Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
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Riconosciamo il sostegno finanziario al progetto da parte della sovvenzione francese REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 e da sovvenzioni alla ricerca del Service de Santé des Armées e della Délégation Générale pour l'Armement. Siamo grati all'ESRF per il tempo del fascio SAXS. Questo lavoro utilizzava le piattaforme del centro Grenoble Instruct-ERIC (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) nell'ambito del Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), sostenuto da FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) e GRAL, finanziato nell'ambito della scuola di specializzazione Dell'Università Grenoble Alpes (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS riconosce l'integrazione nell'Istituto di Ricerca Interdisciplinare di Grenoble (IRIG, CEA). Ringraziamo Wim P. Burmeister e P é déric Iseni per il supporto finanziario e scientifico e ringraziamo anche il Dr. Jesse Hopkins di BioCAT presso l'APS per il suo aiutoeper lo sviluppo di BioXTAS RAW.

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E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Si desidera avere un campione monodisperso prima di iniziare un esperimento SAXS, ma in realtà molte raccolte di dati non soddisfano questo e devono essere migliorate combinando la misurazione con la cromatografia in linea - SEC nella maggior parte dei casi. Tuttavia, anche la mancanza di tempo tra la purificazione e la monodispersità di acquisizione dei dati del campione non è garantita. Più comunemente, questo vale per gli esperimenti in cui i componenti sono di dimensioni troppo vicine o nelle loro proprietà fisiche per essere separati o sono inclini a dinamiche veloci. Qui, abbiamo fornito un protocollo che combina la decomposizione di un singolo valore con l'analisi dei fattori in evoluzione per rimuovere l'influenza di DNAbound E9 exominus dalla sua forma non legata creando un profilo di scattering monodisperso che siamo stati quindi in grado di analizzare con il pacchetto SAXS Scatter IV.
SVD con EFA di dati SEC-SAXS sono metodi molto potenti sviluppati per deconvolutare i dati SAXS e migliorare l'analisi, ma hanno dei limiti. Richiedono che il rumore o la deriva nella linea di base tampone del SEC-SAXS sia mantenuta al minimo. Ciò può comportare un'ulteriore equilibrazione delle colonne (meglio usare più di 3 volumi di colonna, a seconda del buffer) prima del caricamento del campione. Tuttavia, il passaggio più critico è la scelta del numero dei valori singolari e dell'intervallo di dati utilizzati, in quanto ciò influenzerà notevolmente l'accuratezza della deconvoluzione. È per questo motivo che i risultati non dovrebbero essere presi da soli, ma ulteriormente analizzati utilizzando tecniche come l'ultracentrifugazione analitica (AUC) o la diffusione multi-angolo-laser-luce (MALLS) per l'interpretazione biologica.
Scatter IV è un nuovo pacchetto software, gratuito per la ricerca e l'uso industriale con un'interfaccia utente intuitiva che consente anche ai non esperti di analizzare i propri dati. Scatter IV ha diverse nuove funzionalità che aiutano a migliorare l'analisi dei dati SEC-SAXS, come la mappa termica collegata al grafico del segnale, consentendo una maggiore precisione con la scelta della selezione del fotogramma. Nell'analisi dei dati primari, l'analisi Guinier Peak e il grafico di convalida incrociata associato all'analisi P(r) offrono una capacità di risoluzione dei problemi integrata nel software.
Va detto che molti altri programmi possono essere utilizzati per l'analisi dei dati primari; questi contengono le stesse caratteristiche di base e vengono aggiornati regolarmente come BioXTAS RAW17 ATSASpacchetto 24 e US-SOMO15 per citane alcuni.
Ma indipendentemente dal pacchetto SAXS utilizzato per l'analisi, le principali limitazioni sono comuni: la preparazione del campione, prima della raccolta e dell'analisi. Nell'esempio E9 exominus mostrato, è chiaro vedere il miglioramento del rapporto segnale/rumore e con una riduzione del Rg il dmax associato a un campione di monodisperso. Ciò contribuirà notevolmente all'ulteriore elaborazione dei dati, come l'installazione o la modellazione con strutture note ad alta risoluzione.

Le macromolecole biologiche sono troppo piccole per essere viste anche con i migliori microscopi a luce. I metodi attuali per determinare le loro strutture generalmente comportano la cristallizzazione della proteina o misurazioni su un gran numero di molecole identiche allo stesso tempo. Mentre la cristallografia fornisce informazioni a livello atomico, rappresenta un ambiente campione artificiale, dato che la maggior parte delle macromolecole non sono presentate in una forma cristallina nella cellula. Negli ultimi due anni la microscopia crioelet elettronica ha fornito strutture simili ad alta risoluzione di grandi macromolecole / complessi macromolecolari, ma sebbene i campioni siano più vicini alle condizioni fisiologiche, sono ancora congelati, quindi immobili e statici. Lo scattering a raggi X ad angolo bio-piccolo (BioSAXS) fornisce una misurazione strutturale della macromolecola, in condizioni rilevanti per la biologia. Questo stato può essere visualizzato come una forma 3D a bassa risoluzione determinata su scala nanometrica e cattura l'intero spazio conformazionale della macromolecola in soluzione. Gli esperimenti BioSAXS valutano in modo efficiente lo stato oligomerico, il dominio e le disposizioni complesse, nonchéla flessibilità tra i domini 1,2,3. Il metodo è accurato, per lo più non distruttivo e di solito richiede solo un minimo di preparazione e tempo del campione. Tuttavia, per la migliore interpretazione dei dati, i campioni devono essere monodispersi. Questo è impegnativo; le molecole biologiche sono spesso suscettibili a contaminazioni, scarsa purificazione e aggregazione, ad esempio dal congelamento scongelamento4. Lo sviluppo della cromatografia in linea seguito dalla misurazione immediata del SAXS aiuta a mitigare questi effetti. La cromatografia ad esclusione di dimensioni separa i campioni per dimensione, escludendo così la maggior parte dei contaminanti e delle aggregazioni5,6,7,8,9,10. Tuttavia, in alcuni casi anche SEC-SAXS non è sufficiente per produrre un campione monodisperso, perché la miscela può consistere in componenti di dimensioni troppo vicine o le loro proprietà fisiche o la loro dinamica veloce portano a picchi sovrapposti nella traccia UV SEC. In questi casi, una fase di deconvoluzione basata su software dei dati SAXS ottenuti potrebbe portare a una curva SAXS idealizzatadel singolo componente 5,11,12. Ad esempio, nella sezione 2 del protocollo, mostriamo l'analisi SEC-SAXS standard dell'esonucleasi della DNA polimerasi vaccinia E9 meno mutante (E9 exomeno) in complesso con DNA. Vaccinia rappresenta l'organismo modello dei Poxviridae, una famiglia contenente diversi agenti patogeni, ad esempio il virus del vaiolo umano. È stato dimostrato che la polimerasi si lega strettamente al DNA negli approcci biochimici, con la struttura del complesso recentemente risolta dalla cristallografia a raggi X13.
La maggior parte delle strutture di sincrotrone fornirà una pipeline di elaborazione dati automatizzata che eseguirà la normalizzazione e l'integrazione dei dati producendo un set di frame non subtratti. Ma l'approccio descritto in questo manoscritto potrebbe anche essere usato con una fonte di laboratorio a condizione che SEC-SAXS venga eseguito. Inoltre, potrebbe essere disponibile un'automazione aggiuntiva che respingerà i fotogrammi danneggiati dalle radiazioni ed eseguirà la sottrazionetampone 14. Mostreremo come eseguire l'analisi dei dati primari sui dati pre-elaborati e sfruttare al meglio i dati disponibili nella sezione 2.
Nella sezione 3, mostriamo come deconvolutare i dati SEC-SAXS e analizzare le curve in modo efficiente. Mentre ci sono diversi metodi di deconvoluzione come la deconvoluzione del picco gaussiano, implementata in US-SOMO15 e il metodo di massima verosimiglianza ottimizzato Guinier, implementato nel software DELA16, questi generalmente richiedono un modello per la forma dipicco 12. La dimensione finita dei singoli picchi che stiamo studiando consente l'uso dell'analisi dei fattori in evoluzione (EFA), come forma migliorata di decomposizione del valore singolare (SVD) per deconvolgere i picchi sovrapposti, senza fare affidamento sulla forma del picco o sul profilo didispersione 5,11. Un'implementazione specifica di SAXS è disponibile in BioXTAS RAW17. L'EFA è stato utilizzato per la prima volta sui dati della cromatografia quando i dati dell'array di diodi 2D hanno permesso di formare matrici dall'assorbanza contro i dati del tempo di conservazione e della lunghezzad'onda 18. Dove L'EFA eccelle è che si concentra sul carattere in evoluzione dei valori singolari, su come cambiano con l'aspetto di nuovi componenti, con l'avvertenza che c'è un ordine intrinseco nell'acquisizione10. Fortunatamente, i dati SEC-SAXS forniscono tutti i dati di acquisizione ordinati necessari in array di dati 2D organizzati, prestandosi bene alla tecnica EFA.
Nella sezione 4, dimostreremo le basi dell'analisi SAXS indipendente dal modello dalla curva SAXS sottratta in background buffer. L'analisi indipendente dal modello determina il raggio di rotazione della particella (Rg), il volume di correlazione (Vc), il volume di Porod (Vp) e l'esponente porod-debye (PE). L'analisi fornisce una valutazione semi-quantitativa dello stato termodinamico della particella in termini di compattezza o flessibilità attraverso il grafico di Kratkyadimensionale 2,4,19.
Infine, i dati SAXS sono misurati in unità spaziali reciproche e mostreremo come trasformare i dati SAXS nello spazio reale per recuperare la funzione di distribuzione pair-distance, P(r). La distribuzione P(r) è l'insieme di tutte le distanze trovate all'interno della particella e include la dimensione massima della particella, dmax. Poiché si tratta di una misura termodinamica, la distribuzione P(r) rappresenta lo spazio fisico occupato dallo spazio conformazionale delle particelle. Un'analisi corretta di un set di dati SAXS può fornire informazioni sullo stato della soluzione che integrano le informazioni ad alta risoluzione dalla cristallografia e dalla crio-EM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS è una tecnica popolare utilizzata in biologia molecolare e strutturale per determinare la struttura della soluzione, la dimensione e la forma delle particelle, il rapporto superficie-volume e i cambiamenti conformazionali delle macromolecole e dei complessi macromolecolari. Un set di dati SAXS di alta qualità per la modellazione strutturale deve essere da campioni monodispersi e omogenei e questo è spesso raggiunto solo da una combinazione di cromatografia in linea e misurazione immediata saxs. Più comunemente, la cromatografia ad esclusione di dimensioni viene utilizzata per separare campioni ed escludere contaminanti e aggregazioni dalla particella di interesse permettendo alle misurazioni SAXS di essere effettuate da un picco cromatografico ben risolto di una singola specie proteica. Tuttavia, in alcuni casi, anche la purificazione in linea non è una garanzia di campioni monodispersi, sia perché più componenti sono troppo vicini l'uno all'altro per dimensioni o cambiamenti di forma indotti attraverso il legame alterano il tempo di eluizione percepito. In questi casi, può essere possibile deconvolutare i dati SAXS di una miscela per ottenere le curve SAXS idealizzate dei singoli componenti. Qui, mostriamo come ciò viene raggiunto e l'analisi pratica dei dati SEC-SAXS viene eseguita su campioni ideali e difficili. Nello specifico, mostriamo l'analisi SEC-SAXS dell'esonucleasi della DNA polimerasi vaccinia E9 meno mutante.

Il vantaggio di usare la deconvoluzione rispetto alla classica selezionedei fotogrammi 13 è quello di rimuovere l'influenza delle specie l'una sull'altra, producendo un segnale di dispersione monodisperso. Questo è anche spesso seguito con un migliore rapporto segnale/rumore. Quando E9 exominus è legato al DNA ed eseguito utilizzando SEC-SAXS, si osservano due picchi (Figura 1). Il primo, grande picco (circa fotogrammi 420\u2012475) è il complesso E9 exomeno-DNA il secondo (circa fotogrammi 475\u2012540), lo stato non associato (vedi Dati supplementari: Figura 2). Mentre l'approccio classico della selezione dei fotogrammi fornisce un Rg stabile del complesso nel primo picco (vedi Dati supplementari: Figura 3), il secondo picco è chiaramente unito e il Rg attraverso la trama mostra che il secondo picco di interesse non ha un Rg stabile, a causa della contaminazione cross-peak. Solo 5 fotogrammi potevano essere usati che mostravano un Rg semi-stabile, quando sottratti davano un Rg = 36.3 Å (Figura 2, verde). Quando i picchi sono stati deconvoluti usando l'EFA, la curva corrispondente per il secondo picco(Figura 2, blu) è stata sovrapposta all'originale e ha mostrato una chiara diminuzione del segnale al rumore, ed è stato registrato un Rg inferiore, 34.1 Å. La trama di Kratky (Figura 3) mostra che il complesso con il picco deconvoluto (blu) è più globulare. Ciò è confermato dalla curva P(r) (Figura 4) che dà un dmax 108.5 Å per la curva decontorta (blu) mentre il non deconvoluto è più allungato con un dmax 120 Å (verde), questo è molto probabilmente dovuto all'eterogeneità derivante dall'exo non legato E9meno.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> Figura 1: Grafico del segnale di E9 exominus da solo e con DNA in complesso. Il pannello superiore mostra un grafico del rapporto integrale con lo sfondo per ogni fotogramma di una corsa SEC-SAXS (azzurro). I punti rossi mostrano il Rg ad ogni fotogramma sopra il picco. Il pannello inferiore mostra la mappa termica corrispondente che mostra i residui per ogni fotogramma colorato secondo l'analisi di autocorrelazione Durbin-Watson, le regioni ad alta somiglianza sono colorate ciano mentre i fotogrammi dissimili seguono il blu più scuro ai rosa e infine al rosso a seconda della gravità della dissimilarità. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> Figura 2: Grafico dell'intensità rispetto al vettore di dispersione. Una sovrapposizione dei dati SAXS sottratti forma l'eso esoE9 meno . In verde 5 fotogrammi (fotogramma 517\u2012522) mediati e sottratti da un'area di Rg semi-stabile e in blu la curva di scattering rappresentativa derivata dalla deconvoluzione EFA del picco SEC-SAXS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> Figura 3: Curva di Kratky adimensionata. La sovrapposizione della curva kratky deconvoluta (blu) e non deconvoluta (verde) che mostra E9 exominus è globulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> Figura 4: Curva P(r). Sovrapposizione delle curve deconvoluta (blu) e non deconvoluta (verde) per l'exo E9meno. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
Dati supplementari. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Clicca qui per scaricare questo file</a>

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Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Le misurazioni SEC-BioSAXS delle macromolecole biologiche sono un approccio standard per determinare la struttura della soluzione delle macromolecole e dei loro complessi. Qui analizziamo i dati SEC-BioSAXS da due tipi di tracce SEC comunemente incontrate: cromatogrammi con picchi completamente risolti e parzialmente risolti. Dimostriamo l'analisi e la deconvoluzione utilizzando scatter e BioXTAS RAW.

Analisi dei dati SEC-SAXS tramite deconvoluzione EFA e Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Lo scattering biologico a raggi X ad angolo ridotto fornisce misurazioni strutturali di complessi macromolecolari e macromolecolari. Idealmente, il campione da misurare deve essere monodisperso. Sebbene in alcuni casi, la cromatografia ad esclusione di dimensioni SAXS non sia sufficiente a produrre monodispersità, una deconvoluzione basata su software dei dati SAXS può essere eseguita per produrre una curva SAXS idealizzata.Seguendo questo protocollo, un programma di deconvoluzione e il programma Scatter user-friendly possono essere utilizzati per analizzare il virus Vaccinia DNA polimerasi exominus mutanti. Per eseguire una sottrazione in background dei dati di cromatografia di esclusione delle dimensioni, aprite il programma Scatter 4 basato su Java e aprite la scheda SEC. Trascinare i file di dati ridotti nei dati di rilascio sotto la finestra e fare clic sul pulsante della directory di output e aprire per impostare la directory di output in cui verranno salvati i dati.Immettere il nome di esempio nella casella Salva con nome e fare clic su traccia. Clicca sul pulsante modifica dettagli per modificare i dettagli sperimentali e compilare i campi appropriati. Per selezionare manualmente i frame del buffer, fare clic su imposta buffer.Fate clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinate per riselezionare il buffer come piatto sulla curva di traccia prima del volume vuoto della colonna cromatografica di esclusione delle dimensioni di circa 100 fotogrammi e fate clic su imposta buffer e aggiorna per ricalcolare il file SEC. Fate clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinate per selezionare una regione di interesse nel tracciato del segnale e fate clic con il pulsante sinistro del mouse e trascinate i mitrai nel grafico della mappa termica per selezionare lo zoom e il sottoinsieme di fotogrammi che verranno utilizzati per l'unione. Con un altro clic con il pulsante sinistro del mouse, evidenziare i fotogrammi nella mappa termica corrispondente all'area in basso a destra dei mirino.Idealmente, il telaio dovrebbe evidenziare una regione con un colore prevalentemente ciano e un raggio stabile di rotazione. Se soddisfatti dei fotogrammi selezionati, fate clic su unisci (Merge) per unire i fotogrammi sottratti e fate clic sulla scheda analisi per visualizzare i dati. Per la deconvoluzione dei dati, caricare il set di dati nel programma di deconvoluzione.Nel Pannello di controllo sotto i file, usate il simbolo della cartella per individuare i dati ed evidenziare tutti i file DAT. Un grafico di intensità integrata rispetto al numero di fotogramma verrà disegnato nella trama della serie. Nella scheda serie fare clic per evidenziare la curva e aprire la finestra popup analisi LC.Per selezionare una regione cuscinetto adatta, fare clic su aggiungi area per selezionare un'area prima del picco del cromatogramma e una dopo il fronte solvente e fare clic su imposta buffer. Le finestre popup indicheranno che i fotogrammi non sono stati selezionati per lo sfondo. Per avviare l'EFA, fare clic con il pulsante destro del mouse sul file evidenziato e scegliere EFA dal menu.Nella finestra popup, è necessario osservare la scomposizione del singolo valore del set di dati. Nella casella controlli, selezionare i valori della casella Usa fotogrammi per confermare che l'intera area di picco da deconvolutare è coperta nel tracciato di intensità. Il grafico dei valori singolari mostrerà l'intensità dei valori singolari al di sopra della linea di base.Se i singoli vettori sinistro e destro non corrispondono, modificare il numero vettoriale singolare significativo in due e spostare i fotogrammi fino a quando i vettori singolari sinistro e destro sono simili. Verrà calcolato l'EFA, generando grafici nelle direzioni avanti e indietro per ogni vettore e indicando quando i componenti iniziano e escono dal profilo della soluzione per i dati SAXS di esclusione delle dimensioni selezionati. RAW tenterà di identificare gli intervalli.Se necessario, usate le frecce per modificare gli intervalli in modo che ogni cerchio sia l'inizio di un punto di flessione, salendo o scendendo alla linea di base e fate clic su Avanti. Per ridurre o eliminare i picchi, identificare approssimativamente quale fotogramma corrisponde al picco utilizzando le frecce di controllo dell'intervallo per regolare i controlli dell'intervallo di componenti. Una volta ottenuto un quadrato Chi minimo, fare clic indietro per eseguire un controllo di convalida.Se i grafici EFA originali sembrano ancora validi, fare clic su avanti e salvare i dati dell'EFA per salvare i grafici. Quindi fare clic su Fatto per chiudere la finestra EFA. Quindi, nella finestra RAW, aprite i profili nel pannello tracciato per visualizzare le curve.Nella scheda profili del Pannello di controllo fare clic con il pulsante destro del mouse per salvare le curve come file DAT. Per la determinazione SAXS, aprite la scheda di analisi della dispersione e selezionate G per selezionare lo strumento manuale di analisi Guinier. Nella trama, aggiungere o rimuovere punti in modo che i residui non abbiano un sorriso o una caratteristica accigliata.I dati selezionati nell'adattamento di Guinier non devono superare la coda massima moltiplicata per raggio del limite di rotazione di 1,3. Fare clic su Kratky normalizzato. La trama risultante fornisce una valutazione dello stato strutturale della macromolecola, globulare, cilindrica, disordinata, normalizzata per massa e concentrazione.Fare clic sul volume della correlazione. L'intensità totale dispersa e un'area integrata dell'intensità totale diffusa in funzione dei grafici Q appariranno come un rapido riferimento per convalidare la qualità della curva di dispersione. Per avviare l'analisi della flessibilità, fare clic su flessibilità.Ogni pannello nella finestra popup mostrerà un grafico che sfrutta una relazione di legge di potenza che esiste tra i biopolimeri flessibili compatti e allungati. Usa il dispositivo di scorrimento nella parte inferiore della casella per modificare la vista dei dati fino a raggiungere un plateau in uno dei grafici. Immediatamente dopo aver eseguito un'analisi della flessibilità, fare clic sul volume.Verrà generato un popup di tre grafici. Il tracciato Porod-Debye traccia dove è stato lasciato il cursore del grafico di flessibilità e mostra i dati dell'area plateau. Per calcolare il volume della particella, spostare i punti iniziale e finale fino a quando la linea blu sul tracciato non si adatta alla regione stabilizzata.Per un risultato imparziale, i residui nella legge di potenza degli esponenti di Porod-Debye non dovrebbero mostrare alcun modello. Sotto la scheda P di R, si possono osservare la distribuzione dello spazio reale e la curva di dispersione per il campione. Idealmente, la curva di distribuzione dovrebbe essere liscia senza onde e dovrebbe semplicemente toccare delicatamente l'asse x.Fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'esempio e scegliere trova DMAX per aprire una nuova finestra. I limiti per la dimensione massima sono preimpostati con l'intervallo Q massimo suggerito, i punti dati massimi da utilizzare per il calcolo, i limiti di dimensione massima inferiore e superiore e un punteggio alfa inferiore e superiore. Fare clic sul pulsante Start.Verrà creata una distribuzione composita insieme a una dimensione massima e a un livello alfa suggeriti. Se questi dati sono accettabili, chiudere la finestra per tornare alla scheda P di R in cui verrà ritagliato il tracciato di spazio reciproco in modo che corrisponda all'intervallo Q massimo suggerito. Selezionate più modello e fate clic su sfondo per impostare il livello alfa e la quota massima sui valori suggeriti dalla casella popup.Fate clic su perfeziona (Refine). Si aprirà un grafico di convalida incrociata, che mostra se alcuni punti devono essere rifiutati come indicato in rosso. Se ci sono solo pochi punti rifiutati e la distribuzione sembra buona, allora il modello è buono.Verrà stampato un report nella scheda analisi. Fare clic con il pulsante sinistro del mouse per evidenziare l'esempio e fare clic con il pulsante destro del mouse sul nome dell'esempio. Selezionare Crea report dal singolo set di dati.Si aprirà una casella di testo per consentire commenti e verrà prodotto un documento PDF che mostra tutte le cifre e i valori generati. In questa analisi rappresentativa, l'esonucleasi della DNA polimerasi E9 meno mutante era legata al DNA ed eseguita usando la cromatografia ad esclusione di dimensioni a raggi X ad angolo ridotto. Sono stati osservati due picchi.Il primo grande picco rappresenta l'esonucleasi della DNA polimerasi E9 meno il complesso del DNA mutante. E il secondo indica lo stato non associato. Mentre l'approccio classico della selezione dei fotogrammi fornisce un raggio stabile di rotazione del complesso nel primo picco, il secondo picco è chiaramente unito e il raggio di rotazione attraverso la trama mostra che il secondo picco di interesse non ha un raggio stabile di rotazione a causa della contaminazione da picco incrociato.In questa analisi, potevano essere utilizzati solo cinque fotogrammi che mostravano un raggio semi-stabile di rotazione. Quando sono stati sottratti, hanno dato un raggio di rotazione di 36,3 angstrom. Quando i picchi sono stati deconvoluti usando l'EFA, la curva corrispondente per il secondo picco è stata sovrapposta all'originale, mostrando una chiara diminuzione del segnale al rumore e un raggio inferiore di rotazione di 34,1 angstrom.Un grafico di Kratky dei dati rivela che il complesso con il picco contorto è più globulare come confermato dalla curva PR che dà una dimensione massima di 108,5 angstrom per la curva decontorta. I dati non deconvoluti per questa analisi sono più allungati con una dimensione massima di 120 angstrom, molto probabilmente a causa dell'eterogeneità derivante dalla polimerasi E9 non vincolata meno mutante esonucleasi. I passaggi più critici sono nella selezione dei valori singolari e dell'intervallo di dati utilizzati in quanto questi influenzano notevolmente l'accuratezza della deconvoluzione.I risultati non dovrebbero essere presi da soli, ma ulteriormente valutati utilizzando tecniche aggiuntive come la centrifugazione analitica o la diffusione della luce laser multiangolare per consentirne l'interpretazione biologica. Saxs accoppiato a colonne in linea in combinazione con la deconvoluzione e un'interfaccia intuitiva come il programma fornito da Scatter è un pacchetto potente per fornire dati strutturali significativi anche da sistemi intrinsecamente difficili.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

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Produzione, Cristallizzazione e struttura Determinazione<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 tramite Microseeding e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Ricerca

Biochimica

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificazione della proteina anaerobica e analisi cinetica tramite elettrodo di ossigeno per lo studio di inibizione e attività di Dioxygenase di Giuroma90

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Raccolta di dati dai cristalli delle macromolecole biologiche e completamente autonoma caratterizzazione

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Utilizzo della pipeline OPEN-Source MALDI TOF-MS IDBac per l'analisi dei dati sulle proteine microbiche e sui metaboliti specializzati

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studio sul metabolismo di sei insetticidi sistemici in una nuova coltura di sospensione cellulare derivata dal tè (Camellia Sinensis L.) plurale di "leaf"

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Biomeccanica edonteliale perturbatrice tramite Connexin 43 Disgregazione strutturale

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Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

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Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

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