Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
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Reconhecemos o apoio financeiro ao projeto da subvenção francesa REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 e por bolsas de pesquisa do Serviço de Santé des Armées e da Délégation Générale pour l'Armement. Somos gratos ao ESRF pelo tempo de feixe de SAXS. Este trabalho utilizou as plataformas do centro Grenoble Instruct-ERIC (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) dentro da Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), apoiada pela FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) e GRAL, financiados dentro da escola de pós-graduação Da Universidade Grenoble Alpes (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). O IBS reconhece a integração ao Instituto de Pesquisa Interdisciplinar de Grenoble (IRIG, CEA). Agradecemos a Wim P. Burmeister e ao Padreédéric Iseni pelo apoio financeiro e científico e também agradecemos ao Dr. Jesse Hopkins da BioCAT na APS por sua ajuda e pelo desenvolvimento do BioXTAS RAW.

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+SAXS+versatility:+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture,+functional+landscapes,+and+integrative+structural+biology.">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li><li>Gr&#228;wert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+(SAXS).">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li><li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li><li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline.">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li><li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis.">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li><li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberb&#252;hler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III:+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations.">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li><li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).</li><li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding.">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li><li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+(US-SOMO)+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite.">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li><li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering.">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li><li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioXTAS+RAW:+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis.">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li><li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks.">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li><li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers.">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

Os autores não têm nada a revelar.

Deseja-se ter uma amostra monodisperse antes de iniciar um experimento de SAXS, mas, na realidade, muitas coleções de dados não satisfazem isso e devem ser melhoradas combinando a medição com cromatografia inlina — SEC na maioria dos casos. No entanto, nem mesmo a escassez de tempo entre purificação e aquisição de dados da amostra não é garantida. Mais comumente, isso se aplica a experimentos onde os componentes são muito próximos em tamanho ou em suas propriedades físicas para serem separados ou são propensos a dinâmicas rápidas. Aqui, fornecemos um protocolo que combina a decomposição de valor único com a análise de fatores em evolução para remover a influência do DNAbound E9 exomenos de sua forma nãoboundform criando um perfil de dispersão monodisperse que então fomos capazes de analisar com o pacote SAXS Scatter IV.
SVD com EFA de dados SEC-SAXS são métodos muito poderosos desenvolvidos para desconvoluir os dados do SAXS e melhorar a análise, mas eles têm limitações. Eles exigem que o ruído ou a deriva na linha de base tampão do SEC-SAXS seja mantido ao mínimo. Isso pode envolver equilíbrio extra da coluna (melhor usar mais de 3 volumes de coluna, dependendo do buffer) antes do carregamento da amostra. No entanto, o passo mais crítico é a escolha do número dos valores singulares e da gama de dados utilizados, pois isso afetará muito a precisão da desconvolução. É por essa razão que os resultados não devem ser tomados por conta própria, mas ainda mais analisados usando técnicas como ultracentrifugação analítica (AUC) ou multi-ângulo-laser-light-scattering (MALLS) para interpretação biológica.
Scatter IV é um novo pacote de software, gratuito para pesquisa e uso industrial com uma interface de usuário intuitiva que permite até mesmo não-especialistas analisar seus dados. O Scatter IV tem vários novos recursos que ajudam a melhorar a análise dos dados SEC-SAXS, como o mapa de calor ligado ao gráfico de sinal, permitindo maior precisão com a escolha da seleção de quadros. Na análise dos dados primários, a análise do Pico Guinier e o gráfico de validação cruzada associados à análise P(r) oferecem uma capacidade integrada de solução de problemas no software.
Deve-se mencionar que muitos outros programas podem ser usados para análise de dados primários; estes contêm os mesmos recursos básicos e também são atualizados regularmente, como BioXTAS RAW17 pacoteATSAS 24 e US-SOMO15 para citar alguns.
Mas independentemente de qual pacote SAXS é usado para análise, as principais limitações são comuns: a preparação da amostra, antes da coleta e análise. No exemplo E9 exomenos mostrado, é claro ver a melhora na relação sinal-ruído e com uma redução no Rg omáximo d associado a uma amostra monodisperse. Isso ajudará muito no processamento dos dados, como a montagem ou modelagem com estruturas conhecidas de alta resolução.

Macromoléculas biológicas são muito pequenas para serem vistas mesmo com os melhores microscópios de luz. Os métodos atuais para determinar suas estruturas geralmente envolvem cristalizar a proteína ou medições em um grande número de moléculas idênticas ao mesmo tempo. Embora a cristalografia forneça informações sobre o nível atômico, ela representa um ambiente de amostra artificial, dado que a maioria das macromoléculas não são apresentadas de forma cristalina na célula. Durante os últimos dois anos, a microscopia crio-elétron forneceu estruturas semelhantes de alta resolução de grandes macromoléculas / complexos macromoleculares, mas embora as amostras estejam mais próximas da condição fisiológica, elas ainda estão congeladas, portanto imóveis e estáticos. A dispersão de raios-X de ângulo bio-pequeno (BioSAXS) fornece uma medição estrutural da macromolécula, em condições relevantes para a biologia. Este estado pode ser visualizado como uma forma 3D de baixa resolução determinada na escala de nanômetros e captura todo o espaço conformacional da macromolécula em solução. Os experimentos biosaxs avaliam eficientemente o estado oligomerico, domínio e arranjos complexos, bem como flexibilidade entre os domínios1,2,3. O método é preciso, em sua maioria não destrutivo e geralmente requer apenas um mínimo de preparação e tempo da amostra. No entanto, para a melhor interpretação dos dados, as amostras precisam ser monodisperses. Isso é desafiador; moléculas biológicas são frequentemente suscetíveis a contaminações, má purificação e agregação, por exemplo, do congelamento do descongelamento4. O desenvolvimento da cromatografia inline seguida da medição imediata do SAXS ajuda a mitigar esses efeitos. A cromatografia de exclusão de tamanho separa as amostras por tamanho, excluindo assim a maioria dos contaminantes e agregações5,6,7,8,9,10. No entanto, em alguns casos, mesmo o SEC-SAXS não é suficiente para produzir uma amostra monodisperse, porque a mistura pode consistir de componentes que estão muito próximos em tamanho ou suas propriedades físicas ou sua dinâmica rápida levam a picos sobrepostos no traço SEC UV. Nestes casos, uma etapa de desconvolução baseada em software dos dados saxs obtidos pode levar a uma curva DE SAXS idealizada do componente individual5,11,12. Como exemplo, na seção de protocolo 2, mostramos a análise padrão SEC-SAXS da exonuclease de DNA da vaccinia E9 exonuclease menos mutante (E9 exomenos) em complexo com DNA. A vaccinia representa o organismo modelo da Poxviridae, uma família que contém vários patógenos, por exemplo, o vírus da varíola humana. A polimerase mostrou-se ligar firmemente ao DNA em abordagens bioquímicas, com a estrutura do complexo recentemente resolvida pela cristalografia de raios-X13.
A maioria das instalações síncrotrons fornecerá um pipeline automatizado de processamento de dados que executará a normalização e integração de dados produzindo um conjunto de quadros nãoubtratados. Mas a abordagem descrita neste manuscrito também poderia ser usada com uma fonte de laboratório desde que a SEC-SAXS seja realizada. Além disso, pode-se estar disponível uma automação adicional que rejeite quadros danificados por radiação e realize a subtração do buffer14. Mostraremos como realizar a análise de dados primários em dados pré-processados e aproveitar ao máximo os dados disponíveis na seção 2.
Na seção 3, mostramos como desconvoluir os dados do SEC-SAXS e analisar as curvas de forma eficiente. Embora existam vários métodos de desconvolução, como a desconvolução do pico gaussiano, implementado no US-SOMO15 e o método de máxima probabilidade otimizado guinier, implementado no software DELA16,estes geralmente requerem um modelo para a forma máxima12. O tamanho finito dos picos individuais que estamos investigando permite o uso da análise de fatores em evolução (EFA), como uma forma aprimorada de decomposição de valor singular (SVD) para desconvolutar picos sobrepostos, sem depender da forma de pico ou do perfil de dispersão5,11. Uma implementação específica do SAXS pode ser encontrada no BioXTAS RAW17. O EFA foi usado pela primeira vez em dados de cromatografia quando os dados do array 2D diodo permitiram que as matrizes fossem formadas a partir da absorção contra o tempo de retenção e os dados de comprimento de onda18. Quando a EFA se destaca é que ela se concentra no caráter em evolução dos valores singulares, como eles mudam com a aparência de novos componentes, com a ressalva de que há uma ordem inerente na aquisição10. Felizmente, os dados da SEC-SAXS fornecem todos os dados de aquisição ordenados necessários em matrizes de dados 2D organizados, emprestando-se bem à técnica EFA.
Na seção 4, demonstraremos o básico da análise SAXS independente do modelo a partir da curva SAXS subtraída de fundo tampão. A análise de forma independente do modelo determina o raio de giro (Rg) da partícula, o volume de correlação (Vc), o Volume de Porod (Vp) e o Expoente porod-Debye (PE). A análise fornece uma avaliação semi-quantitativa do estado termodinâmico da partícula em termos de compactação ou flexibilidade através do gráfico kratky indimensionado2,4,19.
Finalmente, os dados do SAXS são medidos em unidades espaciais recíprocas e mostraremos como transformar os dados do SAXS em espaço real para recuperar a função de distribuição de par-distância, P(r). A distribuição P(r)é o conjunto de todas as distâncias encontradas dentro da partícula e inclui a dimensão máxima da partícula, dmax. Por se trata de uma medição termodinâmica, a distribuição P(r) representa o espaço físico ocupado pelo espaço conformacional das partículas. A análise adequada de um conjunto de dados SAXS pode fornecer insights de estado de solução que complementam informações de alta resolução da cristalografia e crio-EM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS é uma técnica popular usada em biologia molecular e estrutural para determinar a estrutura da solução, tamanho e forma de partículas, relação superfície-volume e alterações conformais de macromoléculas e complexos macromoleculares. Um conjunto de dados SAXS de alta qualidade para modelagem estrutural deve ser de amostras monodisperse, homogêneas e isso muitas vezes só é alcançado por uma combinação de cromatografia inlina e medição imediata do SAXS. Mais comumente, a cromatografia de exclusão de tamanho é usada para separar amostras e excluir contaminantes e agregações da partícula de interesse, permitindo que as medidas de SAXS sejam feitas a partir de um pico cromatográfico bem resolvido de uma única espécie de proteína. Ainda assim, em alguns casos, mesmo a purificação inline não é uma garantia de amostras monodispersas, seja porque vários componentes estão muito próximos um do outro em tamanho ou mudanças de forma induzidas pelo tempo de eluição percebida por alterações de ligação. Nestes casos, pode ser possível desconvoluir os dados saxs de uma mistura para obter as curvas de SAXS idealizadas de componentes individuais. Aqui, mostramos como isso é alcançado e a análise prática dos dados da SEC-SAXS é realizada em amostras ideais e difíceis. Especificamente, mostramos a análise SEC-SAXS da vaccinia E9 DNA polimerase exonuclease menos mutante.

A vantagem do uso da desconvolução sobre a seleção clássica de quadros13 é remover a influência das espécies entre si, produzindo um sinal de dispersão monodisperse. Isso também é frequentemente seguido com uma melhor relação sinal/ruído. Quando o E9 exomenos é vinculado ao DNA e executado usando SEC-SAXS, dois picos são observados(Figura 1). O primeiro pico grande (aproximadamente quadros 420\u2012475) é o complexo E9 exomenos-DNA o segundo (aproximadamente quadros 475\u2012540), o estado desvinculado (ver Dados Complementares: Figura 2). Enquanto a abordagem clássica de selecionar quadros fornece um Rg estável do complexo no primeiro pico (ver Dados Suplementares: Figura 3), o segundo pico é claramente mesclado e o Rg em toda a trama mostra que o segundo pico de interesse não tem um Rg estável, devido à contaminação entre picos. Apenas 5 quadros poderiam ser utilizados que mostrassem um Rg semi-estável, quando subtraídos eles deram um Rg = 36,3 Å(Figura 2, verde). Quando os picos foram desconvoluídos usando EFA, a curva correspondente para o segundo pico(Figura 2, azul) foi sobreposta com o original e mostrou uma clara diminuição no sinal para ruído, e um Rg inferior, 34,1 Å foi registrado. A trama de Kratky(Figura 3)mostra que o complexo com o pico desconvolucido (azul) é mais globular. Isso é confirmado pela curva P(r) (Figura 4) que dá um dmáximo 108,5 Å para a curva desconvolucida (azul) enquanto o não-desconvolutado é mais alongado com um dmáximo 120 Å (verde), isso é mais provável devido à heterogeneidade decorrente do exo E9 não ligadomenos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> Figura 1: Gráfico de sinal de E9 exomenos sozinho e com DNA em complexo. O painel superior mostra um gráfico da razão integral para o fundo para cada quadro de uma execução SEC-SAXS (azul claro). Os pontos vermelhos mostram o Rg em cada quadro sobre o pico. O painel inferior mostra o mapa de calor correspondente mostrando os resíduos de cada quadro colorido de acordo com a análise de auto-correlação de Durbin-Watson, regiões de alta similaridade são cianos coloridos enquanto quadros diferentes seguem azuis mais escuros para rosas e, finalmente, vermelho, dependendo da gravidade da diferença. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> Figura 2: Parcela de intensidade versus vetor de dispersão. Uma sobreposição dos dados saxs subtraídos formam o exo E9menos . Em 5 quadros verdes (quadro 517\u2012522) médios e subtraídos de uma área de Rg semi-estável e em azul a curva de dispersão representativa derivada da desconvolução da EFA do pico SEC-SAXS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> Figura 3: Curva kratky sem dimensão. Sobreposição da curva kratky desconvoluida (azul) e não desconvoluida (verde) mostrando E9 exomenos é globular. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> Figura 4: Curva P(r). A sobreposição das curvas desconvolutadas (azul) e não desconvoluidas (verdes) para o exo E9menos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Dados Complementares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo</a>

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Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

As medições SEC-BioSAXS de macromoléculas biológicas são uma abordagem padrão para determinar a estrutura de soluções de macromoléculas e seus complexos. Aqui, analisamos os dados da SEC-BioSAXS de dois tipos de traços SEC comumente encontrados — cromatógramas com picos totalmente resolvidos e parcialmente resolvidos. Demonstramos a análise e a desconvolução utilizando dispersão e BioXTAS RAW.

Análise dos dados da SEC-SAXS via desconvolução e dispersão da EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

A dispersão biológica de raios-X de pequeno ângulo fornece medições estruturais de complexos macromoléculas e macromoleculares. Idealmente, a amostra a ser medida deve ser monodispersada. Embora, em alguns casos, a cromatografia de exclusão de tamanho SAXS não seja suficiente para produzir monodispersidade, uma desconvolução baseada em software dos dados saxs pode ser realizada para produzir uma curva SAXS idealizada.Seguindo este protocolo, um programa de desconvolução e o programa scatter fácil de usar podem ser usados para analisar os mutantes de poliomisão de DNA do vírus Vaccinia. Para realizar uma subtração de fundo dos dados de cromatografia de exclusão de tamanho, abra o programa Scatter 4 baseado em Java e abra a guia SEC. Arraste e solte os arquivos de dados reduzidos na janela de dados de queda e clique no botão diretório de saída e abra para definir o diretório de saída no qual os dados serão salvos.Digite o nome da amostra na caixa salvar como caixa e clique em rastrear. Clique no botão de detalhes de edição para editar os detalhes experimentais e preencher os campos apropriados. Para selecionar os quadros de buffer manualmente, clique em definir buffers.Clique esquerdo e arraste para reseleger o buffer como um plano na curva de rastreamento antes do volume vazio da coluna de cromatografia de exclusão de tamanho de aproximadamente 100 quadros e clique em definir buffer e atualizar para recalcular o arquivo SEC. Clique e arraste para selecionar uma região de interesse no gráfico de sinal e clique esquerdo e arraste os cabelos cruzados no gráfico do mapa de calor para selecionar o zoom e subconjunto de quadros que serão usados para fusão. Com outro clique à esquerda, destaque os quadros no mapa de calor correspondentes à área do canto inferior direito dos cabelos cruzados.Idealmente, o quadro deve destacar uma região com uma cor predominantemente ciano e um raio estável de giro. Quando estiver satisfeito com os quadros selecionados, clique em mesclar para mesclar os quadros subtraídos e clique na guia de análise para visualizar os dados. Para desconvolução dos dados, carregue o conjunto de dados no programa de desconvolução.No painel de controle sob arquivos, use o símbolo da pasta para localizar os dados e destacar todos os arquivos DAT. Um enredo de intensidade integrada versus número de quadro será desenhado na trama da série. Na guia série, clique para destacar a curva e para abrir a janela popup de análise LC.Para selecionar uma região tampão adequada, clique em adicionar região para selecionar uma área antes do pico do cromatograma e uma após a frente do solvente e clique em definir o buffer. As janelas pop-up indicarão que os quadros não foram selecionados para o plano de fundo. Para iniciar o EFA, clique com o botão direito do mouse no arquivo destacado e selecione EFA no menu.Na janela pop-up, deve-se observar a decomposição de valor único do conjunto de dados. Na caixa de controles, verifique os valores da caixa de quadros de uso para confirmar que toda a área de pico para desconvoluir está coberta pelo gráfico de intensidade. O enredo de valores singulares mostrará a intensidade dos valores singulares acima da linha de base.Se os vetores únicos esquerdo e direito não corresponderem, altere o número de vetor singular significativo para dois e mova os quadros até que os vetores singulares esquerdo e direito sejam semelhantes. O EFA será calculado, gerando parcelas nas direções para frente e para trás para cada vetor e indicando quando os componentes iniciam e saem do perfil da solução para os dados saxsográficos de exclusão de tamanho selecionado. Raw tentará identificar as faixas.Se necessário, use as setas para alterar os intervalos de modo que cada círculo seja o início de um ponto de inflexão, subindo ou caindo para a linha de base e clique em seguida. Para reduzir ou eliminar os picos, identifique aproximadamente qual quadro corresponde ao pico usando as setas de controle de alcance para ajustar os controles de alcance dos componentes. Quando um quadrado chi mínimo tiver sido alcançado, clique de volta para realizar uma verificação de validação.Se os gráficos originais do EFA ainda forem válidos, clique em seguir e salve os dados da EFA para salvar os plots. Em seguida, clique feito para fechar a janela EFA. Em seguida, na janela RAW, abra perfis no painel de enredo para visualizar as curvas.Na guia perfis do painel de controle, clique com o botão direito do mouse para salvar as curvas como arquivos DAT. Para determinar o SAXS, abra a guia de análise de dispersão e selecione G para selecionar a ferramenta de análise Guinier manual. Na trama, adicione ou remova pontos de tal forma que os resíduos não tenham um recurso de sorriso ou carranca.Os dados selecionados no ajuste guinier não devem exceder a fila máxima multiplicada por raio de limite de giro de 1,3. Clique em Kratky normalizado. O enredo resultante fornece uma avaliação do estado estrutural da macromolécula, globular, cilíndrico, desordenado, normalizado para massa e concentração.Clique no volume de correlação. A intensidade total dispersa e uma área integrada da intensidade total dispersa em função das parcelas Q aparecerão como uma referência rápida para validar a qualidade da curva de dispersão. Para iniciar a análise de flexibilidade, clique em flexibilidade.Cada painel na janela pop-up mostrará um enredo explorando uma relação de lei de poder que existe entre o compacto e os biopolímeros flexíveis alongados. Use o controle deslizante na parte inferior da caixa para alterar a visão dos dados até que um platô em uma das parcelas seja alcançado. Imediatamente após a realização de uma análise de flexibilidade, clique no volume.Um popup de três gráficos será gerado. A trama de Porod-Debye rastreia onde o controle deslizante da trama de flexibilidade foi deixado e mostra os dados da área platadas. Para calcular o volume da partícula, mova os pontos de partida e final até que a linha azul na trama se encaixe na região platô.Para um resultado imparcial, os resíduos da lei de poder expoente Porod-Debye não devem mostrar nenhum padrão. Sob a guia P de R, a distribuição real do espaço e a curva de dispersão para a amostra podem ser observadas. Idealmente, a curva de distribuição deve ser suave, sem ondas e deve apenas tocar suavemente o eixo x.Clique com o botão direito do mouse no nome da amostra e clique em encontrar DMAX para abrir uma nova janela. Os limites para a dimensão máxima são predefinidos com a faixa máxima Q sugerida, os pontos de dados máximos a serem utilizados para o cálculo, os limites de dimensão máxima inferior e superior, e um escore alfa inferior e superior. Clique em iniciar.Uma distribuição composta será criada juntamente com uma dimensão máxima sugerida e nível alfa. Se esses dados forem aceitáveis, feche a janela para retornar à guia P de R, onde o gráfico de espaço recíproco será agora cortado para corresponder à faixa máxima de Q sugerida. Selecione o modelo mais e clique em plano de fundo para definir o nível alfa e a dimensão máxima aos valores sugeridos da caixa pop-up.Clique em refinar. Uma parcela de validação cruzada será aberta, mostrando se algum ponto teve que ser rejeitado como indicado em vermelho. Se há apenas alguns pontos rejeitados e a distribuição parece boa, então o modelo é bom.Você imprimirá um relatório na guia de análise. Clique à esquerda para destacar a amostra e o clique à direita no nome da amostra. Selecione criar relatório a partir do conjunto de dados único.Uma caixa de texto será aberta para permitir comentários e um documento PDF será produzido mostrando todos os números e valores gerados. Nesta análise representativa, a exonuclease de DNA E9 menos mutante foi ligada ao DNA e executada usando a dispersão de raios-X de pequeno ângulo de exclusão de tamanho. Dois picos foram observados.O primeiro grande pico representa a exonuclease de DNA E9 menos o complexo de DNA mutante. E o segundo indica o estado desvinculado. Enquanto a abordagem clássica de selecionar quadros fornece um raio estável de giro do complexo no primeiro pico, o segundo pico é claramente mesclado e o raio de giro em toda a trama mostra que o segundo pico de interesse não tem um raio estável de giro devido à contaminação do pico cruzado.Nesta análise, apenas cinco quadros foram utilizados que apresentaram um raio semi-estável de giro. Quando subtraídos, deram um raio de giro de 36,3 angstroms. Quando os picos foram desconvolucidos usando EFA, a curva correspondente para o segundo pico foi sobreposta com o original, mostrando uma clara diminuição do sinal para o ruído e menor raio de giro de 34,1 angstroms.Um gráfico kratky dos dados revela que o complexo com o pico complicado é mais globular como confirmado pela curva de RP que dá uma dimensão máxima de 108,5 angstroms para a curva desconvoluida. Os dados não desconvolucidos para esta análise são mais alongados com uma dimensão máxima de 120 angstroms, provavelmente devido à heterogeneidade decorrente da polimerase E9 não ligada menos mutante exonuclease. Os passos mais críticos estão na seleção dos valores singulares e da gama de dados utilizados, pois estes afetam muito a precisão da desconvolução.Os resultados não devem ser tomados por conta própria, mas ainda mais avaliados usando técnicas adicionais, como centrifugação analítica ou dispersão de luz laser multi-ângulo para permitir sua interpretação biológica. Saxs acoplado a colunas em linha em combinação com a desconvolução e uma interface fácil de usar como o programa Scatter fornece é um pacote poderoso para fornecer dados estruturais significativos mesmo a partir de sistemas intrinsecamente difíceis.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produção, cristalização e determinação da estrutura de<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 via microdispersão e Zinco-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Bioquímica

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Purificação de proteínas anaeróbica e análise cinética através do eletrodo de oxigênio para estudar a inibição e atividade dioxigenase DesB

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Caracterização totalmente autónoma e coleta de dados de cristais de macromoléculas biológicas

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Usando o pipeline de código aberto MALDI TOF-MS IDBac para análise de proteína microbiana e dados metabólito especializados

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Estudo sobre o metabolismo de seis inseticidas sistêmicas em uma cultura de suspensão celular recém-estabelecida derivada do chá (Camellia sinensis L.) Folhas

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Perturbando a biomecânica endotelial via connexin 43 disrupção estrutural

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Preparação da amostra TMT para envio de instalações proteômicas e análise de dados subsequentes

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Coleta de dados seriais de alvo fixo na fonte Diamond Light

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Perfil proteômico de EPS-urina através da Digestão FASP e Análise Independente de Dados

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...