Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

אנו מכירים בתמיכה הכספית עבור הפרויקט מהמענק הצרפתי REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 ועל ידי מענקי מחקר מהשירות דה סנטה דה ארמה וDélégation Générale לשפוך l'Armement. אנו מודים ל-ESRF על זמן קרן ה-SAXS. עבודה זו השתמשה בפלטפורמות של מרכז גרנובל להנחות-אריק (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) בתוך שותפות גרנובל לביולוגיה מבנית (PSB), הנתמכת על ידי פריזבי (ANR-10-INBS-05-02) ו- GRAL, ממומן בתוך בית הספר לתואר שני של אוניברסיטת גרנובל אלפ (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). תוך-כלית מכך ב-IBS מכירה באינטגרציה במכון המחקר הבינתחומי של גרנובל (IRIG, CEA). אנו מודים ל-Wim P. Burmeister ול-Fr é déric Iseni על התמיכה הכספית והמדעית,ואנחנו גםמודים לד"ר ג'סי הופקינס מ-BioCAT ב-APS על עזרתו ועל פיתוח BioXTAS RAW.

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+SAXS+versatility:+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture,+functional+landscapes,+and+integrative+structural+biology.">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li><li>Gr&#228;wert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+(SAXS).">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li><li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li><li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline.">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li><li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis.">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li><li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberb&#252;hler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III:+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations.">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li><li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).</li><li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding.">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li><li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+(US-SOMO)+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite.">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li><li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering.">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li><li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioXTAS+RAW:+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis.">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li><li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks.">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li><li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers.">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

הוא רצוי לקבל דגימת monodisperse לפני תחילת ניסוי SAXS, אבל במציאות, אוספי נתונים רבים אינם מספקים את זה ויש לשפר על ידי שילוב המדידה עם כרומטוגרפיה מוטבעת – SEC ברוב המקרים. עם זאת, גם המחסור בזמן בין טיהור ורכישת נתונים מונו-דיספרסיות של המדגם אינו מובטח. בדרך כלל, הדבר חל על ניסויים שבהם רכיבים קרובים מדי בגודלם או במאפיינים הפיזיים שלהם כדי להיות מופרדים או נוטים לדינמיקה מהירה. כאן, סיפקנו פרוטוקול המשלב ריקבון ערך יחיד עם ניתוח גורם מתפתח כדי להסיר את ההשפעה של DNAbound E9 exoמינוס מהצורה הלא מאוגדת שלה יצירת פרופיל פיזור monodisperse כי לאחר מכן הצלחנו לנתח עם חבילת SAXS פיזור IV.
SVD עם EFA של נתוני SEC-SAXS הן שיטות רבות עוצמה שפותחו כדי לפענח נתוני SAXS ולשפר את הניתוח, אך יש להם מגבלות. הם דורשים שרעש או סחף בקו הבסיס של מאגר ה- SEC-SAXS נשמר למינימום. הדבר עשוי לכלול שיוויון עמודות נוסף (עדיף להשתמש ביותר מ- 3 אמצעי אחסון של עמודות, בהתאם למאגר) לפני טעינה לדוגמה. עם זאת, השלב הקריטי ביותר הוא הבחירה במספר הערכים הייחודיים ומגוון הנתונים בהם נעשה שימוש, מכיוון שזה ישפיע במידה רבה על הדיוק של ההתפוררות. מסיבה זו אין לקחת את התוצאות בעצמן, אלא לנתח אותם עוד יותר באמצעות טכניקות כגון אולטרה-צנטריפוגציה אנליטית (AUC) או פיזור אור לייזר רב-זוויתי (MALLS) לפרשנות ביולוגית.
Scatter IV היא חבילת תוכנה חדשה, ללא תשלום למחקר ולשימוש תעשייתי עם ממשק משתמש אינטואיטיבי המאפשר אפילו לא מומחים לנתח את הנתונים שלהם. פיזור IV כולל מספר תכונות חדשות המסייעות לשפר את הניתוח של נתוני SEC-SAXS, כגון מפת החום המקושרת להתווה האות, ומאפשרת דיוק רב יותר עם בחירת מסגרות. בניתוח נתונים ראשי, ניתוח Guinier Peak ומזימת האימות הצולבת המשויכת לניתוח P(r) מציעים יכולת פתרון בעיות משולבת בתוכנה.
יש לציין כי תוכניות רבות אחרות יכולות לשמש לניתוח נתונים ראשי; אלה מכילים את אותן תכונות בסיסיות ומתעדכניםגם באופן קבוע כגון חבילת BIOXTAS RAW 17 ATSAS24 ו- US-SOMO15 כדי לבשם כמה.
אך ללא קשר לחבילת SAXS המשמשת לניתוח, המגבלות העיקריות נפוצות: הכנת המדגם, לפני איסוף וניתוח. בדוגמה E9 exoמינוס המוצגת, ברור לראות את השיפור ביחס האות לרעש ועם הפחתה ב- Rg dmax המשויך לדגימה monodisperse. פעולה זו תסייע מאוד לעיבוד נוסף של הנתונים כגון התאמה או מידול עם מבנים ידועים ברזולוציה גבוהה.

מקרומולקולות ביולוגיות קטנות מכדי שניתן לראותן אפילו עם מיקרוסקופי האור הטובים ביותר. השיטות הנוכחיות כדי לקבוע את המבנים שלהם בדרך כלל כרוכים גביש החלבון או מדידות על מספרים עצומים של מולקולות זהות באותו הזמן. בעוד שהקריסטלוגרפיה מספקת מידע ברמה האטומית, היא מייצגת סביבת דגימה מלאכותית, בהתחשב בכך שרוב המקרומולקולות אינן מוצגות בצורה גבישית בתא. במהלך השנים האחרונות מיקרוסקופ קריו-אלקטרונים נמסר מבנים ברזולוציה גבוהה דומה של מקרומולקולות גדולות / תסביכים מקרומולקולריים, אבל למרות הדגימות קרובות יותר למצב פיזיולוגי, הם עדיין קפואים, ולכן לא נייד וסטטי. פיזור קרני רנטגן בזווית ביו-קטנה (BioSAXS) מספק מדידה מבנית של המקרומולקול, בתנאים הרלוונטיים לביולוגיה. מצב זה ניתן לדמיין כצורה תלת-מית-רזולוציה נמוכה הנקבעת בקנה מידה ננומטר ולוכדת את כל המרחב הקונפורמציה של המקרומולקול בפתרון. ניסויי BioSAXS מעריכים ביעילות מצב אוליגומרי, דומיין וסידורים מורכבים, כמוגם גמישות בין תחומים 1,2,3. השיטה מדויקת, בעיקר לא הרסנית ובדרך כלל דורשת רק מינימום של הכנה וזמן מדגם. עם זאת, עבור הפרשנות הטובה ביותר של הנתונים, הדגימות צריך להיות monodisperse. זה מאתגר; מולקולות ביולוגיות רגישות לעתים קרובות לזיהמים, טיהור וצבירה לקויים, למשל מהקפאת הפשרת4. הפיתוח של כרומטוגרפיה מוטבעת ואחריו מדידה מיידית של SAXS מסייעת למתן תופעות אלה. כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל מפרידה בין הדגימות לפי גודל ובכך אינה כוללת את רוב מזהמים וצבירות5,6,7,8,9,10. עם זאת, במקרים מסוימים אפילו SEC-SAXS אינו מספיק כדי לייצר מדגם monodisperse, כי התערובת עשויה להיות מורכבת מרכיבים קרובים מדי בגודל או המאפיינים הפיזיים שלהם או הדינמיקה המהירה שלהם להוביל לשיאים חופפים במעקב UV SEC. במקרים אלה, שלב פירוק מבוסס תוכנה של נתוני SAXS שהושג עלול להוביל לעקומת SAXS אידיאלית שלהרכיב הבודד 5,11,12. כדוגמה, בפרוטוקול סעיף 2, אנו מראים את הניתוח הסטנדרטי של SEC-SAXS של הפולימראז DNA E9 vaccinia exonuclease מינוס (E9 exoמינוס)במתחם עם DNA. Vaccinia מייצג את האורגניזם מודל של Poxviridae, משפחה המכילה מספר פתוגנים, למשל וירוס אבעבועות שחורות אנושי. הפולימראז הוצג לקשור בחוזקה DNA בגישות ביוכימיות, עם המבנה של המתחם נפתר לאחרונה על ידי קריסטלוגרפיה רנטגן13.
רוב מתקני הסינכרון יספקו צינור עיבוד נתונים אוטומטי שיבצע נורמליזציה ואינטגרציה של נתונים בהפקת קבוצה של מסגרות לא מנוי. אבל הגישה המתוארת בכתב יד זה יכולה לשמש גם עם מקור מעבדה בתנאי SEC-SAXS מבוצע. יתר על כן, אוטומציה נוספת עשויה להיות זמינה שתדחה מסגרות שניזוקו בקרינה ותבצע חיסור מאגר14. אנו נראה כיצד לבצע ניתוח נתונים ראשי על נתונים מעובדים מראש ולמזל את הנתונים הזמינים בסעיף 2.
בסעיף 3, אנו מראים כיצד לפענח נתוני SEC-SAXS ולנתח את הקימורים ביעילות. אמנם ישנן מספר שיטות deconvolution כגון deconvolution שיא Gaussian, מיושם בארה"ב-SOMO15 ואת שיטת Guinier אופטימיזציה הסבירות המרבית, מיושם בתוכנה DELA16, אלה בדרך כלל דורשים מודל עבור צורת שיא12. הגודל סופי של פסגות בודדות שאנו חוקרים מאפשר את השימוש בניתוח פקטור מתפתח (EFA), כצורה משופרת של ריקבון ערך יחיד (SVD) כדי לפענח פסגות חופפות, מבלי להסתמך על צורת השיא אופיזור פרופיל 5,11. ניתן למצוא יישום ספציפי ל-SAXS ב- BioXTAS RAW17. EFA שימש לראשונה על נתוני כרומטוגרפיה כאשר נתוני מערך דיודה דו-ממדית אפשרו למטריצות להיווצר מספיגה כנגד זמן השמירה ונתוניאורך גל 18. כאשר EFA מצטיין הוא שהוא מתמקד באופי המתפתח של ערכים ייחודיים, איך הם משתנים עם המראה של רכיבים חדשים, עם האזהרה כי יש סדר טבועברכישה 10. למרבה המזל, נתוני SEC-SAXS מספקים את כל נתוני הרכישה הדרושים מסודרים במערכי נתונים 2D מאורגנים, ומשאילים את עצמם יפה לטכניקה של EFA.
בסעיף 4, אנו נדגים את היסודות של ניתוח SAXS עצמאי מודל מהעקומה SAXS חיסור רקע חיסור. ניתוח עצמאי-מודל קובע את רדיוס הגידול של החלקיקים (Rg), נפח המתאם (Vc), נפח פורוד (סמנכ"ל) ומעריך פורוד-דביי (PE). הניתוח מספק הערכה חצי כמותית של המצב התרמודינמי של החלקיקים במונחים של קומפקטיות או גמישות באמצעות מגרש Kratky ללא ממד2,4,19.
לבסוף, נתוני SAXS נמדדים ביחידות חלל הדדיות ואנחנו נראה כיצד להפוך את נתוני SAXS למרחב אמיתי כדי לשחזר את פונקציית ההפצה של מרחק הזוג, P(r). התפלגות P(r) היא ערך של כל המרחקים שנמצאו בתוך החלקיק וכוללת את הממד המרבי של החלקיקים, dmax. מאחר שזאת מדידה תרמודינמית, התפלגות P(r) מייצגת את המרחב הפיזי הכבוש על ידי המרחב הקונפורמציה של החלקיקים. ניתוח נכון של ערכת נתונים של SAXS יכול לספק תובנות מצב פתרון המשלימות מידע ברזולוציה גבוהה מקריסטלוגרפיה ו- cryo-EM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS היא טכניקה פופולרית המשמשת בביולוגיה מולקולרית ומבנית כדי לקבוע את מבנה הפתרון, גודל החלקיקים והצורה, יחס פני השטח לנפח ושינויים קונפורמיים של מקרומולקולות ותסביכים מקרומולקולריים. ערכת נתונים באיכות גבוהה של SAXS עבור מידול מבני חייבת להיות ממונודיספרס, דגימות הומוגניות, ולעתים קרובות מגיעים אליה רק באמצעות שילוב של כרומטוגרפיה מוטבעת ומדידה מיידית של SAXS. בדרך כלל, כרומטוגרפיה של החרגת גודל משמשת להפרדה בין דגימות ולא לכלול מזהמים וצבירות מהחלקיקים של עניין המאפשר מדידות SAXS להיעשות משיא כרומטוגרפי שנפתר היטב של מין חלבון יחיד. עדיין, במקרים מסוימים, אפילו טיהור מוטבע אינו ערובה של דגימות monodisperse, או בגלל רכיבים מרובים קרובים מדי זה לזה בגודל או שינויים בצורה המושרה באמצעות מחייב לשנות את זמן ההתמהמה נתפס. במקרים אלה, ייתכן שיהיה ניתן לפענח את נתוני SAXS של תערובת כדי להשיג את עקומות SAXS אידיאליות של רכיבים בודדים. כאן, אנו מראים כיצד הדבר מושג והניתוח המעשי של נתוני SEC-SAXS מתבצע בדוגמאות אידיאליות וקשות. באופן ספציפי, אנו מראים את ניתוח SEC-SAXS של הפולימראז ה-DNA E9 vaccinia exonuclease מינוס מוטציה.

היתרון של שימוש deconvolution על בחירתמסגרת קלאסית 13 הוא להסיר את ההשפעה של מינים אחד על השני, לייצר אות פיזור monodisperse. זה גם מלווה לעתים קרובות עם אות טוב יותר יחס רעש. כאשר E9 exoמינוס מאוגד ל-DNA והפעלה באמצעות SEC-SAXS, שתי פסגות נצפו(איור 1). הפסגה הראשונה, הגדולה (כמסגרות 420\u2012475) היא E9exoמינוס -קומפלקס DNA השני (כמסגרות 475\u2012540), המצב הלא מאוגד (ראה נתונים משלימים: איור 2). בעוד הגישה הקלאסית של בחירת מסגרות מספקת Rg יציב של המתחם בשיא הראשון (ראה נתונים משלימים: איור 3),הפסגה השנייה ממוזגת בבירור וה-Rg על פני העלילה מראה כי לשיא השני של עניין אין Rg יציב, בשל זיהום צולב-שיא. רק 5 מסגרות ניתן להשתמש שהראה Rg יציב למחצה, כאשר הפחתה הם נתנו Rg = 36.3 Å(איור 2,ירוק). כאשר הפסגות היו מפותלות באמצעות EFA העקומה המתאימה לשיאהשני (איור 2, כחול) היה מכוסה עם המקורי והראה ירידה ברורה באות לרעש, ו Rg נמוך יותר, 34.1 Å נרשם. העלילה Kratky (איור 3) מראה את המתחם עם הפסגה המפותלת (כחול) הוא יותר כדורי. זה מאושר על ידי עקומת P(r) (איור 4) אשר נותן dמקסימום 108.5 Å עבור העקומה המפותלת (כחול) בעוד שאינו מפותל הוא מוארך יותר עם dמקסימום 120 Å (ירוק), זה ככל הנראה בשל הטרוגניות הנובעת E9 exo לאמאוגד מינוס.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> איור 1: עלילת אותות של E9 exoמינוס לבד ועם DNA מורכב. החלונית העליונה מציגה חלקה של היחס האינטגרלי לרקע עבור כל מסגרת של הפעלת SEC-SAXS (כחול בהיר). הנקודות האדומות מראות את ה-Rg בכל מסגרת מעל הפסגה. הלוח התחתון מציג את מפת החום המתאימה המציגה את שאריות עבור כל מסגרת צבעונית על פי ניתוח מתאם אוטומטי Durbin-Watson, אזורים בעלי דמיון גבוה הם ציאן צבעוני בעוד מסגרות שונות לעקוב אחר כחול כהה לורודים ולבסוף לאדום בהתאם לחומרת הדמיון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> איור 2: עלילת עוצמה לעומת וקטור פיזור. שכבת-על של נתוני SAXS המנופחות יוצרת את ה- E9 exominus . בירוק 5 מסגרות (מסגרת 517\u2012522) בממוצע והוחתר מתוך אזור של Rg יציב למחצה ובכחול עקומת פיזור מייצג נגזר EFA deconvolution של שיא SEC-SAXS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> איור 3: עקומת קראפטקי ללא מימדים. שכבת-על של עקומת Kratky המפותלת (כחול) ולא מסובבת (ירוקה) המציגה את E9 exoמינוס היא כדורית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> איור 4: עקומת P(r). שכבת-על של הקימורים המפותלים (כחול) והקימורים הלא-מפותלים (ירוקים) עבור Exo E9מינוס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
נתונים משלימים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

מדידות SEC-BioSAXS של מקרומולקולות ביולוגיות הן גישה סטנדרטית לקביעת מבנה הפתרון של מקרומולקולות והמתסבינים שלהן. כאן, אנו מנתחים נתוני SEC-BioSAXS משני סוגים של עקבות SEC בדרך כלל - כרומטוגרמות עם פסגות שנפתרו במלואן ונפתרו חלקית. אנו מדגימים את הניתוח ואת ההתפוררות באמצעות פיזור ו- BioXTAS RAW.

ניתוח נתוני SEC-SAXS באמצעות פירוק ופיזור EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

פיזור רנטגן ביולוגי בזווית קטנה מספק מדידות מבניות של קומפלקסים מקרומולקולליים ומאקרומולקולריים. באופן אידיאלי, המדגם שיש למדוד צריך להיות monodispersed. אמנם במקרים מסוימים, גודל הדרת כרומטוגרפיה SAXS אינו מספיק כדי לייצר monodispersity, deconvolution מבוסס תוכנה של נתוני SAXS יכול להתבצע כדי לייצר עקומת SAXS אידיאליזציה.בעקבות פרוטוקול זה, תוכנית deconvolution ואת תוכנית פיזור ידידותי למשתמש ניתן להשתמש כדי לנתח את הנגיף Vaccinia DNA פולימראז מוטציות exominus. כדי לבצע חיסור רקע של נתוני הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל, פתח את תוכנית פיזור 4 המבוססת על Java ופתח את הכרטיסיה SEC. גרור ושחרר את קבצי הנתונים המופחתים לתוך הנתונים הנפתחים שמתחת לחלון ולחץ על לחצן ספריית הפלט ופתיחה כדי להגדיר את ספריית הפלט שבה יישמרו הנתונים.הזן את השם לדוגמה בתיבה שמור בשם ולחץ על מעקב. לחץ על כפתור עריכת הפרטים כדי לערוך את הפרטים הניסיוניים ולמלא את השדות המתאימים. כדי לבחור את מסגרות המאגר באופן ידני, לחץ על הגדר מאגרים.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור כדי לבחור מחדש את המאגר כשטוחה בעקומת המעקב לפני נפח הריק של עמודת הכרומטוגרפיה של אי-הכללת הגודל של כ- 100 מסגרות ולחץ על הגדר מאגר ועדכן כדי לחשב מחדש את קובץ ה- SEC. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור כדי לבחור אזור מעניין בעלילת האות ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני וגרור את הקרוס-שערות בעלילת מפת החום כדי לבחור את הזום ואת קבוצת המשנה של המסגרות שישמשו למיזוג. בלחיצה שמאלית נוספת, סמן את המסגרות במפת החום המתאימה לאזור בפינה השמאלית התחתונה של הכוונת.באופן אידיאלי, המסגרת צריכה להדגיש אזור עם צבע ציאן בעיקר ורדיוס יציב של gyration. כאשר המסגרות שנבחרו מרוצות, לחץ על מזג כדי למזג את המסגרות המחסות ולחץ על הכרטיסיה ניתוח כדי להציג את הנתונים. עבור פירוק הנתונים, טען את ערכת הנתונים בתוכנית deconvolution.בלוח הבקרה תחת קבצים, השתמש בסמל התיקיה כדי לאתר את הנתונים ולסמן את כל קבצי ה- DAT. עלילה של אינטנסיביות משולבת לעומת מספר מסגרת תצויר בעלילה של הסדרה. תחת הכרטיסיה סידרה, לחץ כדי לסמן את העקומה ולפתוח את החלון המוקפץ של ניתוח LC.כדי לבחור אזור מאגר מתאים, לחץ על הוסף אזור כדי לבחור אזור לפני שיא הכרומטוגרמה ואחד אחרי חזית הממס ולחץ על הגדר מאגר. חלונות מוקפצים יציינו שלא נבחרו מסגרות עבור הרקע. כדי להפעיל את EFA, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הקובץ המסומן ובחר EFA מהתפריט.בחלון המוקפץ, יש לראות את פירוק הערך היחיד של ערכת הנתונים. בתיבה פקדים, סמן את ערכי התיבה השתמש בערכי התיבה מסגרות כדי לאשר שכל אזור השיא כדי לבטל את ההתמזגות מכוסה בהתווית העוצמה. עלילת הערכים הייחודיים תראה את עוצמת הערכים הייחודיים שמעל לקו הבסיס.אם הווקטורים הבודדים משמאל ומימין אינם תואמים, שנה את המספר הווקטורי הייחודי המשמעותי לשניים והזז את המסגרות עד שהווקטורים הייחודיים השמאליים והימין דומים. EFA יחושב, יצירת חלקות בכיוונים קדימה ואחורה עבור כל וקטור ומציין מתי הרכיבים להתחיל ולצאת פרופיל הפתרון עבור הנתונים CHROMATOGRAPHY אי הכללת גודל שנבחרו SAXS נתונים. RAW ינסה לזהות את הטווחים.במידת הצורך, השתמש בחצים כדי לשנות את הטווחים כך שכל עיגול הוא ההתחלה של נקודת פיתול, עולה או נופל לקו הבסיס ולחץ על הבא. כדי להקטין או למנוע קוצים, זהה בערך איזו מסגרת תואמת את הקו הדקר באמצעות חצי בקרת הטווח כדי לכוונן את פקדי טווח הרכיבים. לאחר שהושג ריבוע צ'י מינימלי, לחץ על חזרה כדי לבצע בדיקת אימות.אם ההתוויות המקוריות של EFA עדיין נראות חוקיות, לחץ על הבא ושמור נתוני EFA כדי לשמור את ההתוויות. לאחר מכן לחץ על בוצע כדי לסגור את חלון EFA. לאחר מכן, בחלון RAW, פתחו פרופילים בחלונית ההתוויה כדי להציג את העקומות.בכרטיסיה פרופילים של לוח הבקרה, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לשמור את הקימורים כקבצי DAT. לקביעת SAXS, פתחו את לשונית ניתוח פיזור ובחרו G לבחירת כלי הניתוח הידני של Guinier. בעלילה, להוסיף או להסיר נקודות כך השיורי אין חיוך או תכונה זועפת.הנתונים שנבחרו בהתקף Guinier לא יעלה על התור המרבי כפול רדיוס של מגבלת gyration של 1.3. לחץ על Kratky מנורמל. העלילה המתקבלת מספקת הערכה של המצב המבני של המקרומולקולה, כדורית, גלילית, פרועה, מנורמלת למסה וריכוז.לחץ על נפח המתאם. העוצמה המפוזרת הכוללת ושער משולב בעוצמה המפוזרת הכוללת כפונקציה של חלקות Q יופיעו כהפניה מהירה לאימות איכות עקומת ההתפזרות. כדי להתחיל בניתוח הגמישות, לחץ על גמישות.כל פאנל בחלון המוקפץ יראה עלילה המנצלת יחסי דיני כוח הקיימים בין הביופולימרים הקומפקטיים והגמישים המוארכים. השתמש במ המחוון בתחתית התיבה כדי לשנות את תצוגת הנתונים עד להגעה לרמה באחת מההתוויות. מיד לאחר ביצוע ניתוח גמישות, לחץ על עוצמת הקול.ייווצר חלון מוקפץ של שלושה גרפים. העלילה של Porod-Debye עוקבת אחר המקום שבו הושאר המחוון מתווית הגמישות ומראה את נתוני האזור הממוזגים. כדי לחשב את נפח החלקיק, הזז את נקודות ההתחלה והסיום עד שהקו הכחול בחלקה יתאים לאזור הרמה.לתוצאה בלתי משוחדת, השאריות בחוק הכוח המעריך של פורוד-דביי לא צריכות להראות שום דפוס. תחת הכרטיסיה P של R, ניתן לראות את התפלגות החלל האמיתית ואת עקומת פיזור עבור המדגם. באופן אידיאלי, עקומת ההפצה צריכה להיות חלקה ללא גלים וצריך פשוט לגעת בעדינות בציר ה- x.לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם לדוגמה ולחץ על חפש את DMAX כדי לפתוח חלון חדש. המגבלות עבור הממד המרבי מוגדרות מראש עם טווח Q המרבי המוצע, נקודות הנתונים המרביות שישמש לחישוב, מגבלות הממד המרבי התחתון והגבוה וציון אלפא תחתון וגביוני. לחץ על התחל.התפלגות מורכבת תיווצר יחד עם ממד מרבי מוצע ורמה אלפא. אם נתונים אלה קבילים, סגור את החלון כדי לחזור ללשונית P of R שבה ייחיתוך כעת התוויית הרווח ההדדי כדי להתאים לטווח Q המרבי המוצע. בחרו במודל 'עוד' ולחצו על הרקע כדי להגדיר את רמת האלפא והממד המרבי לערכים המוצעים מהתיבה הנפתחת.לחץ על מקד. תתווית אימות צולב תיפתח, ותוצר אם יש לדחות נקודות כלשהן כפי שצוין באדום. אם יש רק כמה נקודות שנדחו וההפצה נראית טוב, אז המודל טוב.תדפיס דוח בכרטיסיה ניתוח. לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסמן את הדוגמה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על השם לדוגמה. בחר צור דוח מערכת הנתונים הבודדת.תיבת טקסט תיפתח כדי לאפשר הפקת הערות ומסמך PDF המציג את כל הנתונים והערכים שנוצרו. בניתוח מייצג זה, E9 DNA פולימראז exonuclease מינוס מוטציה היה קשור ל- DNA ולהפעיל באמצעות גודל הדרת כרומטוגרפיה רנטגן בזווית קטנה פיזור. שתי פסגות נצפו.הפסגה הגדולה הראשונה מייצגת את E9 DNA פולימראז אקסונוקלאז מינוס קומפלקס DNA מוטציה. והשני מציין את המצב הלא מאוגד. בעוד שהגישה הקלאסית של בחירת מסגרות מספקת רדיוס יציב של gyration של המתחם בפסגה הראשונה, הפסגה השנייה ממוזגת בבירור ורדיוס ההתמזגות על פני העלילה מראה כי לשיא השני של העניין אין רדיוס יציב של gyration עקב זיהום חוצה שיא.בניתוח זה, ניתן היה להשתמש רק בחמש מסגרות שהראו רדיוס יציב למחצה של gyration. כאשר הפחיתו, הם נתנו רדיוס של gyration של 36.3 אנגסטרום. כאשר הפסגות היו deconvoluted באמצעות EFA, העקומה המתאימה עבור הפסגה השנייה היה מכוסה עם המקורי, מראה ירידה ברורה באות לרעש ורדיוס נמוך יותר של gyration של 34.1 אנגסטרום.עלילה Kratky של הנתונים מגלה כי המתחם עם השיא המפותל הוא כדורי יותר כפי שאושר על ידי עקומת יחסי ציבור אשר נותן מימד מרבי של 108.5 אנגסטרום עבור העקומה deconvoluted. הנתונים שאינם מנוכרים לניתוח זה מוארכים יותר עם מימד מרבי של 120 אנגסטרום, ככל הנראה בשל ההטרוגניות הנובעת ממוטנט הפולימראז E9 הלא מאוגד מינוס אקסונוקלאז. השלבים הקריטיים ביותר הם בבחירת הערכים הייחודיים וטווח הנתונים המשמשים כנתונים אלה משפיעים מאוד על דיוק הניתוק.אין לקחת את התוצאות בעצמן, אלא להעריך עוד יותר באמצעות טכניקות נוספות כגון צנטריפוגה אנליטית או פיזור אור לייזר רב-זוויתי כדי לאפשר את הפרשנות הביולוגית שלהם. SAXS בשורה בשילוב עם deconvolution וממשק ידידותי למשתמש כמו התוכנית פיזור מספק הוא חבילה רבת עוצמה כדי לספק נתונים מבניים משמעותיים אפילו מערכות קשות במהותו.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

הפקה, התגבשות וקביעת מבנה<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 באמצעות Microseeding ואבץ-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

חלבון אנאירובית טיהור וניתוח קינטי באמצעות אלקטרודה חמצן ללמוד DesB Dioxygenase פעילות וניגוד

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

איסוף נתונים מקריסטלים של מקרומולקולות ביולוגיות ואפיון עצמאית לחלוטין

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

באמצעות מקור פתוח MALDI תוף-MS IDBac הניתוח של חלבון מיקרוביאלית ונתונים מיוחדים מטבוליט

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

מחקר על חילוף החומרים של שישה קוטלי חרקים מערכתית החדש הוקמה התא תרבות ההשעיה נגזר תה (Camellia Sinensis L.) עלים

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Perturbing אנדותל ביומכניקה דרך קונשין 43 מבנית שיבוש

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

איסוף נתונים טוריים של יעד קבוע במקור אור יהלום

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

פרופיל פרוטאומי של EPS-שתן באמצעות עיכול FASP וניתוח נתונים עצמאיים

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...