Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Vi erkänner det ekonomiska stödet till projektet från det franska bidraget REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 och genom forskningsanslag från Service de Santé des Armées och Délégation Générale pour l'Armement. Vi är tacksamma mot ESRF för SAXS-stråltiden. Detta arbete använde plattformarna av Grenobleen Instruera-ERIC centrerar (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) inom Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB), med stöd av FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) och GRAL, finansieras inom universitetet Grenoble Alpes forskarskola (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0003). IBS erkänner integrationen i det tvärvetenskapliga forskningsinstitutet i Grenoble (IRIG, CEA). Vi tackar Wim P. Burmeister och Frédéric Iseni för ekonomiskt och vetenskapligt stöd och vi tackar även Dr Jesse Hopkins från BioCAT vid APS för hans hjälp och för att utveckla BioXTAS RAW.

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+SAXS+versatility:+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture,+functional+landscapes,+and+integrative+structural+biology.">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li><li>Gr&#228;wert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+(SAXS).">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li><li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li><li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline.">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li><li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis.">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li><li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberb&#252;hler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III:+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations.">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li><li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).</li><li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding.">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li><li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+(US-SOMO)+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite.">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li><li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering.">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li><li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioXTAS+RAW:+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis.">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li><li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks.">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li><li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers.">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Det är önskat att ha en monodisperse prov innan du startar ett SAXS experiment, men i verkligheten, många datainsamlingar inte uppfyller detta och måste förbättras genom att kombinera mätningen med inline kromatografi-SEK i de flesta fall. Men även bristen på tid mellan rening och datainhämtning monodispersity av provet är inte garanterat. Vanligast gäller detta experiment där komponenter är för nära i storlek eller i sina fysiska egenskaper för att separeras eller är benägna att snabb dynamik. Här har vi lämnat ett protokoll som kombinerar ett värde nedbrytning med utvecklande faktor analys för att ta bort påverkan av DNAbound E9 exominus från dess obundna skapa en monodisperse spridning profil som vi sedan kunde analysera med SAXS paketet Scatter IV.
SVD med EFA av SEC-SAXS-data är mycket kraftfulla metoder som utvecklats för att dekonvolera SAXS-data och förbättra analysen, men de har begränsningar. De kräver att buller eller avdrift i bufferten baslinjen för SEC-SAXS hålls till ett minimum. Detta kan innebära extra kolumn jämvikt (bättre att använda mer än 3 kolumn volymer, beroende på buffert) innan prov lastning. Det mest kritiska steget är dock valet av antalet singularvärden och det dataintervall som används, eftersom detta i hög grad kommer att påverka deconvolutionens riktighet. Det är av denna anledning som resultaten inte bör tas på egen hand utan ytterligare analyseras med hjälp av tekniker som analytiska ultracentrifugering (AUC) eller multi-vinkel-laser-ljus-spridning (MALLS) för biologisk tolkning.
Scatter IV är ett nytt, programpaket, gratis för forskning och industriell användning med ett intuitivt användargränssnitt som gör att även icke-experter kan analysera sina data. Scatter IV har flera nya funktioner som bidrar till att förbättra analysen av SEC-SAXS-data, till exempel värmekartan kopplad till signaltomten, vilket möjliggör större noggrannhet med val av val av ram. I primära dataanalys, Guinier Peak analys och korsvalidering tomten i samband med P(r) analys erbjuder en integrerad felsökning förmåga i programvaran.
Det bör nämnas att många andra program kan användas för primärdataanalys; dessa innehåller samma grundläggande funktioner och uppdateras också regelbundet såsom BioXTAS RAW17 ATSAS paket24 och US-SOMO15 för att nämna några.
Men oavsett vilket SAXS-paket som används för analys, är de stora begränsningarna vanliga: provberedningen, före insamling och analys. I E9 exominus exempel visas, är det tydligt att se förbättringen av förhållandet signal till brus och med en minskning av Rg den dmax i samband med en monodisperse prov. Detta kommer i hög grad att bidra till ytterligare behandling av uppgifterna såsom montering eller modellering med kända högupplösta strukturer.

Biologiska makromolekyler är för små för att ses även med de bästa ljusmikroskopen. Nuvarande metoder för att bestämma sina strukturer innebär i allmänhet kristallisera protein eller mätningar på stort antal identiska molekyler samtidigt. Medan kristallografi ger information om atomnivå, representerar det en konstgjord provmiljö, med tanke på att de flesta makromolekyler inte presenteras i en kristallin form i cellen. Under de senaste åren cryo-elektronmikroskopi levererade liknande högupplösta strukturer av stora makromolekyler / makromolekylära komplex, men även om proverna är närmare fysiologiskt tillstånd, de är fortfarande frysta, därav orörliga och statiska. Bio-small vinkelröntgenspridning (BioSAXS) ger en strukturell mätning av makromolekylen, under förhållanden som är relevanta för biologi. Detta tillstånd kan visualiseras som en låg upplösning 3D-form bestäms på nanometer skala och fångar hela konformational utrymme av makromolekylen i lösning. BioSAXS experiment bedömer effektivt oligomeriska tillstånd, domän och komplexa arrangemang samt flexibilitet mellandomänerna 1,2,3. Metoden är korrekt, mestadels icke-förstörande och kräver vanligtvis endast ett minimum av provberedning och tid. För bästa tolkning av uppgifterna behöver dock proverna vara monodisperse. Detta är utmanande; biologiska molekyler är ofta mottagliga för föroreningar, dålig rening och aggregering, till exempel från frys upptining4. Utvecklingen av inlinekromatografi följt av omedelbar SAXS-mätning hjälper till att mildra dessa effekter. Storlek-uteslutande kromatografi separerar proverna efter storlek så utesluter de flesta föroreningar och aggregeringar5,6,7,8,9,10. Men i vissa fall även SEC-SAXS är inte tillräcklig för att producera en monodisperse prov, eftersom blandningen kan bestå av komponenter som är för nära i storlek eller deras fysiska egenskaper eller deras snabba dynamik leda till överlappande toppar i SEC UV-spår. I dessa fall kan ett programvarubaserat deconvolution-steg av de erhållna SAXS-data leda till en idealiserad SAXS-kurva för den enskildakomponenten 5,11,12. Som ett exempel, i protokoll avsnitt 2, visar vi standard SEC-SAXS analys av vaccinia E9 DNA-polymeras exonuclease minus mutant (E9 exominus) i komplex med DNA. Vaccinia representerar modellorganismen hos Poxviridae, en familj som innehåller flera patogener, till exempel humant smittkoppsvirus. Polymerasen visade sig binda tätt till DNA i biokemiska metoder, med strukturen av komplexet nyligen löst genom röntgenkristallografi13.
De flesta synkrotronanläggningar kommer att ge en automatiserad databehandlingspipeline som kommer att utföra data normalisering och integration producerar en uppsättning av oskickade ramar. Men det tillvägagångssätt som beskrivs i detta manuskript kan också användas med en labbkälla förutsatt att SEC-SAXS utförs. Vidare kan ytterligare automatisering finnas tillgänglig som kommer att avvisa strålningsskadade ramar och utföra bufferten subtraktion14. Vi kommer att visa hur man utför primärdataanalys på förbelagade data och får ut det mesta av tillgängliga data i avsnitt 2.
I avsnitt 3 visar vi hur man dekonvolerar SEC-SAXS-data och analyserar kurvorna effektivt. Medan det finns flera deconvolution metoder såsom Gaussiska topp deconvolution, genomförs i US-SOMO15 och Guinier optimerad maximal sannolikhet metod, genomförs i DELA programvara16, dessa kräver i allmänhet en modell för toppform12. Den ändliga storleken på enskilda toppar vi undersöker tillåter användning av evolverande faktoranalys (EFA), som en förbättrad form av singular värdeförmultning (SVD) för att dekonvolutera överlappande toppar, utan att förlita sig på toppformen eller spridningsprofilen5,11. En SAXS-specifik implementering finns i BioXTAS RAW17. EFA användes först på kromatografidata när 2D-diodmatrisdata tillät att matriser bildades från absorbans mot retentionstid och våglängdsdata18. Där EFA utmärker sig är att det fokuserar på den föränderliga karaktären av singularvärden, hur de förändras med utseendet på nya komponenter, med förbehållet att det finns en inneboende ordning iförvärvet 10. Lyckligtvis ger SEC-SAXS-data alla nödvändiga beställda förvärvsdata i organiserade 2D-datamatriser, utlåning sig fint till EFA-tekniken.
I avsnitt 4 kommer vi att visa grunderna för modelloberoende SAXS-analys från buffert-bakgrund subtraherade SAXS-kurvan. Modelloberoende analys bestämmer partikelns radie-av-gyration (Rg), volym-av-korrelation (Vc), Porod Volym (Vp), och Porod-Debye Exponent (PE). Analysen ger en semi-kvantitativ bedömning av partikelns termodynamiska tillstånd vad gäller kompakthet eller flexibilitet via den dimensionslösa Kratky-tomten2,4,19.
Slutligen, SAXS data mäts i ömsesidiga rymdenheter och vi kommer att visa hur man omvandlar SAXS-data till real-space för att återställa par-avstånd, P(r), fördelningsfunktion. P(r)-fördelningen är uppsättningen av alla avstånd som finns inom partikeln och inkluderar partikelns maximala dimension, dmax. Eftersom detta är en termodynamisk mätning, representerar P(r)-fördelningen det fysiska utrymme som upptas av partiklarnas konformationsutrymme. Korrekt analys av en SAXS-datauppsättning kan ge lösning-tillstånd insikter som kompletterar högupplöst information från kristallografi och cryo-EM.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS är en populär teknik som används inom molekylär- och strukturbiologi för att bestämma lösningsstruktur, partikelstorlek och -form, yt-till-volym-förhållande och konformationsförändringar av makromolekyler och makromolekylära komplex. En hög kvalitet SAXS-datauppsättning för strukturell modellering måste vara från monodisperse, homogena prover och detta nås ofta endast genom en kombination av inlinekromatografi och omedelbar SAXS-mätning. Oftast används storleksutesläckningskromatografi för att separera prover och utesluta föroreningar och aggregeringar från den partikel av intresse som gör att SAXS-mätningar kan göras från en väl löst kromatografisk topp av en enda proteinart. Fortfarande, i vissa fall, även inline rening är inte en garanti för monodisperse prover, antingen för att flera komponenter är för nära varandra i storlek eller förändringar i form inducerad genom bindande ändra upplevd elution tid. I dessa fall kan det vara möjligt att dekonvolera SAXS-data av en blandning för att få de idealiserade SAXS kurvor av enskilda komponenter. Här visar vi hur detta uppnås och den praktiska analysen av SEC-SAXS-data utförs på ideala och svåra prover. Specifikt visar vi SEC-SAXS analys av vaccinia E9 DNA polymeras exonuclease minus mutant.

Fördelen med att använda deconvolution över klassisk ram urval13 är att ta bort påverkan av arter på varandra, producerar en monodisperse spridning signal. Detta följs också ofta med en bättre signal till brusförhållande. När E9 exominus är bunden till DNA och körs med hjälp av SEC-SAXS observeras två toppar (bild 1). Den första, stora toppen (ungefär bildrutor 420\u2012475) är E9 exominus-DNA-komplexet det andra (ungefär bildrutor 475\u2012540), det obundna tillståndet (se Tilläggsdata: Bild 2). Medan den klassiska metoden att välja ramar ger en stabil Rg av komplexet i den första toppen (se Kompletterande Data: Figur 3), den andra toppen är tydligt samman och Rg över tomten visar att den andra toppen av intresse inte har en stabil Rg, på grund av korstopp förorening. Endast 5 bildrutor kunde användas som visade en halvstabil Rg, när de subtraherades gav de en Rg = 36,3 Å (Figur 2, grön). När topparna deconvoluted med hjälp av EFA motsvarande kurvan för den andra toppen (Figur 2, blå) var överlagrad med den ursprungliga och visade en tydlig minskning av signal till buller, och en lägre Rg, 34,1 Å spelades in. Kratky plot (Figur 3) visar komplexet med deconvoluted topp (blå) är mer klotformig. Detta bekräftas av P(r)-kurvan (figur 4) som ger en dmax 108,5 Å för deconvoluted kurvan (blå) medan den icke-deconvoluted är mer avlång med en dmax 120 Å (grön), detta beror troligtvis på heterogenitet som härrör från den obundna E9 exominus.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> Bild 1: Signaltomt av E9 exominus ensam och med DNA i komplex. Den övre panelen visar en tomt av integralförhållandet till bakgrunden för varje bildruta i en SEC-SAXS-körning (ljusblå). De röda punkterna visar Rg vid varje bildruta över toppen. Den nedre panelen visar motsvarande värme karta som visar rester för varje ram färgade enligt Durbin-Watson auto-korrelation analys, regioner med hög likhet är färgade cyan medan olika ramar följa mörkare blues till pinks och slutligen till rött beroende på svårighetsgraden av olikhet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> Bild 2: Tomt på intensitet kontra spridningsvektor. En överlagring av de subtraherade SAXS-datan bildar E9 exominus . I gröna 5-ramar (ram 517\u2012522) medelvärdet och subtraheras från ett område med halvstabila Rg och i blått den representativa spridningskurvan som härrör från EFA-deconvolutionen av SEC-SAXS-toppen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> Bild 3: Dimensionslös Kratkykurva. Överlagring av deconvoluted (blå) och icke-deconvoluted (grön) Kratky kurva visar E9 exominus är klotformig. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> Bild 4: P(r)-kurva. Överlagringen av de deconvoluted (blå) och icke-deconvoluted (grön) kurvor för E9 exominus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Kompletterande Data. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Vänligen klicka här för att ladda ner den här filen</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

SEC-BioSAXS-mätningar av biologiska makromolekyler är ett standardansats för bestämning av lösningsstruktur hos makromolekyler och deras komplex. Här analyserar vi SEC-BioSAXS data från två typer av vanligt påträffade SEC-spår-kromatogram med helt lösta och delvis lösta toppar. Vi demonstrerar analysen och deconvolutionen med hjälp av scatter och BioXTAS RAW.

Analys av SEC-SAXS-data via EFA-deconvolution och Scatter

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Biologisk småvinkelröntgenspridning ger strukturella mätningar av makromolekyl- och makromolekylära komplex. Helst bör det prov som skall mätas vara monodisperserat. Även om i vissa fall, storlek uteslutning kromatografi SAXS är inte tillräcklig för att producera monodispersity, en programvarubaserad deconvolution av SAXS data kan utföras för att producera en idealiserad SAXS kurva.Efter detta protokoll kan ett deconvolution-program och det användarvänliga Scatter-programmet användas för att analysera Vaccinia-viruset DNA-polymeras exominus mutanter. Om du vill utföra en subtraktion i bakgrunden av storlekens undantagskromatografidata öppnar du det Java-baserade Scatter 4-programmet och öppnar fliken SEC. Dra och släpp de reducerade datafilerna i drop-data under fönstret och klicka på utdatakatalogknappen och öppna för att ställa in utdatakatalogen som data ska sparas i.Ange exempelnamnet i rutan spara som och klicka på spårning. Klicka på knappen redigera detaljer för att redigera de experimentella detaljerna och fylla i lämpliga fält. Om du vill markera buffertramarna manuellt klickar du på Ange buffertar.Vänsterklicka och dra om du vill välja bufferten som en platt på spårkurvan före den tomrumvolym av kolumnen för storleksutestängningskromatografi med ungefär 100 bildrutor och klicka på ange buffert och uppdatera för att beräkna om SEC-filen. Vänsterklicka och dra för att välja en region av intresse på signalen tomt och vänster-klicka och dra hårkorset i värmekartan tomten för att välja zoom och delmängd av ramar som kommer att användas för sammanslagning. Med ett annat vänsterklick, markera ramar i värme kartan motsvarar området längst ner till höger på hårkorset.Helst bör ramen markera en region med en övervägande cyan färg och en stabil radie av gyration. När du är nöjd med de markerade bildrutorna klickar du på Sammanfoga för att sammanfoga de subtraherade bildrutorna och klicka på analysfliken för att visa informationen. För deconvolution av data, ladda datauppsättningen i deconvolution programmet.På kontrollpanelen under filer använder du mappsymbolen för att leta upp data och framhäva alla DAT-filerna. En tomt av integrerad intensitet kontra ram nummer kommer att dras i serien tomten. Klicka under fliken serie för att markera kurvan och för att öppna LC-analys popup-fönstret.Om du vill välja en lämplig buffertregion klickar du på Lägg till region för att välja ett område före kromatogrammets topp och ett efter lösningsmedlets front och klicka på set buffert. Popup-fönster kommer att indikera att ramar inte har valts för bakgrunden. För att starta EFA högerklickar du på den markerade filen och väljer EFA på menyn.I popup-fönstret ska datauppsättningens enda värde-nedbrytning observeras. I rutan kontroller kontrollerar du rutavärdena för användningsramar för att bekräfta att hela toppområdet för att dekonvolutera täcks i intensitetsritningen. Den singular värden tomten kommer att visa intensiteten av singularvärdena ovanför baslinjen.Om vänster och höger enda vektorer inte matchar, ändra den betydande singular vektorn nummer till två och flytta bildrutorna tills vänster och höger singular vektorer är liknande. EFA kommer att beräknas, generera tomter i riktningar framåt och bakåt för varje vektor och anger när komponenterna starta och avsluta lösningsprofilen för den valda storleken uteslutningskromatografi SAXS data. RAW kommer att försöka identifiera intervallen.Om det behövs använder du pilarna för att ändra intervallen så att varje cirkel är början på en böjningspunkt, som stiger från eller faller till baslinjen och klickar på nästa. För att minska eller eliminera piggar, identifiera ungefär vilken ram som motsvarar spiken med hjälp av intervallkontrollpilarna för att justera kontrollerna av komponentområdet. När en minsta Chi-kvadrat har uppnåtts klickar du tillbaka för att utföra en valideringskontroll.Om de ursprungliga EFA-observationsritningar fortfarande ser giltiga ut klickar du på nästa och sparar EFA-data för att spara observationsriterna. Klicka sedan på gjort för att stänga EFA-fönstret. Sedan i RAW-fönstret, öppna profiler i plottepanelen för att visa kurvorna.I fliken profiler på kontrollpanelen högerklickar du för att spara kurvorna som DAT-filer. För SAXS-bestämning öppnar du fliken för spridningsanalys och väljer G för att välja det manuella analysverktyget Guinier. I tomten, lägga till eller ta bort punkter så att rester inte har ett leende eller rynka pannan funktionen.De valda uppgifterna i Guinier-passningen bör inte överskrida den maximala kö som multiplicerats med en radie av gyrationsgränsen på 1,3. Klicka normaliserade Kratky. Den resulterande tomten ger en bedömning av det strukturella tillståndet för makromolekylen, klotformig, cylindrisk, oordnad, normaliserade för massa och koncentration.Klicka på korrelationsvolym. Den totala spridda intensiteten och en integrerad yta av den totala spridda intensiteten som en funktion av Q-tomter kommer att visas som en snabbreferens för att validera kvaliteten på spridningskurvan. Starta flexibilitetsanalysen genom att klicka på flexibilitet.Varje panel i popup fönstret kommer att visa en tomt utnyttja en makt lag relation som finns mellan den kompakta och avlånga flexibla biopolymerer. Använd skjutreglaget längst ned i rutan om du vill ändra vyn för data tills en platå i någon av tomterna har nåtts. Omedelbart efter att ha utfört en flexibilitetsanalys klickar du på volym.En popup av tre grafer kommer att genereras. Porod-Debye-tomten spårar där reglaget från flexibilitetstomten lämnades och visar de platåerade områdesdata. För att beräkna partikelns volym flyttar du start- och slutpunkterna tills den blå linjen på tomten passar den platåerade regionen.För ett opartiskt resultat, bör rester i Porod-Debye exponent makt lag passar visar inget mönster. Under fliken P av R kan den verkliga rymdfördelningen och spridningskurvan för provet observeras. Helst bör fördelningen kurvan vara slät utan vågor och bör bara försiktigt röra x-axeln.Högerklicka på provets namn och klicka på hitta DMAX för att öppna ett nytt fönster. Gränserna för den maximala dimensionen är förinställda med det föreslagna maximala Q-intervallet, de maximala datapunkterna som ska användas för beräkningen, de nedre och övre maxmåttgränserna och en lägre och övre alfapoäng. Klicka på start.En sammansatt fördelning kommer att skapas tillsammans med en förest maximal dimension och alfanivå. Om dessa data är godtagbara stänger du fönstret för att återgå till fliken P av R där den ömsesidiga utrymmesyten nu kommer att beskäras för att matcha det föreslagna maximala Q-intervallet. Välj den mer modellen och klicka bakgrund för att ställa alfanivå och maximal dimension till de föreslagna värdena från popup rutan.Klicka på förfina. En korsvalideringsrit kommer att öppnas, som visar om några punkter måste avvisas enligt rött. Om det bara finns några få avvisade punkter och fördelningen ser bra ut, då modellen är bra.Du ska skriva ut en rapport i analysfliken. Vänsterklicka för att markera provet och högerklicka på provnamnet. Välj skapa rapport från den enstaka datauppsättningen.En textruta kommer att öppnas för att tillåta kommentarer och ett PDF-dokument kommer att produceras som visar alla de siffror och värden som genereras. I denna representativa analys, E9 DNA polymeras exonuclease minus mutant var bunden till DNA och köra med hjälp av storlek uteslutning kromatografi liten vinkel röntgenspridning. Två toppar observerades.Den första stora toppen representerar E9 DNA-polymeras exonuclease minus mutant DNA-komplex. Och den andra indikerar det obundna tillståndet. Medan den klassiska metoden att välja ramar ger en stabil radie av gyration av komplexet i den första toppen, är den andra toppen tydligt samman och radien av gyration över tomten visar att den andra toppen av intresse inte har en stabil radie av gyration på grund av korstopp förorening.I denna analys kunde endast fem ramar användas som visade en halvstabil radie av gyration. När subtraheras, gav de en radie av gyration av 36,3 ångström. När topparna deconvoluted med hjälp av EFA, var motsvarande kurvan för den andra toppen överlagrad med den ursprungliga, visar en tydlig minskning av signalen till buller och lägre radie av gyration av 34,1 ångström.En Kratky tomt av uppgifterna visar att komplexet med invecklade topp är mer klotformig som bekräftas av PR-kurvan som ger en maximal dimension av 108,5 ångströms för deconvoluted kurvan. De icke-deconvoluted data för denna analys är mer avlånga med en maximal dimension av 120 ångström, troligen på grund av heterogeniteten som härrör från den obundna E9 polymeras minus exonuclease mutant. De mest kritiska stegen är att välja de unika värdena och det dataintervall som används eftersom dessa i hög grad påverkar deconvolutionens noggrannhet.Resultaten bör inte tas på egen hand, utan vidare bedömas med hjälp av ytterligare tekniker såsom analytisk centrifugation eller flervinkellaserljusspridning för att tillåta deras biologiska tolkning. In-line kolumn-kopplade SAXS i kombination med deconvolution och ett användarvänligt gränssnitt som programmet Scatter ger är ett kraftfullt paket för att ge meningsfulla strukturella data även från inneboende svåra system.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Produktion, Kristallisering och strukturbestämning av<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-en via Microseeding och zink-SAD

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerob Protein rening och kinetiska analys via syre elektrod för att studera DesB dioxygenas aktivitet och hämning

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Helt självständigt karakterisering och datainsamling från kristaller av biologiska makromolekyler

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Med öppen källkod MALDI TOF-MS IDBac pipeline för analys av mikrobiellt protein och specialiserade Metabolitdata

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Studie om metabolismen av sex systemiska insekticider i en nyetablerad cell SUS pension kultur härledd från Tea (Camellia sinensis L.) Lämnar

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Perturbing endotelial biomekanik via Connexin 43 strukturella störningar

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

TMT Provberedning för Proteomics Facility Submission och efterföljande dataanalys

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Seriell datainsamling med fast mål vid Diamond Light Source

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

Proteomisk profil av EPS-urin genom FASP-matsmältning och dataoberoende analys

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...