Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Wij erkennen de financiële steun voor het project van de Franse subsidie REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 en door onderzoekssubsidies van de Dienst de Santé des Armées en de Délégation Générale pour l'Armement. We zijn de ESRF dankbaar voor de SAXS beam tijd. Dit werk gebruikte de platforms van het Centrum Grenoble Instruct-ERIC (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) binnen het Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), ondersteund door FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) en GRAL, gefinancierd binnen de University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS erkent integratie in het Interdisciplinair Onderzoeksinstituut van Grenoble (IRIG, CEA). Wij danken Wim P. Burmeister en Frédéric Iseni voor financiële en wetenschappelijke steun en we danken dr. Jesse Hopkins van BioCAT bij de APS voor zijn hulp en voor de ontwikkeling van BioXTAS RAW.

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+SAXS+versatility:+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture,+functional+landscapes,+and+integrative+structural+biology.">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li><li>Gr&#228;wert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+(SAXS).">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li><li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li><li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline.">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li><li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis.">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li><li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberb&#252;hler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III:+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations.">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li><li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).</li><li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding.">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li><li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+(US-SOMO)+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite.">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li><li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering.">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li><li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioXTAS+RAW:+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis.">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li><li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks.">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li><li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers.">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

Het is gewenst om een monodisperse monster te hebben voordat u een SAXS-experiment start, maar in werkelijkheid voldoen veel gegevensverzamelingen hier niet aan en moeten ze worden verbeterd door de meting te combineren met inline chromatografie— SEC in de meeste gevallen. Zelfs het gebrek aan tijd tussen zuivering en gegevensverwerving is echter niet gegarandeerd. Meestal geldt dit voor experimenten waarbij componenten te dicht in grootte of in hun fysieke eigenschappen zijn om te worden gescheiden of gevoelig zijn voor snelle dynamiek. Hier hebben we een protocol dat single value-afbraak combineert met evoluerende factoranalyse om de invloed van DNAbound E9 exominus uit zijn ongebonden vorm te verwijderen, waardoor een monodisperse verstrooiingsprofiel ontstaat dat we vervolgens konden analyseren met het SAXS-pakket Scatter IV.
SVD met EFA van SEC-SAXS-gegevens zijn zeer krachtige methoden ontwikkeld om SAXS-gegevens te deconvolute en de analyse te verbeteren, maar ze hebben wel beperkingen. Ze vereisen dat ruis of drift in de bufferbasislijn van de SEC-SAXS tot een minimum wordt beperkt. Dit kan extra kolomevenwicht (beter om meer dan 3 kolomvolumes te gebruiken, afhankelijk van de buffer) voor het laden van monsters. De meest kritieke stap is echter de keuze van het aantal enkelvoudswaarden en het bereik van de gebruikte gegevens, omdat dit de nauwkeurigheid van de deconvolutie sterk zal beïnvloeden. Het is om deze reden dat de resultaten niet op zichzelf moeten worden genomen, maar verder moeten worden geanalyseerd met behulp van technieken zoals analytische ultracentrifugatie (AUC) of multi-angle-laser-light-scattering (MALLS) voor biologische interpretatie.
Scatter IV is een nieuw, softwarepakket, gratis voor onderzoek en industrieel gebruik met een intuïtieve gebruikersinterface waarmee zelfs niet-experts hun gegevens kunnen analyseren. Scatter IV heeft een aantal nieuwe functies die helpen om de analyse van SEC-SAXS-gegevens te verbeteren, zoals de heat map gekoppeld aan het signaal plot, waardoor een grotere nauwkeurigheid met de keuze van frame selectie. In primaire gegevensanalyse bieden de Guinier Peak-analyse en de cross-validatieplot die is gekoppeld aan de P(r)-analyse een geïntegreerde probleemoplossingsmoertie in de software.
Het moet worden vermeld dat veel andere programma's kunnen worden gebruikt voor primaire gegevensanalyse; deze bevatten dezelfde basisfuncties en worden ook regelmatig bijgewerkt, zoals BioXTAS RAW17 ATSAS-pakket24 en US-SOMO15 om er maar een paar te noemen.
Maar ongeacht welk SAXS-pakket wordt gebruikt voor analyse, de belangrijkste beperkingen zijn gebruikelijk: de monstervoorbereiding, vóór het verzamelen en analyseren. In het getoonde voorbeeld van E9 exominus is het duidelijk om de verbetering van de signaal-ruisverhouding te zien en met een vermindering van de Rg de dmax geassocieerd met een monodisperse monster. Dit zal sterk helpen bij de verdere verwerking van de gegevens, zoals montage of modellering met bekende structuren met hoge resolutie.

Biologische macromoleculen zijn te klein om gezien te worden, zelfs met de beste lichtmicroscopen. De huidige methoden om hun structuren te bepalen omvatten over het algemeen het kristalliseren van het eiwit of de metingen op enorme aantallen identieke moleculen tegelijkertijd. Hoewel kristallografie informatie geeft over het atomaire niveau, vertegenwoordigt het een kunstmatige monsteromgeving, aangezien de meeste macromoleculen niet in een kristallijne vorm in de cel worden gepresenteerd. Gedurende de laatste paar jaar cryo-elektronen microscopie geleverd soortgelijke hoge resolutie structuren van grote macromoleculen / macromoleculaire complexen, maar hoewel de monsters zijn dichter bij fysiologische toestand, ze zijn nog steeds bevroren, vandaar onbeweeglijk en statisch. Bio-kleine hoek Röntgenverstrooiing (BioSAXS) biedt een structurele meting van het macromolecuul, in omstandigheden die relevant zijn voor de biologie. Deze toestand kan worden gevisualiseerd als een lage resolutie 3D-vorm bepaald op nanometerschaal en vangt de volledige conformatieruimte van het macromolecuul in oplossing. BioSAXS-experimenten beoordelen efficiënt oligomeric staat, domein en complexeregelingen, evenalsflexibiliteit tussen domeinen 1,2,3. De methode is nauwkeurig, meestal niet-destructief en vereist meestal slechts een minimum aan monstervoorbereiding en tijd. Voor de beste interpretatie van de gegevens moeten de monsters echter monodisperse zijn. Dit is een uitdaging; biologische moleculen zijn vaak gevoelig voor verontreinigingen, slechte zuivering en aggregatie, bijvoorbeeld van vriesdooi4. De ontwikkeling van inline chromatografie gevolgd door onmiddellijke SAXS-meting helpt deze effecten te verzachten. De chromatografie van de grootte-uitsluiting scheidt de monsters naar grootte , zodat de meeste verontreinigingen en aggregaties5,6,7,8,9,10worden uitgesloten . In sommige gevallen is zelfs SEC-SAXS echter niet voldoende om een monodisperse monster te produceren, omdat het mengsel kan bestaan uit componenten die te dicht in grootte of hun fysieke eigenschappen of hun snelle dynamiek leiden tot overlappende pieken in de SEC UV-trace. In deze gevallen kan een op software gebaseerde deconvolutiestap van de verkregen SAXS-gegevens leiden tot een geïdealiseerde SAXS-curve van de afzonderlijke component5,11,12. Als voorbeeld, in protocol sectie 2, tonen we de standaard SEC-SAXS analyse van de vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant (E9 exominus)in complex met DNA. Vaccinia vertegenwoordigt het modelorganisme van de Poxviridae, een familie die verschillende ziekteverwekkers bevat, bijvoorbeeld het menselijke pokkenvirus. De polymerase bleek zich strak te binden aan DNA in biochemische benaderingen, waarbij de structuur van het complex onlangs is opgelost door röntgenkristallografie13.
De meeste synchronisatiefaciliteiten bieden een geautomatiseerde pijplijn voor gegevensverwerking die gegevensnormalisatie en integratie uitvoert en een set niet-geëertraceerde frames oplevert. Maar de in dit manuscript beschreven aanpak kan ook worden gebruikt met een laboratoriumbron, mits SEC-SAXS wordt uitgevoerd. Bovendien kan er extra automatisering beschikbaar zijn die stralingsbeschadigde frames afstoot en de bufferaftrekken14uitvoert . We laten zien hoe primaire gegevensanalyses op vooraf verwerkte gegevens kunnen worden uitgevoerd en hoe we de beschikbare gegevens in sectie 2 optimaal benutten.
In sectie 3 laten we zien hoe we SEC-SAXS-gegevens kunnen deconvolutelen en de curven efficiënt analyseren. Hoewel er verschillende deconvolutiemethoden zijn, zoals de Gaussische piekdeconvolutie, geïmplementeerd in US-SOMO15 en de Guinier geoptimaliseerde maximale waarschijnlijkheidsmethode, geïmplementeerd in de DELA-software16,vereisen deze over het algemeen een model voor de piekvorm12. De eindige grootte van individuele pieken die we onderzoeken maakt het gebruik van evoluerende factoranalyse (EFA) mogelijk, als een verbeterde vorm van singular value decomposition (SVD) om overlappende pieken te deconvolutelen, zonder te vertrouwen op de piekvorm of het verstrooiingsprofiel5,11. Een SAXS-specifieke implementatie is te vinden in BioXTAS RAW17. EFA werd voor het eerst gebruikt op chromatografie gegevens toen 2D diode array gegevens toegestaan matrices worden gevormd uit absorptie tegen retentie tijd en golflengte gegevens18. Waar EFA uitblinkt is dat het zich richt op het evoluerende karakter van enkelvoud waarden, hoe ze veranderen met het uiterlijk van nieuwe componenten, met het voorbehoud dat er een inherente volgorde in de overname10. Gelukkig, SEC-SAXS gegevens biedt alle nodige geordende acquisitie gegevens in georganiseerde 2D data arrays, lenen zich mooi aan de EFA techniek.
In sectie 4 zullen we de basisprincipes van modelonafhankelijke SAXS-analyse aantonen vanuit de afgetrokken SAXS-curve op de bufferachtergrond. Modelonafhankelijke analyse bepaalt de straal-van-gyratie van het deeltje (Rg), volume-van-correlatie (Vc), Porod Volume (Vp), en Porod-Debye Exponent (PE). De analyse biedt een semi-kwantitatieve beoordeling van de thermodynamische toestand van het deeltje in termen van compactheid of flexibiliteit via het dimensieloze Kratky-perceel2,4,19.
Ten slotte worden SAXS-gegevens gemeten in wederzijdse ruimte-eenheden en laten we zien hoe we de SAXS-gegevens kunnen transformeren naar echte ruimte om de distributiefunctie van de paarafstand, P(r), te herstellen. De P(r)-verdeling is de verzameling van alle afstanden die zich in het deeltje bevinden en omvat de maximale afmeting van het deeltje, dmax. Aangezien dit een thermodynamische meting is, vertegenwoordigt de P(r)-verdeling de fysieke ruimte die wordt ingenomen door de conformatieruimte van de deeltjes. Een goede analyse van een SAXS-gegevensset kan oplossingen bieden die een aanvulling vormen op informatie met hoge resolutie uit kristallografie en cryo-EM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS is een populaire techniek die wordt gebruikt in de moleculaire en structurele biologie om de oplossingsstructuur, deeltjesgrootte en -vorm, oppervlakte-volumeverhouding en conformatieveranderingen van macromoleculen en macromoleculaire complexen te bepalen. Een hoogwaardige SAXS-gegevensset voor structurele modellering moet afkomstig zijn van monodisperse, homogene monsters en dit wordt vaak alleen bereikt door een combinatie van inline chromatografie en onmiddellijke SAXS-meting. Meestal wordt chromatografie van grootte-uitsluiting gebruikt om monsters te scheiden en verontreinigingen en aggregaties uit te sluiten van het deeltje van belang, waardoor SAXS-metingen kunnen worden uitgevoerd vanaf een goed opgeloste chromatografische piek van één eiwitsoort. Toch is in sommige gevallen zelfs inline zuivering geen garantie voor monodisperse monsters, hetzij omdat meerdere componenten te dicht bij elkaar in grootte of veranderingen in vorm veroorzaakt door bindende alter waargenomen elution tijd. In deze gevallen kan het mogelijk zijn om de SAXS-gegevens van een mengsel te deconvolutelen om de geïdealiseerde SAXS-curven van afzonderlijke componenten te verkrijgen. Hier laten we zien hoe dit wordt bereikt en wordt de praktische analyse van SEC-SAXS-gegevens uitgevoerd op ideale en moeilijke monsters. Concreet tonen we de SEC-SAXS analyse van de vaccinia E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant.

Het voordeel van het gebruik van deconvolutie ten opzichte van klassieke frame selectie13 is het verwijderen van de invloed van soorten op elkaar, het produceren van een monodisperse verstrooiing signaal. Dit wordt ook vaak gevolgd met een betere signaal-ruisverhouding. Wanneer E9 exominus is gebonden aan DNA en uitgevoerd met behulp van SEC-SAXS, twee pieken worden waargenomen (figuur 1). De eerste, grote piek (ongeveer frames 420\u2012475) is het E9 exominus-DNA complex de tweede (ongeveer frames 475\u2012540), de niet-gebonden toestand (zie Aanvullende gegevens: figuur 2). Terwijl de klassieke benadering van het selecteren van frames een stabiele Rg van het complex in de eerste piek biedt (zie Aanvullende gegevens: figuur 3),wordt de tweede piek duidelijk samengevoegd en toont de Rg over het perceel aan dat de tweede piek van belang geen stabiele Rg heeft, als gevolg van kruispiekbesmetting. Slechts 5 frames konden worden gebruikt die een semi-stabiele Rg toonde, wanneer afgetrokken gaven ze een Rg = 36.3 Å (Figuur 2, groen). Toen de toppen werden gedeconvoluteerd met behulp van EFA werd de overeenkomstige curve voor de tweede piek(figuur 2, blauw) bedekt met het origineel en toonde een duidelijke daling van het signaal naar ruis, en een lagere Rg, 34,1 Å werd geregistreerd. De Kratky plot (Figuur 3) toont het complex met de gedeconvoluted piek (blauw) is meer bolvormig. Dit wordt bevestigd door de P(r) curve (Figuur 4) die een dmax 108,5 Å geeft voor de gedeconvoluteerde curve (blauw), terwijl de niet-gedeconvoluteerde meer langwerpig is met een dmax 120 Å (groen), dit is waarschijnlijk te wijten aan heterogeniteit als gevolg van de niet-begrensde E9 exominus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> Figuur 1: Signaalplot van E9 exominus alleen en met DNA in complex. Het bovenste paneel toont een plot van de integrale verhouding tot de achtergrond voor elk frame van een SEC-SAXS-run (lichtblauw). De rode punten tonen de Rg bij elk frame over de piek. Het onderste paneel toont de bijbehorende warmtekaart met de restanten voor elk frame gekleurd volgens de Durbin-Watson auto-correlatie analyse, regio's met een hoge gelijkenis zijn gekleurde cyaan, terwijl ongelijke frames volgen donkerder blauw tot roze en ten slotte naar rood, afhankelijk van de ernst van de ongelijksoortigheid. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> Figuur 2: Plot van intensiteit versus verstrooiingsvector. Een overlay van de afgetrokken SAXS-gegevens vormen de E9 exominus . In groene 5 frames (frame 517\u2012522) gemiddeld en afgetrokken van een gebied van semi-stabiele Rg en in het blauw de representatieve verstrooiing curve afgeleid van de EFA deconvolution van de SEC-SAXS piek. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> Figuur 3: Dimensieloze Kratky curve. Overlay van de gedeconvoluteerde (blauw) en niet-gedeconvoluteerde (groene) Kratky curve met E9 exominus is bolvormig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> Figuur 4: P(r) curve. De overlay van de gedeconvoluteerde (blauw) en niet-gedeconvoluteerde (groene) krommen voor de E9 exominus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
Aanvullende gegevens. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Klik hier om dit bestand te downloaden</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

SEC-BioSAXS metingen van biologische macromoleculen zijn een standaardbenadering voor het bepalen van de oplossingsstructuur van macromoleculen en hun complexen. Hier analyseren we SEC-BioSAXS-gegevens van twee soorten vaak aangetroffen SEC-sporen: chromatogrammen met volledig opgeloste en gedeeltelijk opgeloste pieken. We tonen de analyse en deconvolutie met behulp van scatter en BioXTAS RAW.

Analyse van SEC-SAXS-gegevens via EFA-deconvolution en Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Biologische kleine hoek x-ray verstrooiing biedt structurele metingen van macromolecule en macromoleculaire complexen. Idealiter moet het te meten monster monodispersed zijn. Hoewel in sommige gevallen de grootte uitsluiting chromatografie SAXS is niet voldoende om monodispersity te produceren, een software-gebaseerde deconvolutie van de SAXS-gegevens kan worden uitgevoerd om een geïdealiseerde SAXS curve te produceren.Volgens dit protocol kunnen een deconvolutieprogramma en het gebruiksvriendelijke Scatter-programma worden gebruikt om het Vaccinia virus DNA polymerase exominus mutanten te analyseren. Als u een achtergrondaftrekken van de chromatografiegegevens voor grootteuitsluiting wilt uitvoeren, opent u het op Java gebaseerde Scatter 4-programma en opent u het tabblad SEC. Sleep en drop de gereduceerde gegevensbestanden in het venster Gegevens neerzetten onder het venster en klik op de knop uitvoermap en open om de uitvoermap in te stellen waarin de gegevens worden opgeslagen.Voer de voorbeeldnaam in het vak Opslaan als in en klik op traceren. Klik op de knop Details bewerken om de experimentele details te bewerken en de juiste velden in te vullen. Als u de bufferframes handmatig wilt selecteren, klikt u op Buffers instellen.Klik en sleep om de buffer opnieuw te selecteren als een flat op de traceercurve vóór het lege volume van de chromatografiekolom voor grootte van ongeveer 100 frames en klik op setbuffer en update om het SEC-bestand opnieuw te berekenen. Klik en sleep met links om een interessegebied op het signaalplot te selecteren en klik links en sleep de kruisharen in het plot van de warmtekaart om de zoom en subset van frames te selecteren die worden gebruikt voor samenvoegen. Met een andere linkerklik markeert u de frames in de heatmap die overeenkomt met het gebied rechtsonder van de kruisharen.Idealiter moet het frame een gebied markeren met een overwegend cyaankleur en een stabiele straal van gyration. Als u tevreden bent met de geselecteerde frames, klikt u op Samenvoegen om de afgetrokken frames samen te voegen en klikt u op het tabblad analyse om de gegevens weer te geven. Laad de gegevensset in het deconvolutieprogramma voor deconvolutie van de gegevens.Gebruik in het configuratiescherm onder bestanden het mapsymbool om de gegevens te zoeken en alle DAT-bestanden te markeren. Een plot van geïntegreerde intensiteit versus framenummer zal worden getrokken in de serie plot. Klik onder het tabblad reeks om de curve te markeren en het pop-upvenster voor DE LC-analyse te openen.Als u een geschikt buffergebied wilt selecteren, klikt u op Regio toevoegen om een gebied vóór de piek van het chromatogram en een gebied na de oplosmiddelfront te selecteren en op de buffer in te stellen. Pop-upvensters geven aan dat frames niet zijn geselecteerd voor de achtergrond. Als u de EFA wilt starten, klikt u met de rechtermuisknop op het gemarkeerde bestand en selecteert u EFA in het menu.In het pop-upvenster moet de enkele waardedecompositie van de gegevensset worden waargenomen. Schakel in het selectievakje de waarden van het vak frames gebruiken in om te bevestigen dat het hele piekgebied dat moet worden gedeconvolutt, is bedekt met het intensiteitsplot. De plot met enkelvoudswaarden toont de intensiteit van de enkelvoudswaarden boven de basislijn.Als de linker en rechter enkele vectoren niet overeenkomen, wijzigt u het significante enkelvoudsvectoraantal in twee en verplaatst u de frames totdat de linker- en rechtervoentvectoren vergelijkbaar zijn. De EFA wordt berekend, het genereren van percelen in de voorwaartse en achterwaartse richtingen voor elke vector en geven aan wanneer de componenten het oplossingsprofiel starten en verlaten voor de geselecteerde grootteuitsluitingschromatografie SAXS-gegevens. RAW zal proberen om de bereiken te identificeren.Gebruik indien nodig de pijlen om de bereiken te wijzigen, zodat elke cirkel het begin is van een buigpunt, stijgt van of valt naar basislijn en klik vervolgens. Als u pieken wilt verminderen of elimineren, moet u ongeveer identificeren welk frame overeenkomt met de piek met behulp van de pijlspunten voor bereikbesturingselementen om de besturingselementen voor het componentbereik aan te passen. Wanneer een minimaal Chi-vierkant is bereikt, klikt u terug om een validatiecontrole uit te voeren.Als de oorspronkelijke EFA-plots er nog steeds geldig uitzien, klikt u op volgende en slaat u EFA-gegevens op om de plots op te slaan. Klik vervolgens op Gereed om het EFA-venster te sluiten. Open vervolgens in het RAW-venster profielen in het plotpaneel om de curven weer te geven.Klik op het tabblad Profielen van het configuratiescherm met de rechtermuisknop om de curven op te slaan als DAT-bestanden. Open voor SAXS-bepaling het tabblad spreidingsanalyse en selecteer G om het handmatige Guinier-analysegereedschap te selecteren. In het perceel, toe te voegen of te verwijderen punten zodanig dat de resten niet over een glimlach of frons functie.De geselecteerde gegevens in de Guinier-pasvorm mogen de maximale wachtrij niet overschrijden, vermenigvuldigd met een straal van de gyratielimiet van 1,3. Klik genormaliseerd Kratky. De resulterende plot biedt een beoordeling van de structurele toestand van het macromolecuul, bolvormig, cilindrisch, wanordelijk, genormaliseerd voor massa en concentratie.Klik op het volume van de correlatie. De totale verspreide intensiteit en een geïntegreerd gebied van de totale verspreide intensiteit als functie van Q-percelen worden weergegeven als een snelle referentie voor het valideren van de kwaliteit van de verstrooiingscurve. Klik op flexibiliteit om de flexibiliteitsanalyse te starten.Elk paneel in het pop-upvenster toont een plot waarin een machtsrechtelijke relatie tussen de compacte en de langgerekte flexibele biopolymeren wordt uitgebuit. Gebruik de schuifregelaar onder aan het vak om de weergave van de gegevens te wijzigen totdat een plateau in een van de percelen is bereikt. Klik direct na het uitvoeren van een flexibiliteitsanalyse op volume.Er wordt een pop-up van drie grafieken gegenereerd. De Porod-Debye plot tracks waar de schuifregelaar van de flexibiliteit plot werd achtergelaten en toont de plateaued gebied gegevens. Als u het volume van het deeltje wilt berekenen, verplaatst u de begin- en eindpunten totdat de blauwe lijn op het perceel in het plateaugebied past.Voor een onbevooroordeeld resultaat, de restanten in de Porod-Debye exponent power law fit mag geen patroon te tonen. Onder het tabblad P van R kunnen de werkelijke ruimteverdeling en de verstrooiingscurve voor het monster worden waargenomen. Idealiter moet de verdelingscurve glad zijn zonder golven en moet de x-as gewoon voorzichtig raken.Klik met de rechtermuisknop op de voorbeeldnaam en klik op DMAX zoeken om een nieuw venster te openen. De limieten voor de maximale dimensie zijn vooraf ingesteld met het voorgestelde maximale Q-bereik, de maximale gegevenspunten die moeten worden gebruikt voor de berekening, de lagere en bovenste maximale dimensielimieten en een lagere en bovenste alfascore. Klik op start.Er wordt een samengestelde verdeling gemaakt, samen met een voorgestelde maximale dimensie en alfaniveau. Als deze gegevens aanvaardbaar zijn, sluit u het venster om terug te keren naar het tabblad P van R, waar de wederkerige ruimteplot nu wordt bijgesneden om het voorgestelde maximale Q-bereik aan te passen. Selecteer het meer model en klik op achtergrond om het alfaniveau en de maximale dimensie in te stellen op de voorgestelde waarden in het pop-upvak.Klik op verfijnen. Er wordt een plot voor cross-validatie geopend, waaruit blijkt of punten moesten worden afgewezen zoals aangegeven in het rood. Als er slechts een paar afgewezen punten en de verdeling ziet er goed uit, dan is het model is goed.U drukt een rapport af op het tabblad Analyse. Klik met de rechtermuisknop om het voorbeeld te markeren en klik met de rechtermuisknop op de voorbeeldnaam. Selecteer Rapport maken in de afzonderlijke gegevensset.Er wordt een tekstvak geopend om opmerkingen mogelijk te maken en er wordt een PDF-document gemaakt met alle gegenereerde cijfers en waarden. In deze representatieve analyse, E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant was gebonden aan DNA en lopen met behulp van grootte uitsluiting chromatografie kleine hoek x-ray verstrooiing. Er werden twee pieken waargenomen.De eerste grote piek vertegenwoordigt het E9 DNA polymerase exonuclease minus mutant DNA complex. En de tweede geeft de niet-gebonden toestand aan. Terwijl de klassieke benadering van het selecteren van frames een stabiele straal van gyration van het complex in de eerste piek biedt, wordt de tweede piek duidelijk samengevoegd en de straal van gyration over het perceel toont aan dat de tweede piek van belang geen stabiele straal van gyration toe te schrijven aan kruispiekverontreiniging heeft.In deze analyse konden slechts vijf frames worden gebruikt die een semi-stabiele straal van gyration vertoonden. Wanneer afgetrokken, gaven ze een straal van gyration van 36,3 angstroms. Toen de pieken werden gedeconvoluteerd met behulp van EFA, werd de overeenkomstige curve voor de tweede piek bedekt met het origineel, met een duidelijke daling van het signaal naar het lawaai en de lagere straal van gyration van 34,1 angstroms.Een Kratky plot van de gegevens blijkt dat het complex met de ingewikkelde piek is meer bolvormig, zoals bevestigd door de PR-curve die een maximale dimensie van 108,5 angstroms voor de gedeconvolutte curve geeft. De niet-gedeconvolkte gegevens voor deze analyse zijn langer langwerpig met een maximale dimensie van 120 angstroms, waarschijnlijk als gevolg van de heterogeniteit die voortvloeit uit de niet-gebonden E9 polymerase minus exonleaseuc mutant. De meest kritieke stappen zijn bij het selecteren van de enkelvoud waarden en het bereik van de gebruikte gegevens als deze sterk van invloed op de nauwkeurigheid van de deconvolutie.De resultaten moeten niet op zichzelf worden genomen, maar verder worden beoordeeld met behulp van aanvullende technieken zoals analytische centrifugatie of multi-angle laserlichtverstrooiing om hun biologische interpretatie mogelijk te maken. In-line kolom gekoppelde SAXS in combinatie met deconvolutie en een gebruiksvriendelijke interface zoals het programma Scatter biedt is een krachtig pakket om zinvolle structurele gegevens te verstrekken, zelfs van intrinsiek moeilijke systemen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Productie, kristallisatie en structuur bepalen van<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via Microseeding en zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaërobe EiwitReiniging en kinetische analyse via zuurstof-elektrode voor het bestuderen van de activiteit van de DesB Dioxygenase en inhibitie

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Volledig autonoom karakterisering en het verzamelen van gegevens van kristallen van biologische macromoleculen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Met behulp van de open-source MALDI TOF-MS IDBac pijpleiding voor analyse van microbiële eiwitten en gespecialiseerde metaboliet gegevens

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie over het metabolisme van zes systemische insecticiden in een nieuw opgerichte cel schorsing cultuur afgeleid van thee (Camellia sinensis L.) Bladeren

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Perturbing endotheliale biomechanica via Connexin 43 structurele verstoring

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Sample Voorbereiding voor Proteomics Facility Indiening en latere data-analyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Vaste doel seriële gegevensverzameling bij Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Proteomisch profiel van EPS-urine door FASP-vergisting en data-onafhankelijke analyse

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...