Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
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我々は、フランスの助成金REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014からのプロジェクトに対する財政的支援と、サンテ・デ・アルメサービスとデレギュレーション・ジェネラルからの研究助成金による資金援助を認める。SAXSビームタイムに対してESRFに感謝しています。この作品はグルノーブル・コンストラクテリックセンター(ISBG;)UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL)は、FRISBI(ANR-10-INBS-05-02)とGRALが支援する構造生物学のためのグルノーブルパートナーシップ(PSB)内で、グルノーブル・アルプ大学大学院(エコールズ大学デ・レシェルシュ)CBH-EUR-GS(ANR-17-EU-000)内で資金を調達しました。IBSは、グルノーブル学際研究所(CEA)への統合を認めています。Wim P. Burmeister と Frééric Iseni の財政的および科学的なサポートに感謝し、また、APS の BioCAT のジェシー・ホプキンス博士の助けと BioXTAS RAW の開発に感謝します。

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+SAXS+versatility:+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture,+functional+landscapes,+and+integrative+structural+biology.">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li><li>Gr&#228;wert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+(SAXS).">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li><li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li><li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline.">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li><li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis.">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li><li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberb&#252;hler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III:+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations.">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li><li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).</li><li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding.">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li><li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+(US-SOMO)+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite.">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li><li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering.">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li><li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioXTAS+RAW:+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis.">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li><li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks.">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li><li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers.">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

SAXS実験を開始する前に単分散サンプルを使用することが望まれますが、実際には多くのデータ収集はこれを満たしておらず、測定とインラインクロマトグラフィー(ほとんどの場合はSEC)を組み合わせることで改善する必要があります。しかしながら、サンプルの精製とデータ取得の一分散との間の時間の不足さえも保証されない。最も一般的には、コンポーネントのサイズが近すぎるか、物理的な特性が分離できないか、または高速ダイナミクスが発生しやすい実験に当てはまります。ここでは、単一値分解と進化因子分析を組み合わせたプロトコルを提供し、非連結E9 exoマイナス の影響を非連結形状から取り除き、SAXSパッケージScatter IVで分析することができた単分散散乱プロファイルを作成しました。
SEC-SAXSデータのEFAを搭載したSVDは、SAXSデータをデコンボルテし、分析を改善するために開発された非常に強力な方法ですが、制限があります。SEC-SAXSのバッファベースラインのノイズまたはドリフトを最小限に抑える必要があります。これは、サンプルの読み込み前に余分な列の平衡化を伴う(バッファーに応じて、3 列のボリュームを使用する方が良い) 場合があります。しかし、最も重要なステップは、単数の値の数と使用されるデータの範囲の選択であり、これは畳み込みの精度に大きな影響を与えます。そのため、結果は単独で取るのではなく、生物学的解釈のために分析的超遠心(AUC)や多角レーザー光散乱(MALLS)などの技術を用いてさらに分析すべきである。
Scatter IVは、研究や産業用に無料で、専門家以外でもデータを分析できる直感的なユーザーインターフェイスを備えた新しいソフトウェアパッケージです。スキャッタIVには、信号プロットにリンクされたヒートマップなど、SEC-SAXSデータの分析を改善するのに役立ついくつかの新機能があり、フレーム選択の選択により精度が向上します。一次データ分析では、P(r) 解析に関連する Guinier Peak 分析とクロス検証プロットにより、ソフトウェアに統合されたトラブルシューティング機能が提供されます。
他の多くのプログラムをプライマリデータ分析に使用できることは言及する必要があります。これらは、同じ基本的な機能を含み、また、いくつかの名前を挙げ、BioXTAS RAW17 ATSASパッケージ24 とUS-SOMO15 などの定期的に更新されます。
しかし、どの SAXS パッケージを分析に使用するかに関係なく、主な制限事項は一般的です: サンプルの準備、収集および分析の前に。図示したE9 exoマイナス 例では、信号対雑音比の改善と、単分散試料に関連するdmax のRgの減少を見ることが明らかである。これにより、既知の高解像度構造を使用して、データのフィッティングやモデリングなどのデータの処理をさらに促進できます。

生体高分子は、最もよい光学顕微鏡でも見るには小さすぎます。それらの構造を決定する現在の方法は、一般的にタンパク質を結晶化するか、同時に同一分子の膨大な数の測定を含みます。結晶学は原子レベルに関する情報を提供するが、ほとんどの高分子が細胞内の結晶形で提示されないことを考えると、人工的なサンプル環境を表す。ここ数年、クライオ電子顕微鏡は、大きな高分子/高分子錯体の同様の高解像度構造を提供したが、サンプルは生理学的状態に近いが、依然として凍結し、したがって不動で静的である。バイオ・小角X線散乱(BioSAXS)は、生物学に関連する条件で、高分子の構造測定を提供します。この状態は、ナノメートルスケールで決定された低解像度の3次元形状として視覚化でき、高分子の立体構造空間全体を溶液中に捉えることができます。BioSAXS実験は、オリゴマー状態、ドメインおよび複雑な配置、ならびにドメイン1、2、3間の柔軟性を効率的に評価する。この方法は正確で、ほとんどが非破壊的であり、通常は最小限のサンプル調製と時間しか必要としない。しかし、データを最もよく解釈するには、サンプルを単分散にする必要があります。これは難しいことです。生体分子は、汚染の影響を受けやすい、精製不良および凝集性、例えば凍結解凍4.インラインクロマトグラフィーの開発と SAXS 測定の即時測定により、これらの効果を軽減できます。サイズ排除クロマトグラフィーはサンプルをサイズによって分離するため、ほとんどの汚染物質と凝集体を除外します5,6,7,8,9,10.しかし、場合によっては、SEC-SAXSでさえ、単分散サンプルを生成するのに十分でない場合があり、混合物はサイズが近すぎる成分またはその物理的性質またはそれらの高速ダイナミクスがSEC UVトレースのピークを重ねることにつながる可能性があるためです。これらの場合、取得したSAXSデータのソフトウェアベースのデコンボリューションステップは、個々のコンポーネント5、11、12の理想化されたSAXS曲線につながる可能性があります。一例として、プロトコルセクション2において、DNAとの複合体におけるワクシニアE9DNAポリメラーゼエキソヌクレアーゼ-変異体(E9exoマイナス)の標準的なSEC-SAXS分析を示す。ワクシニアは、ポクスウイルス科のモデル生物を表し、いくつかの病原体、例えばヒト天然痘ウイルスを含むファミリーである。ポリメラーゼは生化学的アプローチでDNAと緊密に結合することが示され、この複合体の構造は最近X線結晶学13によって解された。
ほとんどのシンクロトロン施設は、データの正規化と統合を行い、一連の減算されていないフレームを生成する自動化されたデータ処理パイプラインを提供します。しかし、この原稿に記載されているアプローチは、SEC-SAXSが実行されていれば、ラボソースでも使用できます。さらに、放射線損傷フレームを拒絶し、バッファ減算14を実行する追加の自動化が利用可能である可能性がある。前処理データに対してプライマリデータ分析を実行し、利用可能なデータを最大限に活用する方法をセクション2で説明します。
セクション3では、SEC-SAXSデータをデコンボルドし、曲線を効率的に解析する方法を示します。ガウスピークデコンボリューションのようないくつかのデコンボリューション方法があるが、US-SOMO15およびギニエ最適化された最大限の尤度法で実施され、DELAソフトウェア16で実施され、これらは一般的にピーク形状12のモデルを必要とする。我々が調査している個々のピークの有限サイズは、ピーク形状または散乱プロファイル5、11に依存することなく、重なり合うピークをデコンボリューションする特異値分解(SVD)の強化された形態として、進化因子分析(EFA)を使用することを可能にする。SAXS 固有の実装は BioXTAS RAW17にあります。EFAは、2Dダイオードアレイデータが保持時間および波長データ18に対する吸光度からマトリックスを形成することを可能にした場合にクロマトグラフィーデータに最初に使用された。EFAが優れているのは、単数形値の進化する性格、新しいコンポーネントの出現に伴ってどのように変化するかを、取得10に固有の順序があるという警告を付ける点です。幸いにも、SEC-SAXS データは、組織化された 2D データ配列に必要なすべての順序付き取得データを提供し、EFA 技術に適しています。
セクション 4 では、SAXS 曲線を引いたバッファバックグラウンドからモデル非依存 SAXS 解析の基本を説明します。モデルに依存しない解析では、パーティクルのジャイロ半径(Rg)、相関体積(Vc)、多孔質体積(Vp)、およびポロドデバイ指数(PE)が決定されます。この解析では、無次元のクラッキープロット2、4、19を介して、粒子の熱力学的状態を、コンパクトさまたは柔軟性の観点から半定量的に評価することができます。
最後に、SAXSデータは相互空間単位で測定され、SAXSデータを実空間に変換してペア距離P(r)分布関数を回復する方法を示します。P(r)分布は、パーティクル内で見つかったすべての距離のセットで、パーティクルの最大次元 dmaxが含まれます。これは熱力学的測定であるため、P(r)分布は、パーティクルの立体空間が占める物理的空間を表します。SAXS データセットを適切に分析することで、結晶学やクライオ EM の高解像度情報を補完するソリューション状態の洞察を提供できます。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXSは、分子構造と構造生物学で使用される一般的な技術であり、溶液構造、粒子径と形状、表面対体積比、高分子および高分子複合体の立体構造変化を決定します。構造モデリング用の高品質の SAXS データセットは、単分散型の均一なサンプルからのものでなければならず、多くの場合、インラインクロマトグラフィーと即時 SAXS 測定の組み合わせによってのみ到達します。最も一般的には、サイズ排除クロマトグラフィーは、サンプルを分離し、単一のタンパク質種の十分に解決されたクロマトグラフィーピークからSAXS測定を行うことを可能にする目的の粒子から汚染物質および凝集を除外するために使用されます。それでも、場合によっては、インライン精製でさえ、複数の成分が互いに近すぎるか、または結合によって誘起される形状の変化が溶出時間を知覚する形の変化のために、単分散サンプルの保証ではない。これらの場合、混合物のSAXSデータをデコンボルテージして、個々の成分の理想化されたSAXS曲線を得ることができる可能性があります。ここでは、これを実現する方法を示し、SEC-SAXSデータの実用的な分析が理想的で困難なサンプルで行われます。具体的には、バクシニアE9DNAポリメラーゼエキソヌクレアーゼマイナス変異体のSEC-SAXS分析を示す。

古典的なフレーム選択13に対するデコンボリューションを用いる利点は、種が互いに及ぼす影響を取り除き、単分散散乱信号を生成する。これは、多くの場合、より良い信号対ノイズ比が続きます。E9 exoマイナスがDNAに結合し、SEC-SAXSを使用して実行されると、2つのピークが観察されます(図1)。最初の大きなピーク(フレーム 420\u2012475)は、E9 exoマイナス-DNA 複合体(フレーム 475\u2012540 およそフレーム)、非バインド状態です (補足データ: 図 2を参照)。フレームを選択する古典的なアプローチは、第1のピークで複合体の安定したRgを提供しますが(補足データ:図3を参照)、第2のピークは明確にマージされ、プロット全体のRgは、対象の第2のピークがクロスピーク汚染のために安定したRgを持っていないことを示しています。半安定したRgを示す5フレームのみ使用することができ、減算するとRg = 36.3 Å(図2、緑)を与えた。第2のピークに対応する曲線をEFAを用いてデコンボルチングした場合(図2、青)を元のピークに重ね合わし、ノイズへの信号の明らかな減少を示し、低Rg、34.1Åを記録した。クラッキープロット(図3)は、デコンボルトピーク(青)がより球状である複合体を示しています。これは、デコンボルト曲線(青)に対してd max 108.5 Åを与えるP(r)曲線(図4)によって確認され、非デコンボルートはdmax 120 Å(緑)でより細長く、これは非結合E9 exoマイナスから生じる不均質性に起因する可能性が最も高い。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> 図1:E9 exoマイナス 単独で、DNAを複合体で示すシグナルプロット 上部パネルには、SEC-SAXS の各フレームの背景に対する積分比のプロットが表示されます (水色)。赤い点は、ピーク上の各フレームのRgを示しています。下のパネルには、ダービン・ワトソンの自己相関分析に従って色付けされた各フレームの残差を示す対応するヒートマップが表示され、類似度の高い領域はシアン色で着色され、異なるフレームは暗い青色からピンクに続き、最後は異なる類似性の重症度に応じて赤に続く。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> 図2:強度と散乱ベクトルのプロット 減算された SAXS データのオーバーレイは、E9 exoマイナス を形成します。緑色の 5 フレーム (フレーム 517\u2012522) 平均と半安定 Rg の領域から差し引くと青 で、SEC-SAXS ピークの EFA デコンボリューションに由来する代表的な散乱曲線。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> 図3:無次元のクラッキー曲線 デコンボルト(青)と非デコンボルート(緑色)クラッキー曲線のオーバーレイは、E9 exoマイナス を示し、球状である。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> 図4:P(r)曲線 E9 exoマイナスのデコンボルト(青)および非デコンボルト(緑)曲線のオーバーレイ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足データ。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください</a>

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Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

SEC-BioSAXSの生体高分子の測定は、高分子とその複合体の溶液構造を決定するための標準的なアプローチです。ここでは、一般的に発生する2種類のSECトレース(完全に解決されたピークと部分的に解決されたピークを持つクロマトグラム)からのSEC-BioSAXSデータを分析します。散布図とBioXTAS RAWによる解析とデコンボリューションの実演を行う。

EFAデコンボリューションとスキャッタによるSEC-SAXSデータの分析

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

生体小角X線散乱は、高分子および高分子錯体の構造測定を提供する。理想的には、測定するサンプルは単分散する必要があります。場合によっては、サイズ排除クロマトグラフィーSAXSは単分散性を生成するのに十分ではありませんが、ソフトウェアベースのSAXSデータのデコンボリューションを行い、理想化されたSAXS曲線を生成することができます。[名前を付けて保存] ボックスにサンプル名を入力し、[トレース] をクリックします。[詳細の編集] ボタンをクリックして、実験の詳細を編集し、適切なフィールドに入力します。バッファー フレームを手動で選択するには、[バッファーの設定] をクリックします。左クリックしてドラッグして、約 100 フレームのサイズ除外クロマトグラフィー列のボイドボリュームの前に、トレースカーブ上のフラットとしてバッファを選択し直し、バッファを設定して更新して SEC ファイルを再計算します。左クリックして、信号プロット上の対象領域を選択し、ヒートマッププロットの十字線を左クリックしてドラッグして、マージに使用するフレームのズームとサブセットを選択します。もう 1 つの左クリックで、十字の右下の領域に対応するヒート マップのフレームをハイライト表示します。理想的には、フレームは主にシアン色と安定したジャイロ半径を持つ領域を強調する必要があります。選択したフレームに問題がなければ、[マージ]をクリックして減算されたフレームをマージし、[解析]タブをクリックしてデータを表示します。データのデコンボリューションの場合は、データセットをデコンボリューション プログラムに読み込みます。コントロールパネルのファイルで、フォルダシンボルを使用してデータを検索し、すべてのDATファイルをハイライト表示します。一連のプロットには、統合強度とフレーム番号のプロットが描画されます。系列タブで、クリックして曲線をハイライト表示し、LC 解析ポップアップウィンドウを開きます。適切なバッファー領域を選択するには、[領域を追加] をクリックしてクロマトグラムのピークの前の領域と、溶媒の前面の後の領域を選択し、バッファーをクリックします。ポップアップ ウィンドウには、背景にフレームが選択されていない旨が表示されます。EFAを起動するには、ハイライト表示されたファイルを右クリックし、メニューからEFAを選択します。ポップアップ ウィンドウで、データセットの単一値分解を観察する必要があります。コントロール ボックスで、[フレーム ボックスを使用]の値をオンにして、デコンボルテージするピーク領域全体が強度プロットで覆われていることを確認します。単数値プロットは、ベースラインの上の単数形値の強度を示します。左と右の単一ベクトルが一致しない場合は、有意な単数ベクトル数を 2 に変更し、左右の単一ベクトルが類似するまでフレームを移動します。EFAは計算され、各ベクトルの前方および後方方向のプロットを生成し、選択されたサイズ除外クロマトグラフィーSAXSデータの解析プロファイルをいつ開始および終了するかを示す。RAW は範囲の識別を試みます。必要に応じて、矢印を使用して範囲を変更し、各円が変曲点の始まりになるように、ベースラインから立ち上がったり、ベースラインに落ちたりして、[次へ]をクリックします。スパイクを減らすか、または除去するには、範囲制御矢印を使用して、スパイクに対応するフレームをほぼ特定し、コンポーネント範囲コントロールを調整します。最小カイ四角形が達成されたら、[戻る] をクリックして検証チェックを実行します。元の EFA プロットが有効な場合は、[次へ]をクリックして EFA データを保存してプロットを保存します。次に[完了]をクリックしてEFAウィンドウを閉じます。次に、RAW ウィンドウで、プロット パネルでプロファイルを開いてカーブを表示します。コントロール パネルの [プロファイル] タブで、右クリックしてカーブを DAT ファイルとして保存します。SAXS の決定では、散布図分析タブを開き、G を選択して、マニュアル Guinier 分析ツールを選択します。プロットで、残差に笑顔や眉をひそめたフィーチャーがないようにポイントを追加または削除します。ギニエフィットで選択したデータは、最大キューに 1.3 の旋回限界の半径を掛けた値を超えないようにする必要があります。正規化されたクラツキーをクリックします。結果のプロットは、高分子、球状、円筒形、無秩序、質量、および濃度の構造状態の評価を提供する。クリックして、相関のボリューム。Q プロットの関数としての総散乱強度と総散乱強度の積分領域は、散乱曲線の品質を検証するためのクイックリファレンスとして表示されます。柔軟性分析を開始するには、[柔軟性] をクリックします。ポップアップウィンドウの各パネルは、コンパクトと細長い柔軟なバイオポリマーの間に存在する電力法関係を利用するプロットを示します。ボックスの下部にあるスライダを使用して、いずれかの区画の高原に到達するまでデータの表示を変更します。柔軟性分析を実行した直後に、ボリュームをクリックします。3つのグラフのポップアップが生成されます。Porod-Debye プロットは、柔軟性プロットのスライダーが残された場所を追跡し、高原領域データを示します。パーティクルの体積を計算するには、プロット上の青い線が高原領域に合うように始点と終点を移動します。公平な結果では、ポロド-デバイ指数の指数法適合の残差はパターンを示さないはずです。[R]タブのPでは、実際の空間分布とサンプルの散乱曲線が観察されます。理想的には、分布曲線は波のない滑らかで、x軸に優しく触れる必要があります。サンプル名を右クリックし、[DMAX を検索]をクリックして新しいウィンドウを開きます。最大ディメンションの制限は、提案された最大 Q 範囲、計算に使用する最大データポイント、下限と上限の最大次元制限、および下方と上限のアルファ スコアで事前設定されます。[開始] をクリックします。複合分布が、推奨される最大次元およびアルファレベルとともに作成されます。これらのデータが許容可能な場合は、ウィンドウを閉じて[R]タブのPに戻り、そこで、希望する最大Q範囲に合わせて相互空間プロットがトリミングされるようになりました。さらにモデルを選択し、[背景] をクリックして、ポップアップ ボックスの推奨値にアルファ レベルと最大ディメンションを設定します。[絞り込み] をクリックします。クロス検証プロットが開き、赤で示された点が拒否されたかどうかが表示されます。拒否されたポイントが少なく、分布が良好に見える場合は、モデルが良好です。[分析] タブでレポートを印刷します。左クリックしてサンプルをハイライトし、サンプル名を右クリックします。単一のデータセットから [レポートの作成] を選択します。コメントを許可するテキストボックスが開き、生成されたすべての図と値を示すPDF文書が作成されます。本代表分析では、E9DNAポリメラーゼエキソヌクレアーゼマイナス変異体をDNAに結合し、サイズ排除クロマトグラフィー小角X線散乱を用いて実行した。2つのピークが観察された。第1の大きなピークは、E9DNAポリメラーゼエキソヌクレアーゼから変異型DNA複合体を示す。2 つ目は非バインド状態を示します。フレームを選択する古典的なアプローチは、第1のピークで複合体の旋回の安定した半径を提供するが、第2のピークは明確にマージされ、プロット全体の旋回の半径は、対象の第2のピークは、クロスピーク汚染によるジャイロの安定した半径を持っていないことを示しています。この解析では、半安定な旋回半径を示すフレームは5フレームしか使用できませんでした。減算すると、36.3オングストロームの旋回半径を与えた。ピークがEFAを用いてデコンボルテージされたとき、第2のピークに対応する曲線は元のピークと重ね合わされ、34.1オングストロームのノイズと低い旋回半径に対する信号の明確な減少を示した。データのクラッキープロットは、畳み込んだピークを持つ複合体が、デコンボルト曲線の最大次元108.5オングストロームを与えるPR曲線によって確認されるように、より球状であることを明らかにします。この分析のための非デコンボルトデータは、最大次元120オングストロームでより細長く、最も可能性の高い非結合E9ポリメラーゼからエキソヌクレアーゼ変異体を差し引いた不均一性に起因する。最も重要なステップは、単数形の値と、これらのデータの範囲を選択する際に、デコンボリューションの精度に大きく影響を与えます。結果は単独で取るべきではありませんが、分析遠心や多角レーザー光散乱などの追加技術を使用して生物学的解釈を可能にする追加の技術を使用してさらに評価する必要があります。In-line 列結合 SAXS とデコンボリューションと、Scatter が提供するプログラムのようなユーザーフレンドリーなインターフェイスは、本質的に困難なシステムからも意味のある構造データを提供する強力なパッケージです。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

の生産、結晶化と構造決意<em&gt; C。ディフィシル</em&gt; PPEP-1 Microseeding及び亜鉛SADを介しました

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

嫌気性蛋白質の浄化および DesB ジオキシゲナーゼ活性と抑制の勉強用酸素電極による速度論的解析

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

完全自律型の特性と生体高分子の結晶からのデータ収集

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

微生物タンパク質および特殊代謝産物データの分析にオープンソースのMALDI TOF-MS IDBacパイプラインを使用

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

茶由来の新たに確立された細胞懸濁液培養における6種の全身殺虫剤の代謝に関する研究(カメリアシネンシスL.葉

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

コネクシン43構造破壊による内皮バイオメカニクスの摂動

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

プロテオミクス施設提出のためのTMTサンプル調製とその後のデータ分析

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

ダイヤモンド光源での固定ターゲットシリアルデータ収集

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

FASP消化とデータ非依存分析によるEPS-尿のプロテオミクスプロファイル

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...