, huden i tidiga skeden och njuren för att reglera osmolaritet och vattenutsöndring32. Filtreringen av blod från dorsala aorta av pronephros börjar cirka 48 h efter befruktning (hpf)33,34. Zebrafiskens njure är inte bara ett utsöndringsorgan för metaboliskt avfall utan fungerar också som ett hematopoetiskt organ från 4 dagar efter befruktning (dpf) till vuxen ålder och det motsvarar benmärgen hos däggdjur35. Under utvecklingen kommer hematopoetiska stamceller (HSCs) att så njure, självrenovera och generera myeloiska, erytopoid- och lymfoida cellstammar, upprätthålla transkriptionsfaktorer, signalera molekyler och mycket bevarade genetiska program med däggdjur36,37. Studier har visat att de flesta erytrooida, trombocytiska, myeloiska och lymfoida celler i det mänskliga immunsystemet finns i zebrafisk37,38. De unika egenskaperna hos detta djur och de bevarade funktionerna med den mänskliga njuren gjorde denna modellorganism fördelaktig i forskningen om njurfunktion, skada och regenerering.
Även om zebrafiskens njure är väl studerade och vissa modeller av AKI redan finns tillgängliga i larva och vuxna zebrafisk28, vid tidpunkten för upprättandet av detta protokoll fanns det inga bevis för en kemiskt inducerad icke-antibiotisk AKI-modell hos vuxna zebrafiskar. Utöver detta fokuserar vårt laboratorium på att testa probiotiska bakterier och mikrobiota-härledda föreningar för att studera regenerering och njurskador, vilket innebär att vi koncentrerade våra ansträngningar för att skapa en ny cisplatininducerad AKI-modell hos vuxna fiskar. Videoartikeln som presenteras i detta manuskript visar förfarandena för en ny modell av AKI-induktion med en i.p. injektion av 120 ug cisplatin per g djur (120 μg/g) (Figur 2A). Denna dos baserades ursprungligen på studier av AKI inducerad av cisplatin i murinmodeller som gick runt 10 mg/kg (motsvarande 10 μg/g)14,15,16,17, men denna dos var inte tillräcklig för att inducera njurskador relaterade till nefrotoxicitet (data som inte visas). Således ökade vi dosen till de som används i denna studie (Figur 2B). Vårt arbete visade en dosberoende effekt av cisplatin i överlevnad efter injektion med induktion av njurvävnad skada 24 hpi som visas av förlust av tubular struktur, ökad inflammatorisk infiltrate och hög grad av celldöd. Här beskriver vi två tekniker för att analysera utvecklingen av cisplatin-inducerad AKI: flöde cytometri, att analysera cell infiltration, och TUNEL, att mäta celldöd. Flödescytometri är en teknik som mäter cellernas fysiska (storlek och granularitet) och kemiska (fluorescerande föreningar). Inuti cytometern löper cellupphängningen genom en mantelvätska som organiserar cellerna i en enda linje, så att de kan passera genom en laserstråle en cell i taget (figur 3A). En detektor framför ljusstrålen mäter FSC (Forward Scatter), som korrelerar med cellstorlek, och detektorer åt sidan mäter sidospridningen (SSC) som korrelerar med cellernas granularitet. Andra detektorer mäter fluorescensen från partiklar, fluorescerande proteiner eller antikroppsmärkta celler39,40. Eftersom kommersiella antikroppar för zebrafisk är knappa nuförtiden, tillåter användningen av djurreportrar och fluorescerande biomarkörer att förbättra denna analys och identifiera olikacellpopulationer 41,42,43. Ett annat verktyg som användes i detta protokoll var Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP Nick End Labeling (TUNEL) analys. TUNEL-analysen är en metod för att upptäcka apoptos i sent skede som förlitar sig på TdT:s förmåga att identifiera fragmenterat DNA och märka det med deoxynukleotider märkta med en fluorescerande markör som senare kan visualiseras och kvantifieras medmikroskopi 44 (figur 3B). Med tanke på att en av de mest slående egenskaperna hos AKI är induktion av apoptos i rörformiganjurceller 3, är denna teknik extremt fördelaktig eftersom den kan analyseras av flödescytometri och / eller mikroskopi.
De metoder som presenteras i denna artikel gör det möjligt att observation av AKI-status och erbjuda en ny akut modell för att studera AKI-störningar som kan vara användbara för forskning av nya terapeutiska mål i cisplatin-relaterade AKI.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1x PBS</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 10 X PBS (prepared in lab) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>31 G 1.0 cc insulin syringe</td>
			<td>BD Plastipak</td>
			<td>990256</td>
			<td>Needle: BD Precision Glide 300110</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3.5 L Fish tank</td>
			<td>Tecniplast</td>
			<td></td>
			<td>Part of the aquactic system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6 well plate</td>
			<td>Corning</td>
			<td>351146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mM Tris/HCl</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prepared from solid Tris Base (Promega, H5135), adjusted to pH 7.4-8 with HCl (Merck, 1003171000)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50 ml Falcon tube</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2-3% Agarose</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>16500-500</td>
			<td>Dissolve 2 or 3% agarose (w/v) in 1x PBS, warm until dissolve.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2% FBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12657-09</td>
			<td>Dilute 2% (w/v) directly in 1x PBS</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4% Paraformaldehyde</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>Dissolve 4% PFA (w/v) in warm 1x PBS, mix until dissolve in a hot plate in a fume hood. Aliquot and store at -20 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>50% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90% Ethanol</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Made by diluting 100% ethanol in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Ethanol</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00A1115.01.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100% Xylene</td>
			<td>Synth</td>
			<td>00X1001.11.BJ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell strainer 40 &#181;m</td>
			<td>Corning</td>
			<td>431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cisplatin</td>
			<td>Blau Farmac&#234;utica</td>
			<td>16020227</td>
			<td>C-PLATIN 1 mg/mL. Store at room temperature.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cork board sheet</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local stationary store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td>Stock solution 20 mg/ml dissolved in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine forceps</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11254-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometry tubes</td>
			<td>Corning</td>
			<td>352052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass slide</td>
			<td>Thermo-Fisher</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histology cassette</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>2921</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immuno stain chamber</td>
			<td>Ciencor</td>
			<td>EP-51-05022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>NAPCO</td>
			<td>5400</td>
			<td>Set to 37 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Papillon</td>
			<td></td>
			<td>Model micro15x20</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>In Situ Cell Death Detection Kit</td>
			<td>Roche Diagnostics</td>
			<td>12156792910</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Metal mold</td>
			<td>Leica Biosystems</td>
			<td>3803081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette 200-1000 &#181;L</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td></td>
			<td>Use 1 mL tips</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222 (Tricaine)</td>
			<td>Fluka Analytical</td>
			<td>A5040-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl 0.9%</td>
			<td>Synth</td>
			<td>C1060.01.AG</td>
			<td>Dissolve 0.9% NaCl (w/v) in distilled water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nail polish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Prefer transparent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Neubauer chamber</td>
			<td>Precicolor HGB</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pasteur plastic pipet</td>
			<td>United Scientific Supplies</td>
			<td>P31201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraplast</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3558</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petri dish</td>
			<td>J.ProLab</td>
			<td>0307-1/6</td>
			<td>60 and 100 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic spoon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proteinase K</td>
			<td>New England BioLabs</td>
			<td>P8102</td>
			<td>Diluite from stock 20 mg/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>14060-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel blade</td>
			<td>Solidor</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sponge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obtained from local store</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan Blue</td>
			<td>Cromoline</td>
			<td>10621/07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vannas Spring Scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vectashield Antifade Mounting Medium</td>
			<td>Vector Laboratories</td>
			<td>H-1000-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifuge</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5810R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytometer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>FACSCanto II</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Stereoscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>Axio Zoom.V16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescence Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>AxioVert.A1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>Jung Supercut</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Ohaus Corporation</td>
			<td>AR2140</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

acute kidney injury model induced by cisplatin in adult zebrafish

Cisplatin används ofta som kemoterapi. Även om det har positiva effekter hos cancerbehandlade individer, kan cisplatin lätt ackumuleras i njuren på grund av dess låga molekylvikt. Sådan ackumulering orsakar tubulära cellers död och kan inducera utvecklingen av akut njurskada (AKI), som kännetecknas av en snabb minskning av njurfunktion, vävnadsskada och immuncellsinfiltration. Om cisplatin administreras i specifika doser kan det vara ett användbart verktyg som AKI-inducerare i djurmodeller. Zebrafisken har dykt upp som en intressant modell för att studera njurfunktion, njurregenerering och skada, eftersom njurstrukturer bevarar funktionella likheter med däggdjur. Vuxna zebrafisk injiceras med cisplatin visar minskad överlevnad, njurcellsdöd och ökade inflammationsmarkörer efter 24 h efter injektion (hpi). I denna modell kan immunceller infiltration och celldöd bedömas genom flödescytometri och TUNEL-analys. Detta protokoll beskriver förfarandena för att inducera AKI i vuxna zebrafisk genom intraperitoneal cisplatin injektion och därefter visar hur man samlar njurvävnad för flöde cytometry bearbetning och celldöd TUNEL analys. Dessa tekniker kommer att vara användbara för att förstå effekterna av cisplatin som ett nefrotoxiskt medel och kommer att bidra till expansionen av AKI-modeller hos vuxna zebrafiskar. Denna modell kan också användas för att studera njurregenerering, i sökandet efter föreningar som behandlar eller förebygger njurskador och för att studera inflammation i AKI. Dessutom kommer de metoder som används i detta protokoll att förbättra karakteriseringen av vävnadsskador och inflammation, som är terapeutiska mål i njurrelaterade komorbiditeter.

Zebrafiskens njure är ett platt pigmenterat organ som ligger på dorsalväggen och dess grundläggande funktionella enhet, nephron, bevaras med däggdjur (Figur 1). Det speciella med att bara ha en njure med hög regenereringsförmåga gör denna modellorganism till ett utmärkt val för modell njurskada. De protokoll som presenteras i detta arbete är utformade för att inducera AKI genom intraperitoneal (dvs. injektion av cisplatin hos vuxna zebrafiskar (figur 2) och ska senare analyseras med två tekniker som beskrivs före: flödescytometri (figur 3A) och TUNEL (Figur 3B). Ett flödesschema över hela processen visas i figur 4. Doserna av cisplatin applicerades ursprungligen på de som beskrivs imusmodellerna 15,16,17, där den standard som används är 10-13 mg cisplatin per kg djur (mg/kg). Zebrafisken visade sig dock vara mer resistent mot cisplatin än musen (data som inte visades), och den slutliga dosen ökades. När vi utvärderade djurens överlevnadsgrad visade experimenten en dosberoende effekt av cisplatin (figur 5A). På grund av detta rekommenderar vi att du följer instruktionerna exakt som förklaras i detta protokoll och övervakar djurens överlevnadsgrad ständigt som ett mått på reproducerbarhet, innan du samlar in något material. Efter injektionen på 120 μg/g cisplatin (figur 5A, röd linje), observerades en minskning av överlevnaden på cirka 30% av djuren under de första 24 h och överlevnaden minskade gradvis tills den nådde cirka 20% av levande djur dag 5 efter injektionen, stabiliserades sedan ( figur5A). Cisplatintoxicitet påverkades inte av djurens kön, eftersom män och kvinnor har liknande överlevnadskurvor (figur 5B).
Analys av kinetiken av cisplatin-inducerad AKI visade ökad inflammation och celldöd i njuren 24 hpi. Ett av de snabbaste och kvantitativa sätten att utvärdera inflammation är flödescytometri, men med tanke på bristen på antikroppar mot zebrafiskantigener som finns tillgängliga kommersiellt för denna teknik, är det nödvändigt att använda en transgen linje med en immunmarkör. Numera är många zebrafisklinjer som märker immunceller tillgängliga (tabell 1). Dessa linjer kan användas på ett enkelt sätt eller i kombination, med tillräckligt med repertoar föranalys 48,49,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60. Detta förenklar enormt tekniken eftersom det inte är nödvändigt något antikroppsinkubationssteg, tvärtom, efter isoleringen av cellerna genom mekanisk separation är direktavläsningen på cytometern möjlig.
Som nämnts tidigare är zebrafiskens njure inte bara ett blodfiltreringsorgan med homeostatiska funktioner utan också den anatomiska platsen för hematopoies hos vuxna, motsvarande benmärgen hos däggdjur33,34,35. På så sätt när vi analyserar det genom flödescytometri är möjligt att differentiera cellpopulationer som är jämförbara med det mänskligablodet 61,62 (Figur 6A), gör detta att vi kan identifiera cellpopulationerna initialt efter storlek och granularitet och utesluta skräp. I det här fallet använde vi en transgen linje som heter Tg(mpo:GFP)52 som uttrycker ett grönt fluorescerande protein (GFP) tillsammans med enzymet myeloperoxidas, som finns i neutrofiler. Med vetskap om detta baserades vår gatestrategi på den första separationen av granulocytens befolkning (figur 6B). Efter detta uteslöts doubletceller, eftersom de avsevärt kan ändra analysen och leda till felaktiga slutsatser. En dubblett är en enda händelse som består av 2 oberoende partiklar och kan uteslutas genom att välja en framåtriktad spridningshöjd (FSC-H) jämfört med ett FSC-A-densitetsdiagram(figur 6C). Efter detta steg identifierades och valdes de celler som uttryckte fluorescerande markören (figur 6D). Slutligen extraherades befolkningsstatistiken från analysen och ritades som procentandel celler (figur 6E).
En av de mest framträdande egenskaperna hos cisplatin nefrotoxicitet är tubulär celldöd10, och för att enkelt visualisera detta använde vi TUNEL-analysen för apoptosdetektering. Denna metod rekommenderar att man använder celler och vävnader av vildtyp som saknar fluorescerande markörer, eftersom parallell fluorescens skulle störa analysen, när det gäller zebrafisken rekommenderas att använda vilda linjer, såsom AB, Tübingen, TAB eller en transgen linje med ett fluorescerande protein som inte stör TUNEL fluorescensfärgen. TUNEL-tekniken möjliggör analys via flödescytometri eller mikroskopi. Mikroskopi har fördelen att bevara vävnadsstrukturen, så att man kan se vilka celler som dör. Under det fluorescerande mikroskopet kan de ljusa kärnorna i apoptotiska celler lätt särskiljas från bakgrunden. Djur som injiceras med cisplatin (figur 7B) har fler döda celler än kontrollen (figur 7A) vid 24 hpi. Den slutliga kvantifieringen gjordes med cellräknarens alternativ för FIJI Software och visade statistiskt sett fler döda celler i cisplatinbehandlade njurar än i kontrollerna (Figur 7C)
Protokollet som beskrivs i detta manuskript visade hur man använder cisplatin som inducerare av AKI hos vuxna zebrafisk, som är dossvar, snabb och pålitlig. Baserat på de data som erhållits från överlevnadshastigheter och mätning av tecken på nefrotoxicitet hos cisplatin inklusive inflammation (detekteras av flödescytometri) och celldöd (detekteras genom TUNEL-analys), föreslår vi denna modell för studier av cisplatin nefrotoxicitet samt för framtida behandlingar vid AKI-relaterade sjukdomar.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig01.jpg"> Figur 1: Struktur och jämförelse av zebrafisk och mänskliga njurar. A. (1) Sidovy av en vuxen zebrafisk med njuren representerad i mörkbrunt beläget i fiskens ryggvägg, mellan simblåsan (sb) och ryggraden. (2) Ventral syn på njuren som visar nefroner (gula) som är anslutna till uppsamlingskanalen (blå). De olika regionerna av njuren flaggas: huvud (H), bål (Tr) och svans (Ta). (3) Schematiska som representerar zebrafisksnefhrons och deras segment märkta och färgade för att matcha genetiska bevarade regioner med mänsklig nefroron. B. (1) Sagittal syn på en mänsklig njure. (2) Schematisk föreställande en mänsklig nephron med segment märkta och färgade. RC: njurkorpuskel; PCT: proximal invecklad tubule; PST: proximal rak tubule; TL: tunn lem; LH: Slinga av Henle; TAL: tjock stigande lem; DE: distala tidigt; DL: distala sent; DCT: distala invecklade tubule; CD: samla in kanal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig02.jpg"> Figur 2: Experimentell design för cisplatininducerad AKI. A. Lateral och ventral vy av vuxna zebrafisk som pekar nålens position under injektionsproceduren. Nålen tränger in i 20-30° vinkel från magen och sätts in långsamt parallellt med ventralväggen och undviker att punktera inälvorna. B. Jag är inte så bra på Experimentell design av cisplatininducerad AKI: (1) Injektion av cisplatin 120 μg/g per djur vid dag noll. (2) Innan steg 3 försöker, rekommenderas överlevnadsövervakning av fiskar efter injektion från dag ett till dag tio. (3) Njure dissekeringar en dag efter cisplatin injektion för vidare bearbetning tekniker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig03.jpg"> Figur 3: Mekanismer för flödescytometri och TUNEL-tekniker. A. Översikt över flödescytometern: en suspension av celler är hydrodynamiskt fokuserad på en enda linje av en mantelvätska, vilket gör att celler passerar en efter en framför en laserstråle. Detektorer fram och på sidan mäter cellernas främre scatter (FSC), sidospridning (SSC) och fluorescens. B. Jag är inte så bra på Principen för TUNEL-analys. Terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) förmedlar tillsats av en fluorescerande märkt dUTP till 3'-OH ändar av ett fragmenterat DNA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig04.jpg"> Figur 4:Flödesschema över representerade tekniker. A. Ett flödesschema som visar stegen att följa när du väljer att analysera njurvävnaden genom flödescytometri (orange) eller TUNEL (blå), när du inducerar AKI genom cisplatininjektion (grå). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig05.jpg"> Figur 5:Överlevnadsövervakning av cisplatininsprutad fisk. A. Överlevnadsgrad för olika doser av cisplatininjektioner (25 - 50 - 112,5 - 120 μg/g). Log-rank (Mantel-Cox) test, ** p < 0,01. B. Jag är inte så bra på Överlevnadsgrad för män jämfört med kvinnor injicerade med 120 μg/g cisplatin. Log-rank (Mantel-Cox) test, *** p < 0,001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig05large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig06.jpg"> Figur 6: Gatestrategi för transgen zebrafisklinje. A. Densitetsdiagram av zebrafisk vuxna njurceller, populationer separeras efter storlek (FSC-A) och granularitet (SSC-A). Olika populationer väljs av färgade ovaler/cirklar. Rosa: Erytroider; Svart: Lymfoid; Gul: Prekursorer; Röd: Granulocyter. B. Jag är inte så bra på Densitetsdiagram av sida spridningsområde (SSC-A) och framåt spridningsområde (FSC-A) för urval av Granulocytes population i njuren. C. Densitetsdiagram av framåt spridning hög (FSC-H) och framåt spridningsområde (FSC-A) för val av singlets population inuti granulocyt gate. D. Jag är inte så bra på Densitetsdiagram för främre spridningsområde (FSC-A) och FITC-A:MPO för val av mpo:GFP-positiva celler (neutrofiler) i njuren. En positiv population anses cirka 103 på, av fluorescens intensitet. E. Diagram över procentandelen mpo:GFP-positiva celler (neutrofiler) hos kontroll jämfört med Cisplatindjur, 24 hpi . Oparat t-test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig06large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61575/61575fig07.jpg"> Figur 7:TUNEL-analys av cisplatininsprutad fisk. A. Mikrofoton av fast vuxen njure 24 h efter 120 μg/g cisplatin injektion. Kontrollerna injiceras med 0,9 % NaCl. TUNEL-positiva celler (apoptotiska celler) är färgade i rött (vita pilar). DAPI (blå) används som en kärnräknare. Skalstång: 50 μm. 20x förstoring. B. Jag är inte så bra på Diagram som visar kvantifiering av antalet döda celler i njuren med 20x fält. Oparat t-test,* p < 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61575/61575fig07large.jpg" target="_blank">Klicka här om du vill visa en större version av den här figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Transgen linje</td>
			<td>Celltyp märkt</td>
			<td>referenser</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(spi1:EGFP)pA301</td>
			<td>Myeloiska celler</td>
			<td>Avdelning et al. 200348
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(zpu1:GFP)</td>
			<td>Myeloiska celler</td>
			<td>Hsu et al. 200449
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mhc2dab:GFP)sd6</td>
			<td>Monocyter</td>
			<td>Wittamer o.a. 201150</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lysC:DSRED2)</td>
			<td>Neutrofiler</td>
			<td>Hall et al. 200751
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpo:GFP)</td>
			<td>Neutrofiler</td>
			<td>Mathias o.a. 200652
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:mCherry)</td>
			<td>Makrofager</td>
			<td>Ellett et al. 201153
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(mpeg1:Dendra2)</td>
			<td>Makrofager</td>
			<td>Harvie et al. 201354
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(lck:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Langenau o.a. 200455
</td>
		</tr>
<tr>
<td>TgBAC(ikaros:EGFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Bajoghli o.a. 200956
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag1:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Jessen o.a. 199957
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(rag2:GFP)</td>
			<td>T-celler</td>
			<td>Jessen o.a. 200158
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg (CD79:GFP)</td>
			<td>B-celler</td>
			<td>Liu et al. 201759
</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tg(CD45:DsRed)</td>
			<td>Leukocyter</td>
			<td>Bertrand o.a. 200860
</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Zebrafisk transgena linjer för immunceller. Tabell som återupptar namnen på zebrafiskreporterlinjer med respektive typ av immuncell märkt och referensartiklarna där de konstruerades. En kombination av dessa zebrafisklinjer kan erbjuda nya möjligheter till cellval genom flödescytometri.

Watch this Scientific Journal Video about Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish at JoVE.com

Acute Kidney Injury Model Induced by Cisplatin in Adult Zebrafish

Detta protokoll beskriver förfarandena för att inducera akut njurskada (AKI) hos vuxna zebrafiskar med cisplatin som ett nefrotoxiskt medel. Vi detaljerade stegen för att utvärdera reproducerbarheten av tekniken och två tekniker för att analysera inflammation och celldöd i njurvävnad, flöde cytometri respektive TUNEL, respektive.

Modell för akut njurskada inducerad av Cisplatin hos vuxna zebrafiskar

Cisplatin is commonly used as chemotherapy. Although it has positive effects in cancer-treated individuals, cisplatin can easily accumulate in the kidney ...

Det övergripande målet för detta förfarande förklaras användningen av cisplatin som ett nefrotoxiskt medel hos vuxna zebrafiskar, analysera inflammation och celldöd i njurvävnad. För att uppnå detta och vuxna zebrafiskar bedövas och vägs för att injicera i en specifik dos cisplatin i peritoneal håligheten. Efter monitordödlighet dissekeras njuren och cellerna isoleras för flödescytometri eller fixeras och dissekeras för att analyseras med fluorescerande TUNEL-analys.Följande procedurer kan hjälpa till att svara på viktiga frågor inom njurområdet med hjälp av de nefrotoxiska effekterna av cisplatin som ett verktyg för att utveckla en akut njurskada modell och vuxna zebra fisk. Denna modell kan användas för utforskning av nya terapeutiska mål i njurskydd, samt klargöra regenereringsmekanismen i zebrafiskens njure. Cisplatin är ett kemoterapimedel som används för att behandla en mängd olika cancerformer.Kan dock lätt ackumuleras i njuren, generera celldöd, inflammation och minska njurfunktionen. Effekten av cisplatin är dosberoende, så du kan sänka vår ökning av dosering beror på dina mål. De tekniker som används här för att analysera inflammation och celldöd är inte uteslutande för spridning av sjukdomsmodellen.Flödescytometri hos zebrafisk kan hjälpa till att belysa djurets inflammatoriska tillstånd på ett kvantitativt sätt, medan vi vid TUNEL säger kan klargöra närvaron av poptosed celler i de fysiologiska och patologiska sammanhangen. Innan du påbörjar experimentet bered du cisplatinarbetslösningen genom att späda ut stamlösningen till 820 mikrogram per mil i 0,9% natriumklorid. Därefter bedöva en annan zebrafisk och torka av överskottet av vatten på några pappershanddukar.Väg fisken genom att placera dem på en skala, notera vikten. Gör beräkningarna för att veta den exakta volymen att injicera. För att uppnå dosen på 120 mikrogram per gram vikt, använd nästa formel.Dividera den slutliga dosen med arbetslösningens dos och konvertera detta tal till mikroliter, genom att multiplicera i 1000 för att få volymen 120 mikrogram cisplatin. Multiplicera sedan detta tal med fiskens vikt för att få den slutliga volymen att injiceras. Placera en fisk på en våt svamp, med en liten kopp för att hålla den.Med ventralsidan upp och fyll en insulinspruta med en beräknad volym cisplatin. Sätt in nålen på den ventrala mittlinjen i en grund vinkel och dra försiktigt upp ventralväggen för att undvika att punktera inre organ. Och injicera sedan lösningen.Efter injektionen, placera en fisk i en tank för att återhämta sig från anestesi och vänta på tecken på återhämtning som simning och lämpliga rörelser. Övervaka för dessa fiskar två gånger om dagen under de kommande dagarna. Vid denna dos inducerar cisplatin cirka 30% av dödligheten under de första 24 timmarna.Avliva fisken och torka av överskottet av vatten i en pappershandduk. När du har tagit bort huvudet och inre organ, använd dissekeringsnålar för att fästa kroppsväggarna. Placera njuren i fiskens dorsala vägg och använd tång för att lossa njuren.Placera njuren i en sex brunnsplatta med en sval lösning på en 1X PBS, 2%FBS och håll på is. Därefter plocka upp vävnaden med lite vätska och passera den genom en 40 mikron cell sil och försiktigt macerate vävnaden med en spruta kolven. Tvätta två gånger med en 1X PBS, 2%FBS.Och samla cellerna i ett 50 mils falkrör. Centrifug i fem minuter vid 400 G.Försiktigt hämtning av supernaten med en pipett och kassera den. Tillsätt 500 mikroliter kall 1X PBS för att åter suspendera cellerna och placera dem i ett fem mil flöde cytometrirör.Håll dem på is. Ta 10 mikroliter av provet och blanda det med 90 mikroliter trypanblått i ett Eppendorfrör. Tillsätt 10 mikroliter av blandningen till en Neobauer-kammare och räkna celler i mikroskopet.Ta cellerna för att läsas av en cytometer och analysera sedan resultaten som väljer befolkningen i dina intressen. För detta förfarande avliva en fisk och ta bort inre organ som lämnar njuren fäst vid kroppen. Fäst sedan kroppsväggarna på en korkyta och placera den fasa ner över fixeringslösningen.Håll det fyra grader över natten. Nästa dag dissekerar du njuren med fin kraft. Försök att inte störa den.Placera den i en liten petriskål eller Eppendorfrör med 1X PBS att skölja. Ändra PBS och förbered 2%agarose för att generera en stödmatris för njuren innan de bearbetas ordentligt. Kassera all återstående PBS och häll agarosen långsamt.Placera sedan njuren med fina tångar för att förhindra att den viks. Låt agarose stelna vid rumstemperatur. Efter agarose stelning, använd en skalpell för att skära Agarose runt njurarna bildar en liten kub.Placera agarosakuberna i en histologisk kassett och skicka den för histologisk bearbetning för att bädda in vävnaden i paraffin. Paraffinblocken, vi kommer sedan att skära i fem mikrontjocklekssektioner. Avvaxa rutschkanor och förvara dem i destillerat vatten.Förbered en mörk inkubatorkammare och sätt våta pappershanddukar längst ner. Placera diabilderna i den mörka kammaren och tillsätt Proteinase K för permeabilisering av vävnaden. Inkubera i 30 minuter vid 37 grader.Medan proverna inkuberas, förbered TUNEL-reaktionsblandningen genom att tillsätta 50 mikroliter enzymlösning på 450 mikroliter etikettlösning. Och håll dig skyddad mot ljus. Plocka upp den mörka kammaren och tvätta skivan två gånger med en 1X PBS.Torka sedan diabilderna och på TUNEL-reaktionsblandningen. Och inkubera vid 37 Celsius grad i två timmar. Efter inkubation, tvätta denna bild igen med en 1X PBS.Och lägg till DAPI för nuklei counter färgning. Inkubera i rumstemperatur i fem minuter, skyddad från ljus. Skölj tre gånger med en 1X PBS.Och forma sedan bilderna med ett anti-blekt hydrofilt medium. Sätt en täcksnederett. Och försegla med nagellack.Visualisera proverna i ett fluorescerande mikroskop. I detta diagram är det möjligt att se att cisplatin har en dosresponseffekt på fiskens överlevnad, jämfört med en kontroll som injiceras endast med 0,9% natriumklorid. Den röda linjen i detta diagram representerar en dos på 120 mikrogram per gram som används i denna video.Denna dos kan appliceras på män och kvinnor, eftersom ingen statistisk skillnad hittades mellan dem. Flödescytometri gör det möjligt att kvantifiera olika celler som finns i en vävnad. Hematopoetiska celler populationer identifieras i flera fiskars njure efter storlek eller framåt spridning och granularitet eller storlek spridning.På så sätt är det möjligt att separera populationerna i erytrocyter, lymfocyter, granulocyter och hematopoetiska prekursorer. Här tillåter den nuvarande gatestrategin som väljer granulocyter, singlets och MPO-positiva celler att hitta populationen av neutrofiler i njuren som kännetecknas av fluorescensuttrycket av myeloperoxidas. I detta fall inducerade injektionen av cisplatin ökningen av andelen neutrofiler som finns i njuren.TUNEL-analysen tillåter att man upptäcker apoptotiska celler i en vävnad genom att observera vävnadsrutschbana av njuren med ett fluorescensmikroskop, det är möjligt att se apoptotisk signal inuti kärnan i vissa celler, här i rött. Kontrasterad av en kärnvapenfläck i en sådan DAPI här i blått. Cisplatin injektion ökade förekomsten av apoptotiska celler i njuren, som är möjliga att kvantifiera manuellt eller med hjälp av en bild programvara.I slutet av denna video bör du kunna veta hur man injicerar och justerar dosen av cisplatin för att inducera akut njurskada hos vuxna zebrafiskar. Och hur man dissekerar njuren för olika ändamål. Flödescytometri är ett utmärkt verktyg som hjälper dig att förstå profilen för olika celltyper beroende på tillgången på tragenklavlinjer i ditt labb.Kom ihåg att tänka på färgen på transportörlinjerna om du vill använda antikroppar för att märka alla deras celltyper. TUNEL-analysen är ett enkelt verktyg som gör att vi kan upptäcka apoptotisk cell och vävnad, och kan analyseras inte bara genom mikroskopi utan också genom flödescytometri. Kom ihåg att alltid använda personlig skyddsutrustning under hela proceduren.

Research

JoVE Journal

Medicine

Pressure Controlled Ventilation to Induce Acute Lung Injury in Mice

Tryckstyrd ventilation för att framkalla akut lungskada hos möss

Murine models are extensively used to investigate acute injuries of different organs systems (1-34). Acute lung injury (ALI), which occurs with prolonged ...

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

An in vivo Rodent Model of Contraction-induced Injury and Non-invasive Monitoring of Recovery

En In vivo Gnagarmodell av kontraktion inducerad-skada och icke-invasiv övervakning av Recovery

Muscle strains are one of the most  common complaints treated by physicians. A muscle injury is typically diagnosed from the patient history and  physical ...

The Spared Nerve Injury (SNI) Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

The Spared Nerve Injury SNI Model of Induced Mechanical Allodynia in Mice

Den skonas Nerve Injury (SNI) Modell av inducerad mekanisk allodyni hos möss

Peripheral neuropathic pain is a severe chronic pain condition which may result from trauma to sensory nerves in the peripheral nervous system. The spared ...

Assessing Teratogenic Changes in a Zebrafish Model of Fetal Alcohol Exposure

Bedömning Teratogena Förändringar i ett Zebrafish modell av Fetal Alcohol Exponering

Fetal alcohol syndrome (FAS) is a severe manifestation of embryonic exposure to ethanol. It presents with characteristic defects to the face and organs, ...

Ischemia-reperfusion Model of Acute Kidney Injury and Post Injury Fibrosis in Mice

Ischemi-reperfusion modell av akut Kidneyskadan och efter skada Fibros i möss

Ischemia-reperfusion induced acute kidney injury (IR-AKI) is widely used as a model of AKI in mice, but results are often quite variable with high, often ...

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

A Possible Zebrafish Model of Polycystic Kidney Disease: Knockdown of wnt5a Causes Cysts in Zebrafish Kidneys

En möjlig Zebrafish Modell av polycystisk njursjukdom: Knockdown av<em&gt; Wnt5a</em&gt; Orsaker Cystor i Zebrafish Njurar

Polycystic kidney disease (PKD) is one of the most common causes of end-stage kidney disease, a devastating disease for which there is no cure. The ...

Photothrombosis-induced Focal Ischemia as a Model of Spinal Cord Injury in Mice

Photothrombosis-inducerad fokal ischemi som en modell av ryggmärgsskada hos möss

Spinal cord injury (SCI) is a devastating clinical condition causing permanent changes in sensorimotor and autonomic functions of the spinal cord (SC) ...

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome (ARDS)

Lavage-induced Surfactant Depletion in Pigs As a Model of the Acute Respiratory Distress Syndrome ARDS

Lavage-inducerad tensid Depletion i Pigs som en modell för den akut andnödssyndrom (ARDS)

Various animal models of lung injury exist to study the complex pathomechanisms of human acute respiratory distress syndrome (ARDS) and evaluate future ...

Open Tracheostomy Gastric Acid Aspiration Murine Model of Acute Lung Injury Results in Maximal Acute Nonlethal Lung Injury

Öppna Trakeostomituber Gastric Acid aspiration Murina Modell av akut lungskada Resultat i Maximal Akut nonlethal Lung Injury

Acid pneumonitis is a major cause of sterile acute lung injury (ALI) in humans. Acid pneumonitis spans the clinical spectrum from asymptomatic to acute ...