Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Мы признаем финансовую поддержку проекта от французского гранта REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 и научно-исследовательские гранты от Службы Санте-де-Армаес и Делегоации G'an'rale за l'Armement. Мы благодарны ESRF за время пучка SAXS. В этой работе использовались платформы центра Grenoble Instruct-ERIC (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) в рамках Гренобльского партнерства по структурной биологии (PSB), при поддержке FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) и GRAL, финансируемых в рамках университета Гренобль Альпы аспирантуру (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-003). IBS признает интеграцию в Междисциплинарный научно-исследовательский институт Гренобля (IRIG, CEA). Мы благодарим Вима.Бурмейстера и Фредерика Исени за финансовуюи научную поддержку, а также благодарим д-ра Джесси Хопкинса из BioCAT в APS за его помощь и за разработку BioXTAS RAW.

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+SAXS+versatility:+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture,+functional+landscapes,+and+integrative+structural+biology.">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li><li>Gr&#228;wert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+(SAXS).">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li><li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li><li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline.">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li><li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis.">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li><li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberb&#252;hler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III:+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations.">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li><li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).</li><li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding.">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li><li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+(US-SOMO)+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite.">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li><li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering.">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li><li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioXTAS+RAW:+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis.">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li><li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks.">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li><li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers.">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

Авторов нечего раскрывать.

Перед началом эксперимента SAXS желательно иметь монодисперсную выборку, но в действительности многие коллекции данных не удовлетворяют этому и должны быть улучшены путем объединения измерения с рядной хроматографией-SEC в большинстве случаев. Однако даже нехватка времени между очисткой и монодисперсностью выборки в получении данных не гарантируется. Чаще всего это относится к экспериментам, в которых компоненты слишком близки по размеру или по своим физическим свойствам, чтобы быть разделенными или склонными к быстрой динамике. Здесь мы предоставили протокол, сочетающий разложение одного значения с развивающимся анализом факторов, чтобы удалить влияние экзо минуса DNAbound E9 из его нескончаемой формы, создавая монодисперсный профиль рассеяния, который мы смогли проанализировать с помощью пакета SAXS Scatter IV.
SVD с EFA данных SEC-SAXS являются очень мощными методами, разработанными для деконволюция данных SAXS и улучшения анализа, но они имеют ограничения. Они требуют, чтобы шум или дрейф в буферной базовой линии SEC-SAXS сведены к минимуму. Это может включать дополнительное эквивалентность столбца (лучше использовать более 3 объемов столбца, в зависимости от буфера) перед загрузкой выборки. Однако наиболее важным шагом является выбор количества единичных значений и диапазона используемых данных, поскольку это значительно повлияет на точность деконволюции. Именно по этой причине результаты не должны быть приняты сами по себе, но дальнейшее анализ с использованием таких методов, как аналитическая ультрацентрифугация (AUC) или многоугольный лазер-свет рассеяния (MALLS) для биологической интерпретации.
Scatter IV - это новый пакет программного обеспечения, бесплатный для исследований и промышленного использования с интуитивно понятным пользовательским интерфейсом, который позволяет даже неэкспертам анализировать свои данные. Scatter IV имеет несколько новых функций, которые помогают улучшить анализ данных SEC-SAXS, таких как тепловая карта, связанная с сюжетом сигнала, что позволяет повысить точность выбора кадра. В первичном анализе данных анализ Пика Гинье и график перекрестной проверки, связанный с анализом P(r), предлагают интегрированную способность устранения неполадок в программном обеспечении.
Следует отметить, что многие другие программы могут быть использованы для первичного анализа данных; они содержат те же основные функции, а также регулярно обновляются, такие как BioXTAS RAW17 ATSASпакет 24 и US-SOMO15, чтобы назвать несколько.
Но независимо от того, какой пакет SAXS используется для анализа, основные ограничения являются общими: подготовка выборки, до сбора и анализа. В примере E9 exominus ясно видеть улучшение соотношения сигнала к шуму и снижение rg dmax, связанное с монодисперсной выборкой. Это значительно поможет дальнейшей обработке данных, таких как примерка или моделирование с известными структурами высокого разрешения.

Биологические макромолекулы слишком малы, чтобы их можно было увидеть даже с помощью лучших световых микроскопов. Современные методы определения их структур обычно включают кристаллизацию белка или измерения на огромном количестве одинаковых молекул одновременно. Хотя кристаллография предоставляет информацию об атомном уровне, она представляет собой искусственную среду образца, учитывая, что большинство макромолекул не представлены в кристаллической форме в клетке. За последние пару лет криоэлектронная микроскопия доставила аналогичные структуры высокого разрешения крупных макромолекул/ макромолекулярных комплексов, но хотя образцы ближе к физиологическому состоянию, они все еще заморожены, следовательно неподвижны и статичны. Био-малый угол рентгеновского рассеяния (BioSAXS) обеспечивает структурное измерение макромолекулы, в условиях, которые имеют отношение к биологии. Это состояние можно визуализировать как 3-D-форма с низким разрешением, определяемая по нанометровой шкале, и фиксирует все конформациатное пространство макромолекулы в растворе. Эксперименты BioSAXS эффективно оценивают олигомерное состояние, домен и сложные механизмы, а также гибкостьмежду доменами 1,2,3. Метод является точным, в основном неразрушаемым и обычно требует лишь минимума подготовки образца и времени. Однако для наилучшего толкования данных выборки должны быть монодисперсами. Это сложная задача; биологические молекулы часто подвержены загрязнениям, плохой очистке и агрегации, например, от замораживания оттаивания4. Развитие inline хроматографии с последующим немедленным измерением SAXS помогает смягчить эти эффекты. Размер-исключение хроматографии отделяет образцы по размеру, таким образом, исключая большинство загрязняющих веществ и агрегаций5,6,7,8,9,10. Тем не менее, в некоторых случаях даже SEC-SAXS не достаточно, чтобы произвести монодисперсный образец, потому что смесь может состоять из компонентов, которые слишком близко по размеру или их физические свойства или их быстрая динамика приводит к перекрывающихся пиков в УФ-след SEC. В этих случаях этап деконволюции полученных данных SAXS на основе программного обеспечения может привести к идеализированной кривой SAXSотдельного компонента 5,11,12. В качестве примера, в протоколе раздела 2, мы показываем стандартный анализ SEC-SAXS вакцины E9 ДНК полимеразы экзонуклеазы минус мутант (E9 exoминус) в комплексе с ДНК. Vaccinia представляет собой модель организма Poxviridae, семьи, содержащей несколько патогенов, например, вирус оспы человека. Полимераза была показана плотно связываться с ДНК в биохимических подходов, со структурой комплекса недавно решена рентгеновской кристаллографии13.
Большинство синхротронных объектов обеспечат автоматизированный конвейер обработки данных, который будет выполнять нормализацию и интеграцию данных, создавая набор неподписанной рамы. Но подход, описанный в этой рукописи, также может быть использован с лабораторным источником при условии, что SEC-SAXS выполняется. Кроме того, может быть доступна дополнительная автоматизация, которая будет отвергать поврежденные радиацией кадры и выполнять вычитаниебуфера 14. Мы покажем, как проводить первичный анализ данных о предварительно обработанных данных и использовать имеющиеся данные в разделе 2.
В разделе 3 мы показываем, как деконволюция данных SEC-SAXS и эффективно анализировать кривые. Хотя Есть несколько методов деконволюции, таких как гауссийский пик деконволюции, реализованы в США-SOMO15 и Guinier оптимизированный метод максимальной вероятности, реализованный в программном обеспечении DELA16, они обычно требуют модели для пиковойформы 12. Конечный размер отдельных пиков, которые мы расследуем, позволяет использовать развивающийся анализ факторов (EFA), как улучшенную форму разложения особого значения (SVD) для деконволюционных перекрывающихся пиков, не полагаясь на пиковую форму или рассеянныйпрофиль 5,11. Конкретную реализацию SAXS можно найти в BioXTAS RAW17. EFA был впервые использован на данных хроматографии, когда данные 2D диодного массива позволили матрицы быть сформированы из поглощения против времени удержания и длины волныданных 18. Где EFA превосходит в том, что она фокусируется на развивающемся характере особых значений, как они меняются с появлением новых компонентов, с оговоркой, что есть неотъемлемый порядок вприобретении 10. К счастью, данные SEC-SAXS предоставляют все необходимые упорядоченные данные о приобретении в организованных массивах данных 2D, хорошо одалживая себя методу EFA.
В разделе 4 мы продемонстрируем основы независимого от модели анализа SAXS из буферно-фоновой вычитаемой кривой SAXS. Модель-независимый анализ определяет радиус действия частицы (Rg), объем корреляции (Vc), Porod Volume (Vp) и Porod-Debye Exponent (PE). Анализ дает полуколичебную оценку термодинамического состояния частицы с точки зрения компактности или гибкости с помощью без измерения участкаKratky 2,4,19.
Наконец, данные SAXS измеряются во взаимных космических единицах, и мы покажем, как преобразовать данные SAXS в реальное пространство для восстановления парного расстояния, P(r), функции распределения. P(r)-распределение — это набор всех расстояний, найденных внутри частицы, и включает в себя максимальное измерение частицы, dmax. Поскольку это термодинамическое измерение, P(r)-распределение представляет физическое пространство, занимаемое конформациальным пространством частиц. Правильный анализ набора данных SAXS может предоставить информацию о состоянии решения, которая дополняет информацию высокого разрешения из кристаллографии и крио-EM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS является популярным методом, используемым в молекулярной и структурной биологии для определения структуры раствора, размера и формы частиц, соотношения поверхности к объему и конформации макромолекул и макромолекулярных комплексов. Высококачественный набор данных SAXS для структурного моделирования должен быть из монодисперсных, однородных образцов, и это часто происходит только путем сочетания хроматографии и немедленного измерения SAXS. Чаще всего хроматография с исключением размеров используется для отделяния образцов и исключения загрязняющих веществ и агрегаций из частиц, представляющих интерес, что позволяет проводить измерения SAXS с хорошо решенного хроматографического пика одного вида белка. Тем не менее, в некоторых случаях даже высовывание не является гарантией монодисперсных образцов, либо потому, что несколько компонентов слишком близко друг к другу по размеру, либо изменения формы, вызванные обязательным изменением воспринимаемого времени elution. В этих случаях может быть возможно деконволюция данных SAXS смеси для получения идеализированных кривых SAXS отдельных компонентов. Здесь мы покажем, как это достигается, и практический анализ данных SEC-SAXS выполняется на идеальных и сложных образцах. В частности, мы показываем анализ SEC-SAXS вакцины E9 ДНК полимеразы экзонуклеазы минус мутант.

Преимущество использования деконволюции над классическим выборомрамы 13 заключается в том, чтобы снять влияние видов друг на друга, производя монодисперсный сигнал рассеяния. Это также часто сопровождается лучшим соотношением сигнала к шуму. Когда E9 exoминус связан с ДНК и запустить с помощью SEC-SAXS, два пика наблюдаются(рисунок 1). Первый, большой пик (примерно кадры 420-u2012475) является E9 exoминус-DNAкомплекс второй (примерно кадры 475'u2012540), несыхое состояние (см. Дополнительные данные: Рисунок 2). В то время как классический подход к выбору кадров обеспечивает стабильную Rg комплекса в первом пике (см. Дополнительные данные: Рисунок 3), второй пик явно сливается и Rg по сюжету показывает, что второй пик интереса не имеет стабильной Rg, из-за кросс-пик загрязнения. Только 5 кадров могут быть использованы, которые показали полу-стабильный Rg, при вычитании они дали Rg No 36,3(рисунок 2, зеленый). Когда пики были деконволюция с помощью EFA соответствующая кривая для второго пика(рисунок 2, синий) был наложен с оригиналом и показал явное снижение сигнала к шуму, и ниже Rg, 34,1 З был записан. Крацкий участок(рисунок 3) показывает комплекс с деконволюцией пика (синий) является более шаровой. Это подтверждается кривой P(r) (Рисунок 4), который дает dmax 108.5 для деконволюции кривой (синий), в то время как недекололетированная более удлиненная с dmax 120 (зеленый), это, скорее всего, из-за неоднородности, вытекая из несыхватых E9 exoминус.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> Рисунок 1: Сигнальный сюжет E9 exoминус в одиночку и с ДНК в комплексе. Верхняя панель показывает участок интегрального соотношения к фону для каждого кадра запуска SEC-SAXS (светло-голубой). Красные точки показывают Rg на каждом кадре над пиком. Нижняя панель показывает соответствующую тепловую карту, показывающую остатки для каждого кадра, окрашенного в соответствии с анализом автоматической корреляции Дурбина-Уотсона, регионы с высоким сходством окрашены в синий цвет, в то время как непохожие кадры следуют за более темным блюзом и, наконец, красным в зависимости от тяжести непохожести. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> Рисунок 2: Участок интенсивности против вектора рассеяния. Наложение вычитаемых данных SAXS формирует exoминус E9. В зеленых 5 кадрах (рамка 517-u2012522) усреднены и вычтены из области полуконюшенной Rg и синим цветом репрезентативная кривая рассеяния, полученная из деконволюции EFA пика SEC-SAXS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> Рисунок 3: Бес измерение Kratky кривой. Наложение deconvoluted (синий) и не-deconvoluted (зеленый) Kratky кривой, показывающей E9 exoминус является шаровой. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> Рисунок 4: P (r) кривая. Наложение deconvoluted (синий) и не-deconvoluted (зеленый) кривые для E9 exoминус. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.</a>
Дополнительные данные. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Измерения биологических макромолекул SEC-BioSAXS являются стандартным подходом для определения структуры растворов макромолекул и их комплексов. Здесь мы анализируем данные SEC-BioSAXS из двух типов часто встречающихся следов SEC – хроматограмм с полностью разрешенными и частично разрешенными пиками. Мы демонстрируем анализ и деконволюцию с помощью scatter и BioXTAS RAW.

Анализ данных SEC-SAXS с помощью деконволюции и рассеяния EFA

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Биологическое мелкоугольное рассеяние обеспечивает структурные измерения макромолекулы и макромолекулярных комплексов. В идеале, образец, который должен быть измерен, должен быть монодисперсным. Хотя в некоторых случаях хроматография исключения размеров SAXS не достаточна для создания монодисперсии, для создания идеализированной кривой SAXS может быть выполнена деконволюция данных SAXS на основе программного обеспечения.Следуя этому протоколу, программа деконволюции и пользовательская программа Scatter могут быть использованы для анализа мутантов вируса Vaccinia ДНК-полимеразы exominus. Для выполнения фонового вычитания данных хроматографии исключения размера откройте программу Scatter 4 на основе Java и откройте вкладку SEC. Перетащите и уроните уменьшенные файлы данных в данные о падении ниже окна и нажмите кнопку каталога вывода и откройте для настройки каталога вывода, в котором данные будут сохранены.Введите имя образца в сохранить в качестве окна и нажмите след. Нажмите на кнопку редактирования деталей, чтобы отредактировать экспериментальные детали и заполнить соответствующие поля. Чтобы выбрать буферные кадры вручную, нажмите набор буферов.Левое нажатие и перетащите, чтобы переизбрание буфера в качестве плоской на кривой трассировки перед пустотным объемом столбца хроматографии исключения размера приблизительно 100 кадров и нажмите набор буфера и обновления, чтобы пересчитать файл SEC. Слева нажмите и перетащите, чтобы выбрать область интереса на сюжете сигнала и левым щелчком мыши и перетащите перекрестия в тепловой карте участка, чтобы выбрать зум и подмножество кадров, которые будут использоваться для слияния. С помощью другого левого щелчка выделите кадры на тепловой карте, соответствующие области нижнего правого поперечного волоса.В идеале рама должна выделить область с преимущественно цианового цвета и стабильным радиусом гирации. Удовлетворив выбранные кадры, нажмите слияние, чтобы объединить вычитаемые кадры и нажмите на вкладку анализа для просмотра данных. Для деконволюции данных загрузите набор данных в программе деконволюции.В панели управления под файлами используйте символ папки, чтобы найти данные и выделить все файлы DAT. Сюжет интегрированной интенсивности по сравнению с номером кадра будет нарисован в сюжете сериала. Под вкладкой серии нажмите, чтобы выделить кривую и открыть всплывающее окно анализа LC.Чтобы выбрать подходящую буферную область, нажмите добавить область, чтобы выбрать область до пика хроматограммы и один после буфера переднего растворителя и нажмите набор буфера. Всплывающие окна будут указывать на то, что кадры не были выбраны для фона. Чтобы начать EFA, нажмите правой кнопкой мыши на выделенный файл и выберите EFA из меню.В всплывающем окне следует наблюдать разложение одного значения набора данных. В поле управления проверьте значения коробки кадров использования, чтобы подтвердить, что вся область пика для деконволюта покрыта участком интенсивности. Участок значений сингулярных значений покажет интенсивность значений выше базового уровня.Если левый и правый одиночные векторы не совпадают, измените значительное число сингулярных векторов на два и переместите кадры до тех пор, пока не будут похожи левые и правые сингулярное векторы. EFA будет рассчитываться, генерируя участки в направлениях вперед и назад для каждого вектора и указывая, когда компоненты начинают и выходят из профиля решения для выбранных данных хроматографии исключения размера SAXS. RAW попытается определить диапазоны.При необходимости используйте стрелки для изменения диапазонов так, чтобы каждый круг был началом точки перегиба, поднимаясь с или падая на базовый уровень, и щелкните далее. Чтобы уменьшить или устранить шипы, определите, какой кадр соответствует шипу, используя стрелки управления диапазоном для регулировки элементов управления диапазоном компонентов. Когда минимальный квадрат Чи был достигнут, нажмите назад, чтобы выполнить проверку проверки.Если исходные участки EFA по-прежнему выглядят действительными, нажмите на следующий и сохраните данные EFA для сохранения участков. Затем нажмите, чтобы закрыть окно EFA. Затем в окне RAW откройте профили в панели участка для просмотра кривых.В вкладке профилей панели управления нажмите кнопку, чтобы сохранить кривые в качестве файлов DAT. Для определения SAXS откройте вкладку анализа рассеяния и выберите G для выбора ручного инструмента анализа Guinier. В сюжете, добавить или удалить точки так, что остатки не имеют улыбку или хмуриться функцию.Выбранные данные в подгонки Guinier не должны превышать максимальную очередь, умноженную на радиус предела gyration 1.3. Нажмите нормализованный Kratky. Полученный участок дает оценку структурному состоянию макромолекулы, шаровой, цилиндрической, неупорядоченой, нормализованной для массы и концентрации.Нажмите объем корреляции. Общая рассеянная интенсивность и интегрированная область общей рассеянной интенсивности в качестве функции участков q будут отображаться в качестве быстрой ссылки для проверки качества кривой рассеяния. Чтобы начать анализ гибкости, нажмите гибкость.Каждая панель в всплывающем окне покажет участок, эксплуатируемый отношения закона власти, которая существует между компактным и удлиненными гибкими биополимами. Используйте ползунок в нижней части коробки, чтобы изменить представление данных до тех пор, пока плато в одном из участков не будет достигнуто. Сразу после проведения анализа гибкости щелкните громкость.Всплывающее окно из трех графиков будет сгенерировано. Участок Porod-Debye отслеживает, где остался ползунок от участка гибкости, и показывает данные о районе плато. Чтобы рассчитать объем частицы, перемести точки старта и конца до тех пор, пока синяя линия на участке не будет подходит к области плато.Для объективного результата остатки в законе о власти Пород-Дебье не должны показывать никакой закономерности. Под вкладкой P of R можно наблюдать реальное распределение пространства и кривую рассеяния для образца. В идеале кривая распределения должна быть гладкой без волн и должна просто мягко касаться х-оси.Нажмите правой кнопкой мыши на название образца и нажмите кнопку найти DMAX, чтобы открыть новое окно. Пределы для максимального измерения заданы с предлагаемым максимальным диапазоном q, максимальными точками данных, которые будут использоваться для расчета, нижними и верхними максимальными пределами измерения, а также более низким и верхним альфа-баллом. Нажмите кнопку "Начать".Будет создано композитное распределение вместе с предлагаемым максимальным измерением и альфа-уровнем. Если эти данные приемлемы, закройте окно, чтобы вернуться к вкладке P of R, где теперь будет обрезаться взаимный участок пространства, чтобы соответствовать предложенного максимальному диапазону. Выберите более модель и нажмите фон, чтобы установить уровень альфа и максимальное измерение предлагаемых значений из всплывающего окна.Нажмите уточнить. Откроется участок перекрестной проверки, показывающий, должны ли какие-либо точки быть отклонены, как указано красным цветом. Если есть только несколько отклоненных точек и распределение выглядит хорошо, то модель хорошая.Вы распечатаете отчет во вкладке анализа. Слева нажмите, чтобы выделить образец и нажмите правой кнопкой мыши на имя образца. Выберите отчет о создании из единого набора данных.Откроется текстовый ящик для комментариев, а также будет подготовлен документ PDF с указанием всех полученных цифр и значений. В этом репрезентативном анализе, E9 ДНК полимеразы экзонуклеазы минус мутант был связан с ДНК и запустить с помощью размера исключения хроматографии малого угла рентгеновского рассеяния. Были отмечены два пика.Первый большой пик представляет собой экзонуклеазу E9 DNA polymerase минус комплекс ДНК мутантов. А второй указывает на нескоее состояние. В то время как классический подход к выбору кадров обеспечивает стабильный радиус gyration комплекса в первом пике, второй пик явно сливается и радиус gyration по всему участку показывает, что второй пик интереса не имеет стабильного радиуса gyration из-за кросс-пик загрязнения.В этом анализе можно было использовать только пять кадров, которые показывали полустихуляцию радиуса гирации. При вычитании, они дали радиус gyration 36.3 ангстремов. Когда пики были деконволюции с помощью EFA, соответствующая кривая для второго пика была наложена с оригиналом, показывая явное снижение сигнала к шуму и нижний радиус gyration 34.1 ангстремов.Крацкий участок данных показывает, что комплекс с запутанным пиком более шаровой, что подтверждается кривой PR, которая дает максимальное измерение 108,5 ангстремов для деконволютной кривой. Недеконволизованные данные для этого анализа более удлиненные с максимальным измерением 120 ангстремов, скорее всего, из-за неоднородности, вытекая из несвоездной полимеразы E9 минус экзонуклеазы мутанта. Наиболее важными шагами являются выбор значений и диапазона используемых данных, поскольку они в значительной степени влияют на точность деконволюции.Результаты не следует принимать сами по себе, а следует дополнительно оценивать с использованием дополнительных методов, таких, как аналитическая центрифугация или рассеяние многоугольного лазерного света, с тем чтобы обеспечить их биологическую интерпретацию. В строке колонки в сочетании SAXS в сочетании с деконволюцией и удобный интерфейс, как программа Scatter предоставляет мощный пакет для обеспечения значимых структурных данных даже из внутренне сложных систем.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Производство, Кристаллизация и структура Определение<em&gt; C. несговорчивый</em&gt; PPEP-1 с помощью Microseeding и цинк-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Очищение протеина анаэробных и кинетический анализ через электрод кислорода для изучения DesB Dioxygenase деятельность и ингибирование

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Полностью автономные характеристика и сбора данных от кристаллов биологических макромолекул

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Использование трубопровода MALDI TOF-MS IDBac с открытым исходным кодом для анализа микробного белка и специализированных метаболитных данных

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Изучение метаболизма шести системных инсектицидов в недавно созданной культуре подвески клеток, полученных из чая(Камелия Sinensis L.) Листья

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Возмущение эндотелиальной биомеханики через Connexin 43 Структурные нарушения

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Пример ы подготовки к протеомики объекта представления и последующего анализа данных

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Сбор последовательных данных с фиксированной целью на алмазном источнике света

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Протеомный профиль EPS-Urine через FASP пищеварение и независимый анализ данных

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...