Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
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Wir würdigen die finanzielle Unterstützung des Projekts durch das französische Stipendium REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 und durch Forschungsstipendien des Service de Santé des Armées und der Délégation Générale pour l'Armement. Wir danken dem ESRF für die SAXS-Strahlzeit. Diese Arbeit nutzte die Plattformen des Grenoble Instruct-ERIC Zentrums (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) im Rahmen der Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), unterstützt von FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) und GRAL, finanziert von der University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). Die IBS erkennt die Integration in das Interdisziplinäre Forschungsinstitut von Grenoble (IRIG, CEA) an. Wir danken Wim P. Burmeister und Frédéric Iseni für die finanzielle und wissenschaftliche Unterstützung und wir danken auch Dr. Jesse Hopkins von BioCAT an der APS für seine Hilfe und für die Entwicklung von BioXTAS RAW.

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. 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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Es ist wünschenswert, eine monodisperse Probe zu haben, bevor sie ein SAXS-Experiment startet, aber in Wirklichkeit erfüllen viele Datensammlungen dies nicht und müssen durch die Kombination der Messung mit der Inlinechromatographie – sec in den meisten Fällen – verbessert werden. Doch selbst der Zeitmangel zwischen Reinigung und Datenerfassungsmonodispersität der Probe ist nicht garantiert. Dies gilt am häufigsten für Experimente, bei denen Komponenten zu nah an der Größe oder in ihren physikalischen Eigenschaften sind, um getrennt zu werden, oder die anfällig für schnelle Dynamik sind. Hier haben wir ein Protokoll bereitgestellt, das die Zersetzung einzelner Werte mit der sich entwickelnden Faktoranalyse kombiniert, um den Einfluss von DNAbound E9 exominus aus seiner ungebundenen Form zu entfernen und ein monodisperses Streuprofil zu erstellen, das wir dann mit dem SAXS-Paket Scatter IV analysieren konnten.
SVD mit EFA von SEC-SAXS-Daten sind sehr leistungsfähige Methoden, die entwickelt wurden, um SAXS-Daten zu dekonvoluten und die Analyse zu verbessern, aber sie haben Einschränkungen. Sie verlangen, dass Rauschen oder Driften in der Pufferbasislinie des SEC-SAXS auf ein Minimum beschränkt werden. Dies kann eine zusätzliche Spaltenäquilibration (besser, um mehr als 3 Spaltenvolumes, abhängig vom Puffer) vor dem Laden der Stichprobe zu verwenden. Der wichtigste Schritt ist jedoch die Wahl der Anzahl der Singularwerte und des verwendeten Datenbereichs, da dies die Genauigkeit der Dekonvolution stark beeinflussen wird. Aus diesem Grund sollten die Ergebnisse nicht auf eigene Faust, sondern mit Techniken wie analytischer Ultrazentrifugation (AUC) oder Multi-Winkel-Laser-Lichtstreuung (MALLS) zur biologischen Interpretation weiter analysiert werden.
Scatter IV ist ein neues Softwarepaket, kostenlos für Forschung und industrielle Nutzung mit einer intuitiven Benutzeroberfläche, die es auch Nicht-Experten ermöglicht, ihre Daten zu analysieren. Scatter IV verfügt über mehrere neue Funktionen, die zur Verbesserung der Analyse von SEC-SAXS-Daten beitragen, wie z. B. die mit dem Signaldiagramm verknüpfte Heatmap, die eine höhere Genauigkeit bei auswahlnachlassender Rahmenauswahl ermöglicht. Bei der primären Datenanalyse bieten die Guinier Peak-Analyse und das mit der P(r)-Analyse verbundene Cross-Validierungsdiagramm eine integrierte Fehlerbehebungsfähigkeit in der Software.
Es sollte erwähnt werden, dass viele andere Programme für die primäre Datenanalyse verwendet werden können; Diese enthalten die gleichen grundlegenden Funktionen und werden auch regelmäßig aktualisiert, wie BioXTAS RAW17 ATSAS-Paket24 und US-SOMO15, um nur einige zu nennen.
Unabhängig davon, welches SAXS-Paket für die Analyse verwendet wird, sind die wichtigsten Einschränkungen üblich: die Probenvorbereitung vor der Entnahme und Analyse. Im gezeigten Beispiel E9 exominus ist die Verbesserung des Signal-Rausch-Verhältnisses und mit einer Reduktion des Rg der dmax, die mit einer monodispersen Probe verbunden ist, deutlich zu erkennen. Dies wird die weitere Verarbeitung der Daten wie Fitting oder Modellierung mit bekannten hochauflösenden Strukturen erheblich unterstützen.

Biologische Makromoleküle sind zu klein, um selbst mit den besten Lichtmikroskopen gesehen zu werden. Aktuelle Methoden zur Bestimmung ihrer Strukturen beinhalten in der Regel die Kristallisation des Proteins oder Messungen an einer großen Anzahl identischer Moleküle gleichzeitig. Die Kristallographie liefert zwar Informationen über den atomaren Wert, stellt jedoch eine künstliche Probenumgebung dar, da die meisten Makromoleküle nicht in kristalliner Form in der Zelle dargestellt werden. In den letzten Jahren lieferte die Kryo-Elektronenmikroskopie ähnliche hochauflösende Strukturen großer Makromoleküle /makromolekularer Komplexe, aber obwohl die Proben näher am physiologischen Zustand sind, sind sie immer noch gefroren, daher unbeweglich und statisch. Die Bio-Kleinwinkel-Röntgenstreuung (BioSAXS) ermöglicht eine strukturelle Messung des Makromoleküls unter für die Biologie relevanten Bedingungen. Dieser Zustand kann als eine auf Einer Nanometerskala bestimmte 3D-Form mit niedriger Auflösung visualisiert werden und erfasst den gesamten Konformationsraum des Makromoleküls in Lösung. BioSAXS-Experimente bewerten oligomere Zustand, Domäne und komplexe Arrangements sowie Flexibilität zwischen den Domänen1,2,3effizient. Die Methode ist genau, meist zerstörungsfrei und erfordert in der Regel nur ein Minimum an Probenvorbereitung und Zeit. Für die beste Interpretation der Daten müssen die Stichproben jedoch monodisperse sein. Das ist eine Herausforderung; biologische Moleküle sind oft anfällig für Verunreinigungen, schlechte Reinigung und Aggregation, zum Beispiel durch Gefrierauftauen4. Die Entwicklung der Inlinechromatographie, gefolgt von sofortiger SAXS-Messung, trägt dazu bei, diese Effekte zu mildern. Die Größenausschlusschromatographie trennt die Proben nach Größe und schließt damit die meisten Verunreinigungen und Aggregationen5,6,7,8,9,10aus. In einigen Fällen reicht jedoch sogar SEC-SAXS nicht aus, um eine monodisperse Probe zu erzeugen, da das Gemisch aus Komponenten bestehen kann, die zu nah an der Größe sind oder ihre physikalischen Eigenschaften oder ihre schnelle Dynamik zu überlappenden Spitzen in der SEC-UV-Spur führen. In diesen Fällen kann ein softwarebasierter Dekonvolutionschritt der erhaltenen SAXS-Daten zu einer idealisierten SAXS-Kurve der einzelnen Komponente5,11,12führen. Als Beispiel zeigen wir in Protokollabschnitt 2 die Standard-SEC-SAXS-Analyse der Vaccinia E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant (E9 exominus) in Komplex mit DNA. Vaccinia stellt den Modellorganismus der Poxviridae dar, einer Familie, die mehrere Krankheitserreger enthält, zum Beispiel das menschliche Pockenvirus. Es wurde gezeigt, dass die Polymerase in biochemischen Ansätzen eng an die DNA bindet, wobei die Struktur des Komplexes vor kurzem durch Röntgenkristallographie13gelöst wurde.
Die meisten Synchrotron-Anlagen bieten eine automatisierte Datenverarbeitungspipeline, die Datennormalisierung und Integration durchführt und eine Reihe von nicht subtracted Frames erzeugt. Der in diesem Manuskript beschriebene Ansatz könnte jedoch auch mit einer Laborquelle verwendet werden, sofern SEC-SAXS durchgeführt wird. Darüber hinaus kann eine zusätzliche Automatisierung zur Verfügung stehen, die strahlungsgeschädigte Rahmen zurückweist und die Puffersubtraktion14durchführt. Wir zeigen, wie Sie die primäre Datenanalyse für vorverarbeitete Daten durchführen und die verfügbaren Daten in Abschnitt 2 nutzen können.
In Abschnitt 3 zeigen wir, wie SEC-SAXS-Daten dekonvolute und die Kurven effizient analysiert werden. Zwar gibt es mehrere Dekonvolution-Methoden wie die Gaußsche Peak-Dekonvolution, implementiert in US-SOMO15 und die Guinier optimierte Maximum-Likelihood-Methode, implementiert in der DELA-Software16, diese erfordern in der Regel ein Modell für die Peak-Form12. Die endliche Größe einzelner Spitzen, die wir untersuchen, ermöglicht die Verwendung von Evolving Factor Analysis (EFA), als eine verbesserte Form der Singular Value Decomposition (SVD), um überlappende Spitzen zu dekonvolute, ohne sich auf die Spitzenform oder das Streuprofil5,11zu verlassen. Eine SAXS-spezifische Implementierung finden Sie in BioXTAS RAW17. EFA wurde zum ersten Mal für Chromatographiedaten verwendet, als 2D-Dioden-Array-Daten erlaubten, Matrizen aus Absorption gegen Aufbewahrungszeit und Wellenlängendaten zu bilden18. Wo EFA zeichnet sich aus, ist, dass es sich auf den sich entwickelnden Charakter von Singularwerten konzentriert, wie sie sich mit dem Aussehen neuer Komponenten verändern, mit dem Vorbehalt, dass es eine inhärente Ordnung in der Akquisition10gibt. Glücklicherweise liefern SEC-SAXS-Daten alle notwendigen geordneten Erfassungsdaten in organisierten 2D-Datenarrays und verleihen sich gut an die EFA-Technik.
In Abschnitt 4 zeigen wir die Grundlagen der modellunabhängigen SAXS-Analyse aus der subtrahierten SAXS-Kurve im Pufferhintergrund. Die modellunabhängige Analyse bestimmt den Kreisradius (Rg), das Korrelationsvolumen (Vc), das Porod-Volumen (Vp) und den Porod-Debye-Exponent (PE). Die Analyse liefert eine semiquantitative Bewertung des thermodynamischen Zustands des Teilchens in Bezug auf Kompaktheit oder Flexibilität über das dimensionlose Kratky-Diagramm2,4,19.
Schließlich werden SAXS-Daten in wechselseitigen Raumeinheiten gemessen, und wir zeigen, wie die SAXS-Daten in den realen Raum transformiert werden, um die Verteilungsfunktion "Paarentfernung" (P(r) wiederherzustellen. Die P(r)-Verteilung ist der Satz aller Entfernungen innerhalb des Partikels und enthält die maximale Dimension des Partikels, dmax. Da es sich um eine thermodynamische Messung handelt, stellt die P(r)-Verteilung den physischen Raum dar, der vom Konformationsraum der Teilchen belegt wird. Die richtige Analyse eines SAXS-Datasets kann Lösungszustandseinblicke bieten, die hochauflösende Informationen aus Kristallographie und Kryo-EM ergänzen.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS ist eine beliebte Technik, die in der Molekular- und Strukturbiologie verwendet wird, um die Lösungsstruktur, Partikelgröße und -form, das Verhältnis zwischen Oberfläche und Volumen und konforme Veränderungen von Makromolekülen und makromolekularen Komplexen zu bestimmen. Ein qualitativ hochwertiger SAXS-Datensatz für die Strukturelle Modellierung muss aus monodispersen, homogenen Proben stammen, die oft nur durch eine Kombination aus Inlinechromatographie und sofortiger SAXS-Messung erreicht werden. Am häufigsten wird die Größenausschlusschromatographie verwendet, um Proben zu trennen und Verunreinigungen und Aggregationen vom Teilchen des Interesses auszuschließen, so dass SAXS-Messungen von einem gut aufgelösten chromatographischen Gipfel einer einzelnen Proteinart durchgeführt werden können. Dennoch ist in einigen Fällen selbst die Inline-Reinigung keine Garantie für monodisperse Proben, entweder weil mehrere Komponenten in ihrer Größe zu nah beieinander liegen oder Formänderungen durch Bindung saugen die wahrgenommene Elutionszeit verändern. In diesen Fällen kann es möglich sein, die SAXS-Daten eines Gemischs zu dekonvolutieren, um die idealisierten SAXS-Kurven einzelner Komponenten zu erhalten. Hier zeigen wir, wie dies erreicht wird und die praktische Analyse der SEC-SAXS-Daten an idealen und schwierigen Proben durchgeführt wird. Insbesondere zeigen wir die SEC-SAXS-Analyse der Vaccinia E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant.

Der Vorteil der Dekonvolution gegenüber der klassischen Rahmenauswahl13 besteht darin, den Einfluss von Arten aufeinander zu beseitigen und ein monodisperses Streusignal zu erzeugen. Dies wird auch oft mit einem besseren Signal-Rausch-Verhältnis gefolgt. Wenn E9 exominus an DNA gebunden ist und mit SEC-SAXS ausgeführt wird, werden zwei Peaks beobachtet (Abbildung 1). Der erste, große Peak (ungefähr Frames 420-u202475)ist der E9-Exo-Minus-DNA-Komplex der zweite (ungefähr Frames 475-u2012540), der ungebundene Zustand (siehe Zusatzdaten: Abbildung 2). Während der klassische Ansatz der Auswahl von Rahmen eine stabile Rg des Komplexes in der ersten Spitze bietet (siehe Ergänzende Daten: Abbildung 3), wird der zweite Peak klar zusammengeführt und der Rg über das Diagramm zeigt, dass der zweite Gipfel des Interesses aufgrund der Kreuzspitzenkontamination keinen stabilen Rg hat. Es konnten nur 5 Frames verwendet werden, die einen halbstabilen Rg zeigten, wenn sie subtrahiert wurden, gaben sie ein Rg = 36,3 "(Abbildung 2, grün). Wenn die Spitzen mit EFA dekonvolutiert wurden, wurde die entsprechende Kurve für den zweiten Peak(Abbildung 2, blau) mit dem Original überlagert und zeigte eine deutliche Abnahme des Signals auf Rauschen, und ein niedrigerer Rg, 34,1 , wurde aufgezeichnet. Die Kratky-Plot (Abbildung 3) zeigt den Komplex mit dem deconvoluted Peak (blau) ist kugelförmiger. Dies wird durch die P(r)-Kurve (Abbildung 4) bestätigt, die für die deconvoluted-Kurve (blau) ein dmax. 108,5 - ergibt, während die nicht-dekonvolutierte mit einem dmax 120 ( grün) mehr länsiert ist, was höchstwahrscheinlich auf die Heterogenität zurückzuführen ist, die sich aus dem ungebundenen E9 exominusergibt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> Abbildung 1: Signaldiagramm von E9 exominus allein und mit DNA in Komplex. Das obere Bedienfeld zeigt ein Diagramm des integralen Verhältnisses zum Hintergrund für jeden Frame eines SEC-SAXS-Laufs (hellblau). Die roten Punkte zeigen die Rg an jedem Frame über dem Gipfel. Das untere Panel zeigt die entsprechende Heatmap, die die Residuen für jeden Nachdruck nach der Durbin-Watson Autokorrelationsanalyse zeigt, Regionen mit hoher Ähnlichkeit sind cyan gefärbt, während unterschiedliche Rahmen je nach Schwere der Unähnlichkeit dunkleren Blautönen und schließlich zu Rot folgen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> Abbildung 2: Diagramm der Intensität im Vergleich zum Streuvektor. Eine Überlagerung der subtrahierten SAXS-Daten bilden das E9 exominus . In grünen 5 Rahmen (Rahmen 517-2012522) gemittelt und subtrahiert von einer Fläche von halbstabilen Rg und in blau die repräsentative Streukurve abgeleitet aus der EFA-Dekonvolution der SEC-SAXS Peak. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> Abbildung 3: Dimensionlose Kratky-Kurve. Die Überlagerung der dekonvolutierten (blauen) und nicht-devoluted (grünen) Kratky-Kurve, die E9 exominus zeigt, ist kugelförmig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> Abbildung 4: P(r)-Kurve. Die Überlagerung der dekonvolutierten (blauen) und nicht-devoluted (grünen) Kurven für die E9 exominus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Daten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen</a>

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Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

SEC-BioSAXS-Messungen biologischer Makromoleküle sind ein Standardansatz zur Bestimmung der Lösungsstruktur von Makromolekülen und deren Komplexen. Hier analysieren wir SEC-BioSAXS-Daten aus zwei Arten häufig auftretender SEC-Spuren – Chromatogramme mit vollständig aufgelösten und teilweise aufgelösten Peaks. Wir zeigen die Analyse und Dekonvolution mit Scatter und BioXTAS RAW.

Analyse von SEC-SAXS-Daten über EFA-Dekonvolution und Streuung

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Die biologische Kleinwinkel-Röntgenstreuung ermöglicht strukturelle Messungen von Makromolekül- und Makromolekularkomplexen. Idealerweise sollte die zu messende Probe monodispergiert sein. Obwohl in einigen Fällen die Größenausschlusschromatographie SAXS nicht ausreicht, um Monodispersität zu erzeugen, kann eine softwarebasierte Dekonvolution der SAXS-Daten durchgeführt werden, um eine idealisierte SAXS-Kurve zu erzeugen.Im Anschluss an dieses Protokoll können ein Dekonvolution-Programm und das benutzerfreundliche Scatter-Programm verwendet werden, um das Vaccinia-Virus DNA-Polymerase-Exominus-Mutationen zu analysieren. Um eine Hintergrundsubtraktion der Größenausschlusschromatographiedaten durchzuführen, öffnen Sie das Java-basierte Scatter 4-Programm, und öffnen Sie die Registerkarte SEC. Ziehen und ablegen Sie die reduzierten Datendateien in die Drop-Daten unter dem Fenster, klicken Sie auf die Schaltfläche "Ausgabeverzeichnis" und öffnen Sie, um das Ausgabeverzeichnis festzulegen, in dem die Daten gespeichert werden.Geben Sie den Beispielnamen in das Feld Speichern als ein, und klicken Sie auf Ablaufverfolgung. Klicken Sie auf die Schaltfläche Details bearbeiten, um die experimentellen Details zu bearbeiten und die entsprechenden Felder auszufüllen. Um die Pufferrahmen manuell auszuwählen, klicken Sie auf Puffer festlegen.Klicken Sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um den Puffer als flache Stagnungskurve vor dem leeren Volumen der Spalte "Größenausschlusschromatographie" von etwa 100 Frames erneut auszuwählen, und klicken Sie auf Puffer festlegen, und aktualisieren Sie, um die SEC-Datei neu zu berechnen. Klicken sie mit der linken Maustaste und ziehen Sie, um einen Bereich auszuwählen, der für das Signaldiagramm von Interesse ist, und ziehen Sie die Fadenkreuze im Heatmap-Plot, um den Zoom und die Teilmenge der Frames auszuwählen, die zum Zusammenführen verwendet werden. Markieren Sie mit einem weiteren Linksklick die Rahmen in der Heatmap, die dem Bereich der rechten unteren Seite der Fadenkreuze entsprechen.Idealerweise sollte der Rahmen einen Bereich mit einer überwiegend zyanischen Farbe und einem stabilen Kreiselradius hervorheben. Wenn Sie mit den ausgewählten Frames zufrieden sind, klicken Sie auf Zusammenführen, um die subtrahierten Frames zusammenzuführen, und klicken Sie auf die Registerkarte Analyse, um die Daten anzuzeigen. Laden Sie den Datensatz in das Dekonvolution-Programm, um die Daten zu dekonvolutionieren.Verwenden Sie im Bedienfeld unter Dateien das Ordnersymbol, um die Daten zu suchen und alle DAT-Dateien hervorzuheben. Im Seriendiagramm wird ein Diagramm mit integrierter Intensität im Vergleich zur Rahmenzahl gezeichnet. Klicken Sie auf der Registerkarte Serie, um die Kurve hervorzuheben und das Popupfenster für die LC-Analyse zu öffnen.Um einen geeigneten Pufferbereich auszuwählen, klicken Sie auf Bereich hinzufügen, um einen Bereich vor der Spitze des Chromatogramms und einen nach der Lösungsmittelfront auszuwählen, und klicken Sie auf Den puffer festlegen. Popupfenster zeigen an, dass Rahmen nicht für den Hintergrund ausgewählt wurden. Um die EFA zu starten, klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die markierte Datei und wählen Sie EFA aus dem Menü aus.Im Popupfenster sollte die Einzelwertzerlegung des Datasets beobachtet werden. Aktivieren Sie im Feld Steuerelemente die Werte für die Verwendung von Rahmen, um zu bestätigen, dass der gesamte zu dekonvolute maximale Bereich im Intensitätsdiagramm abgedeckt ist. Das Singularwertediagramm zeigt die Intensität der Singularwerte über der Basislinie an.Wenn die linken und rechten Einzelvektoren nicht übereinstimmen, ändern Sie die signifikante Singularvektorzahl in zwei, und verschieben Sie die Frames, bis die linken und rechten Singularvektoren ähnlich sind. Der EFA wird berechnet, erzeugt Diagramme in Vorwärts- und Rückwärtsrichtung für jeden Vektor und gibt an, wann die Komponenten das Lösungsprofil für die ausgewählten Größenausschlusschromatographie-SAXS-Daten starten und verlassen. RAW versucht, die Bereiche zu identifizieren.Verwenden Sie bei Bedarf die Pfeile, um die Bereiche so zu ändern, dass jeder Kreis der Beginn eines Wendepunkts ist, der von oder vom Basisgrund aufsteigt oder fällt, und klicken Sie auf weiter. Um Spitzen zu reduzieren oder zu eliminieren, identifizieren Sie ungefähr, welcher Rahmen der Spitze entspricht, indem Sie die Bereichssteuerungspfeile verwenden, um die Komponentenbereichssteuerelemente anzupassen. Wenn ein Mindest-Chi-Quadrat erreicht wurde, klicken Sie zurück, um eine Validierungsprüfung durchzuführen.Wenn die ursprünglichen EFA-Plots noch gültig aussehen, klicken Sie auf Weiter, und speichern Sie EFA-Daten, um die Diagramme zu speichern. Klicken Sie dann auf Fertig, um das EFA-Fenster zu schließen. Öffnen Sie dann im RAW-Fenster Profile im Plotfenster, um die Kurven anzuzeigen.Klicken Sie auf der Registerkarte Profile des Bedienfelds mit der rechten Maustaste, um die Kurven als DAT-Dateien zu speichern. Öffnen Sie zur SAXS-Ermittlung die Registerkarte Streuungsanalyse, und wählen Sie G aus, um das manuelle Guinier-Analysewerkzeug auszuwählen. Fügen Sie im Diagramm Punkte hinzu oder entfernen Sie sie, sodass die Residuen kein Lächeln oder Stirnrunzeln haben.Die ausgewählten Daten in der Guinier-Anpassung sollten die maximale Warteschlange multipliziert mit dem Kreiselradius von 1,3 nicht überschreiten. Klicken Sie auf normalisierte kratky. Die resultierende Darstellung liefert eine Bewertung des strukturellen Zustands des Makromoleküls, kugelförmig, zylindrisch, ungeordnet, normalisiert für Masse und Konzentration.Klicken Sie auf das Volumen der Korrelation. Die gesamte streute Intensität und ein integrierter Bereich der gesamten Streuintensität als Funktion von Q-Plots erscheinen als Schnelle Referenz für die Validierung der Qualität der Streukurve. Um die Flexibilitätsanalyse zu starten, klicken Sie auf Flexibilität.Jedes Panel im Popup-Fenster zeigt ein Diagramm, das eine Machtrechtsbeziehung ausnutzt, die zwischen den kompakten und den langgestreckten flexiblen Biopolymeren besteht. Verwenden Sie den Schieberegler am unteren Rand des Feldes, um die Ansicht der Daten zu ändern, bis ein Plateau in einem der Diagramme erreicht ist. Klicken Sie unmittelbar nach der Durchführung einer Flexibilitätsanalyse auf Volume.Es wird ein Popup mit drei Diagrammen generiert. Die Porod-Debye-Plot-Diagrammspuren, wo der Schieberegler aus dem Flexibilitätsdiagramm links und zeigt die Plateau-Bereich Daten. Um das Volumen des Partikels zu berechnen, verschieben Sie den Anfangs- und Endpunkt, bis die blaue Linie auf dem Diagramm in den Plateaubereich passt.Für ein unvoreingenommenes Ergebnis sollten die Residuen im Porod-Debye Exponenten-Machtgesetz kein Muster aufweisen. Unter der Registerkarte P von R können die reale Raumverteilung und die Streukurve für die Probe beobachtet werden. Idealerweise sollte die Verteilungskurve ohne Wellen glatt sein und nur sanft die x-Achse berühren.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen und klicken Sie auf DMAX suchen, um ein neues Fenster zu öffnen. Die Grenzwerte für die maximale Dimension sind mit dem vorgeschlagenen maximalen Q-Bereich, den für die Berechnung zu verwendenden maximalen Datenpunkten, den unteren und oberen maximalen Dimensionsgrenzen sowie einem unteren und oberen Alpha-Score voreingestellt. Klicken Sie auf Start.Es wird eine zusammengesetzte Verteilung zusammen mit einer vorgeschlagenen maximalen Dimension und Alphaebene erstellt. Wenn diese Daten akzeptabel sind, schließen Sie das Fenster, um zur Registerkarte P von R zurückzukehren, wo das gegenseitige Leerzeichen nun zugeschnitten wird, um dem vorgeschlagenen maximalen Q-Bereich zu entsprechen. Wählen Sie das Modell "Weitere Modelle" aus, und klicken Sie auf Hintergrund, um die Alphaebene und die maximale Dimension auf die vorgeschlagenen Werte aus dem Popup-Feld festzulegen.Klicken Sie auf Verfeinern. Es wird ein Kreuzvalidierungsdiagramm geöffnet, das anzeigt, ob Punkte wie rot angegeben zurückgewiesen werden mussten. Wenn es nur wenige abgelehnte Punkte gibt und die Verteilung gut aussieht, dann ist das Modell gut.Sie drucken einen Bericht auf der Registerkarte Analyse. Klicken Sie mit der linken Maustaste, um das Beispiel hervorzuheben, und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Beispielnamen. Wählen Sie Bericht aus dem einzelnen Dataset erstellen aus.Es wird ein Textfeld geöffnet, in dem Kommentare möglich sind, und es wird ein PDF-Dokument mit allen generierten Zahlen und Werten erstellt. In dieser repräsentativen Analyse wurde E9 DNA-Polymeraseexonuklease minus Mutant an die DNA gebunden und lief mit Größenausschlusschromatographie Kleinwinkel-Röntgenstreuung. Es wurden zwei Gipfel beobachtet.Der erste große Peak stellt den E9-DNA-Polymeraseexonuklease minus mutierten DNA-Komplex dar. Und die zweite zeigt den ungebundenen Zustand an. Während der klassische Ansatz der Auswahl von Rahmen einen stabilen Kreiselradius des Komplexes in der ersten Spitze bietet, wird der zweite Gipfel klar zusammengeführt und der Kreiselradius über das Diagramm zeigt, dass der zweite Gipfel von Interesse keinen stabilen Kreiselradius aufgrund von Kreuzspitzenkontamination hat.In dieser Analyse konnten nur fünf Rahmen verwendet werden, die einen halbstabilen Kreiselradius zeigten. Wenn sie subtrahiert wurden, gaben sie einen Kreiselradius von 36,3 Angstroms an. Wenn die Spitzen mit EFA dekonvolutiert wurden, wurde die entsprechende Kurve für den zweiten Peak mit dem Original überlagert, was eine deutliche Abnahme des Signals auf das Rauschen und einen niedrigeren Kreiselradius von 34,1 Angstroms zeigte.Ein Kratky-Diagramm der Daten zeigt, dass der Komplex mit dem verworrenen Peak kugeliger ist, wie die PR-Kurve bestätigt, die eine maximale Dimension von 108,5 Angstroms für die dekonvolutierte Kurve ergibt. Die nicht dekonvolutierten Daten für diese Analyse sind mit einer maximalen Dimension von 120 Angstroms gestreckt, wahrscheinlich aufgrund der Heterogenität, die sich aus der ungebundenen E9-Polymerase minus Exonukleasemutant ergibt. Die wichtigsten Schritte sind die Auswahl der Singularwerte und des verwendeten Datenbereichs, da diese die Genauigkeit der Dekonvolution stark beeinflussen.Die Ergebnisse sollten nicht allein genommen, sondern mit zusätzlichen Techniken wie analytischezentrifugation oder Multi-Winkel-Laserlichtstreuung weiter bewertet werden, um ihre biologische Interpretation zu ermöglichen. Inline-Säulengekoppelte SAXS in Kombination mit Dekonvolution und einer benutzerfreundlichen Schnittstelle wie das Programm Scatter bietet ein leistungsstarkes Paket, um aussagekräftige Strukturdaten auch aus an sich schwierigen Systemen bereitzustellen.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 über Microseeding und Zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Forschung

Biochemie

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobe Proteinreinigung und kinetische Analyse über Sauerstoff-Elektrode für das Studium DesB Dioxygenase Aktivität und Hemmung

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Völlig autonom Charakterisierung und Datenerfassung aus Kristallen von biologischen Makromolekülen

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Verwendung der Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline zur Analyse von mikrobiellen Protein- und Spezialisierten Metabolitendaten

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie über den Stoffwechsel von sechs systemischen Insektiziden in einer neu etablierten Zellsuspensionskultur abgeleitet aus Tee (Camellia Sinensis L.) Blätter

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Störende Endothelial Biomechanik über Connexin 43 Strukturelle Störung

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT-Beispielvorbereitung für proteomics Facility Submission und nachfolgende Datenanalyse

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Feste serielle Zieldatenerfassung an der Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Proteomisches Profil von EPS-Urin durch FASP-Verdauung und datenunabhängige Analyse

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...