Name: analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter
Uploaded: 2021-01-28T13:30:00
Duration: 10 min 59 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Fransız hibe REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 ve Service de Santé des Armées ve Délégation Générale pour l'Armement araştırma hibe tarafından proje için mali destek kabul ediyoruz. Biz SAXS ışın süresi için ESRF müteşekkiriz. Bu çalışma Grenoble Instruct-ERIC merkezi (ISBG; UMS 3518 CNRS-CEA-UGA-EMBL) Grenoble Partnership for Structural Biology (PSB) içinde, FRISBI (ANR-10-INBS-05-02) ve GRAL tarafından desteklenen, University Grenoble Alpes graduate school (Ecoles Universitaires de Recherche) CBH-EUR-GS (ANR-17-EURE-0000) bünyesinde finanse edilmektedir. IBS, Grenoble Disiplinlerarası Araştırma Enstitüsü'ne (IRIG, CEA) entegre olduğunu kabul eder. Wim P. Burmeister ve Frédéric Iseni'ye finansal ve bilimsel destek için teşekkür ediyor ve biocat'ten Dr. Jesse Hopkins'e yardımları ve BioXTAS RAW'ı geliştirmeleri için teşekkür ediyoruz.

<ol>
	<li>Pelikan, M., Hura, G., Hammel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+flexibility+within+proteins+as+identified+through+small+angle+X-ray+scattering.">Structure and flexibility within proteins as identified through small angle X-ray scattering.</a> General Physiology and Biophysics. 28 (2), 174-189 (2009).</li><li>Brosey, C. A., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+SAXS+versatility:+solution+X-ray+scattering+for+macromolecular+architecture,+functional+landscapes,+and+integrative+structural+biology.">Evolving SAXS versatility: solution X-ray scattering for macromolecular architecture, functional landscapes, and integrative structural biology.</a> Current Opinion in Structural Biology. 58, 197-213 (2019).</li><li>Gr&#228;wert, M., Svergun, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+beginner's+guide+to+solution+small-angle+X-ray+scattering+(SAXS).">A beginner's guide to solution small-angle X-ray scattering (SAXS).</a> The Biochemist. 42 (1), 36-42 (2020).</li><li>Putnam, C. D., Hammel, M., Hura, G. L., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-ray+solution+scattering+(SAXS)+combined+with+crystallography+and+computation:+defining+accurate+macromolecular+structures,+conformations+and+assemblies+in+solution.">X-ray solution scattering (SAXS) combined with crystallography and computation: defining accurate macromolecular structures, conformations and assemblies in solution.</a> Quarterly reviews of biophysics. 40 (03), 191-285 (2007).</li><li>Meisburger, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Domain+Movements+upon+Activation+of+Phenylalanine+Hydroxylase+Characterized+by+Crystallography+and+Chromatography-Coupled+Small-Angle+X-ray+Scattering.">Domain Movements upon Activation of Phenylalanine Hydroxylase Characterized by Crystallography and Chromatography-Coupled Small-Angle X-ray Scattering.</a> Journal of the American Chemical Society. 138 (20), 6506-6516 (2016).</li><li>Brennich, M. E., Round, A. R., Hutin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+Size-exclusion+and+Ion-exchange+Chromatography+on+a+SAXS+Beamline.">Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline.</a> Journal of Visualized Experiments. (119), e54861 (2017).</li><li>Watanabe, Y., Inoko, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-exclusion+chromatography+combined+with+small-angle+X-ray+scattering+optics.">Size-exclusion chromatography combined with small-angle X-ray scattering optics.</a> Journal of Chromatography A. 1216 (44), 7461-7465 (2009).</li><li>Graewert, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+Pipeline+for+Purification,+Biophysical+and+X-Ray+Analysis+of+Biomacromolecular+Solutions.">Automated Pipeline for Purification, Biophysical and X-Ray Analysis of Biomacromolecular Solutions.</a> Scientific reports. 5, (2015).</li><li>David, G., P&#233;rez, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+sampler+robot+and+high-performance+liquid+chromatography:+a+fully+automated+system+for+biological+small-angle+X-ray+scattering+experiments+at+the+Synchrotron+SOLEIL+SWING+beamline.">Combined sampler robot and high-performance liquid chromatography: a fully automated system for biological small-angle X-ray scattering experiments at the Synchrotron SOLEIL SWING beamline.</a> Journal of applied crystallography. 42 (5), 892-900 (2009).</li><li>Ryan, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+optimized+SEC-SAXS+system+enabling+high+X-ray+dose+for+rapid+SAXS+assessment+with+correlated+UV+measurements+for+biomolecular+structure+analysis.">An optimized SEC-SAXS system enabling high X-ray dose for rapid SAXS assessment with correlated UV measurements for biomolecular structure analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 51 (1), 97-111 (2018).</li><li>Gampp, H., Maeder, M., Meyer, C. J., Zuberb&#252;hler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calculation+of+equilibrium+constants+from+multiwavelength+spectroscopic+data-III:+Model-free+analysis+of+spectrophotometric+and+ESR+titrations.">Calculation of equilibrium constants from multiwavelength spectroscopic data-III: Model-free analysis of spectrophotometric and ESR titrations.</a> Talanta. 32 (12), 1133-1139 (1985).</li><li>Maeder, M., Neuhold, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Practical Data Analysis in Chemistry. , (2007).</li><li>Tarbouriech, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+vaccinia+virus+DNA+polymerase+structure+provides+insights+into+the+mode+of+processivity+factor+binding.">The vaccinia virus DNA polymerase structure provides insights into the mode of processivity factor binding.</a> Nature Communications. 8 (1), (2017).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), (2016).</li><li>Brookes, E., Rocco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+the+UltraScan+SOlution+MOdeller+(US-SOMO)+hydrodynamic+and+small-angle+scattering+data+analysis+and+simulation+suite.">Recent advances in the UltraScan SOlution MOdeller (US-SOMO) hydrodynamic and small-angle scattering data analysis and simulation suite.</a> European Biophysics Journal. 47 (7), 855-864 (2018).</li><li>Malaby, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+analysis+of+size-exclusion+chromatography-small-angle+X-ray+scattering+and+reconstruction+of+protein+scattering.">Methods for analysis of size-exclusion chromatography-small-angle X-ray scattering and reconstruction of protein scattering.</a> Journal of Applied Crystallography. 48 (4), 1102-1113 (2015).</li><li>Hopkins, J. B., Gillilan, R. E., Skou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BioXTAS+RAW:+improvements+to+a+free+open-source+program+for+small-angle+X-ray+scattering+data+reduction+and+analysis.">BioXTAS RAW: improvements to a free open-source program for small-angle X-ray scattering data reduction and analysis.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (5), 1545-1553 (2017).</li><li>Maeder, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolving+factor+analysis+for+the+resolution+of+overlapping+chromatographic+peaks.">Evolving factor analysis for the resolution of overlapping chromatographic peaks.</a> Analytical Chemistry. 59 (3), 527-530 (1987).</li><li>Durand, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADPH+oxidase+activator+p67phox+behaves+in+solution+as+a+multidomain+protein+with+semi-flexible+linkers.">NADPH oxidase activator p67phox behaves in solution as a multidomain protein with semi-flexible linkers.</a> Journal of Structural Biology. 169 (1), 45-53 (2010).</li><li>De Maria Antolinos, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ISPyB+for+BioSAXS,+the+gateway+to+user+autonomy+in+solution+scattering+experiments.">ISPyB for BioSAXS, the gateway to user autonomy in solution scattering experiments.</a> Acta Crystallographica Section D. 71 (1), 76-85 (2015).</li><li>Brennich, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Online+data+analysis+at+the+ESRF+bioSAXS+beamline,+BM29.">Online data analysis at the ESRF bioSAXS beamline, BM29.</a> Journal of Applied Crystallography. 49 (1), 203-212 (2016).</li><li>Kirby, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+radiation+dose+efficiency+in+solution+SAXS+using+a+sheath+flow+sample+environment.">Improved radiation dose efficiency in solution SAXS using a sheath flow sample environment.</a> Acta Crystallographica Section D Structural Biology. 72 (12), 1254-1266 (2016).</li><li>Rambo, R. P., Tainer, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterizing+flexible+and+intrinsically+unstructured+biological+macromolecules+by+SAS+using+the+Porod-Debye+law.">Characterizing flexible and intrinsically unstructured biological macromolecules by SAS using the Porod-Debye law.</a> Biopolymers. 95 (8), 559-571 (2011).</li><li>Franke, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATSAS+2.8:+a+comprehensive+data+analysis+suite+for+small-angle+scattering+from+macromolecular+solutions.">ATSAS 2.8: a comprehensive data analysis suite for small-angle scattering from macromolecular solutions.</a> Journal of Applied Crystallography. 50 (4), 1212-1225 (2017).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Bir SAXS deneyine başlamadan önce monodisperse numuneye sahip olmak istenir, ancak gerçekte birçok veri toplama sı bunu karşılamaz ve çoğu durumda ölçüyü sıralı kromatografi-SEC ile birleştirerek geliştirilmelidir. Ancak, numunenin saflaştırılması ve veri toplama monodispersitliği arasındaki zaman sıkıntısı bile garanti edilmez. En yaygın olarak, bu, bileşenlerin boyut olarak çok yakın olduğu veya fiziksel özelliklerinin ayrılamayacağı veya hızlı dinamiklere yatkın olduğu denemeler için geçerlidir. Burada, dnabound E9 exoeksisinin sınırsız formundan etkisini ortadan kaldırmak için tek değer ayrışmasını gelişen faktör analiziyle birleştiren bir protokol sağladık ve daha sonra SAXS paketi Scatter IV ile analiz edebildiğimiz bir monodisperse saçılma profili oluşturduk.
SEC-SAXS verilerinin EFA ile SVD savolute SAXS verileri deconvolute ve analiz geliştirmek için geliştirilen çok güçlü yöntemler, ancak sınırlamalar var. Sec-SAXS'ın tampon taban çizgisindeki gürültü veya sürüklenme nin minimumda tutulmasını gerektirir. Bu, örnek yüklemeden önce ekstra sütun dengelemesi (arabelleğe bağlı olarak 3 sütundan daha fazla birim kullanmak daha iyi) içerebilir. Ancak, en kritik adım tekil değerlerin sayısının seçimi ve kullanılan veri aralığıdır, çünkü bu dekonvolutionun doğruluğunu büyük ölçüde etkileyecektir. Bu nedenle sonuçlar kendi başlarına alınmamalı, biyolojik yorumlama için analitik ultracentrifugation (AUC) veya çok açılı lazer-ışık saçılımı (MALLS) gibi teknikler kullanılarak daha fazla analiz edilmelidir.
Scatter IV, uzman olmayanların bile verilerini analiz etmelerine olanak tanıyan sezgisel bir kullanıcı arabirimi ile araştırma ve endüstriyel kullanım için ücretsiz yeni bir yazılım paketidir. Scatter IV, sinyal çizimine bağlı ısı haritası gibi SEC-SAXS verilerinin analizini geliştirmeye yardımcı olan birkaç yeni özelliğe sahiptir ve çerçeve seçiminde daha fazla doğruluk sağlar. Birincil veri analizinde, Guinier Peak analizi ve P(r) analiziyle ilişkili çapraz doğrulama çizimi yazılımda entegre bir sorun giderme yeteneği sunar.
Birincil veri analizi için başka birçok programın kullanılabileceğini belirtmek gerekir; bunlar aynı temel özellikleri içerir ve bioxtas RAW17 ATSAS paketi24 ve US-SOMO15 gibi düzenli olarak güncellenmektedir.
Ancak analiz için hangi SAXS paketinin kullanıldığına bakılmaksızın, temel sınırlamalar yaygındır: toplama ve analizden önce numune hazırlama. Gösterilen E9 eknoeksi örneğinde, sinyalin gürültü oranına doğru iyileşmesini ve Rg'deki bir azalmayla monodisperse numuneyle ilişkili dmax'i görmek açıktır. Bu büyük ölçüde bilinen yüksek çözünürlüklü yapılar ile uydurma veya modelleme gibi verilerin daha fazla işlenmesine yardımcı olacaktır.

Biyolojik makromoleküller en iyi ışık mikroskoplarıyla bile görülemeyecek kadar küçüktür. Yapılarını belirlemek için kullanılan mevcut yöntemler genellikle proteinin kristalize olmasını veya aynı anda çok sayıda özdeş molekül üzerinde ölçüm yapmayı içerir. Kristalografi atomik seviye hakkında bilgi sağlarken, makromoleküllerin çoğunun hücrede kristal bir formda sunulmadığı göz önüne alındığında yapay bir örnek ortamı temsil eder. Son birkaç yıl boyunca kriyo-elektron mikroskobu büyük makromoleküllerin / makromoleküler komplekslerin benzer yüksek çözünürlüklü yapılarını teslim etti, ancak örnekler fizyolojik duruma daha yakın olmasına rağmen, hala donmuş, dolayısıyla hareketsiz ve statiktir. Biyo-küçük açı X-ışını saçılma (BioSAXS) biyoloji ile ilgili koşullarda makromolekülün yapısal bir ölçüm sağlar. Bu durum nanometre ölçeğinde belirlenen düşük çözünürlüklü 3-B şekil olarak görselleştirilebilir ve çözeltideki makromolekülün tüm konformasyonal alanını yakalar. BioSAXS deneyleri verimli oligomerik durum, etki alanı ve karmaşık düzenlemeler yanı sıra etki alanları1,2,3arasındaki esnekliği değerlendirmek . Yöntem, çoğunlukla tahribatsız, doğru ve genellikle örnek hazırlanması ve zaman sadece en az gerektirir. Ancak, verilerin en iyi şekilde yorumlanması için, örneklerin monodisperse olması gerekir. Bu zor bir iştir; biyolojik moleküller genellikle kontaminasyonlara, kötü saflaştırma ve toplama yatkındır, örneğin donma çözülme4. Hemen SAXS ölçümü sonrasında sıralı kromatografinin geliştirilmesi bu etkilerin hafifletilemesine yardımcı olur. Boyut dışlama kromatografisi örnekleri boyuta göre ayırır ve böylece en çok kirletici madde ve toplama5,6,7,8,9,10hariç tutulur. Ancak, bazı durumlarda, hatta SEC-SAXS monodisperse örnek üretmek için yeterli değildir, karışım boyutu çok yakın bileşenler den oluşabilir veya fiziksel özellikleri veya hızlı dinamikleri SEC UV iz örtüşen zirvelere yol açabilir. Bu gibi durumlarda, elde edilen SAXS verilerinin yazılım tabanlı bir dekonvolution adımı tek tek bileşen5,11,12'ninidealize edilmiş SAXS eğrisine yol açabilir. Örnek olarak, protokol bölüm 2'de, vaccinia E9 DNA polimeraz eksonekleaz eksi mutant (E9 exoeksi)DNA ile kompleks standart SEC-SAXS analizini gösteriyoruz. Vaccinia Poxviridae model organizma temsil eder, çeşitli patojenler içeren bir aile, örneğin insan çiçek virüsü. Polimeraz biyokimyasal yaklaşımlardna sıkıca bağlamak için gösterilmiştir, karmaşık yapısı ile son zamanlarda X-ışını kristalografisi ile çözüldü13.
Çoğu senkron tesisleri, bir dizi alttan çıkarılmış çerçeve üreterek veri normalleştirme ve tümleştirme gerçekleştirecek otomatik bir veri işleme ardışık hattı sağlar. Ancak bu el yazmasında açıklanan yaklaşım, SEC-SAXS'ın gerçekleştirilmesi koşuluyla bir laboratuvar kaynağıile de kullanılabilir. Ayrıca, radyasyondan zarar görmüş çerçeveleri reddedecek ve tampon çıkarma14'ünicrasını sağlayacak ek otomasyon kullanılabilir. Önceden işlenmiş veriler üzerinde birincil veri çözümlemesi nasıl yapılacağını ve bölüm 2'deki mevcut verilerden en iyi şekilde nasıl çıkarılabiliyoruz.
Bölüm 3'te, SEC-SAXS verilerinin nasıl deconvolute yapılacağını ve eğrileri verimli bir şekilde nasıl analiz edebileceğimizi gösteriyoruz. Abd-SOMO15 ve Guinier optimize maksimum olasılık yöntemi, DELA yazılımı16uygulanan uygulanan Gaussian pik dekonvolution gibi çeşitli dekonvolution yöntemleri olsa da, bu genellikle tepe şekli 12 için bir model gerektirir12. Biz araştırıyoruz bireysel zirvelerin sonlu boyutu gelişen faktör analizi (EFA), tekil değer ayrışması gelişmiş bir formu olarak (SVD) tepe şekli veya saçılma profili5,11güvenmeden çakışan zirveleri deconvolute sağlar. BioXTAS RAW17'deSAXS'a özel bir uygulama bulunabilir. EFA ilk olarak kromatografi verilerinde 2D diyot dizilimi verilerinin bekletme süresine ve dalga boyu verilerine karşı absorbanstan matrislerin oluşmasına izin verdiğinde kullanılmıştır18. EFA'nın öne çıktığı nokta, tekil değerlerin gelişen karakterine odaklanmasıdır, yeni bileşenlerin görünümüyle nasıl değiştiklerine, satın alma10'dadoğal bir düzen olduğu ihtarına bağlıdır. Neyse ki, SEC-SAXS verileri organize 2B veri dizilerinde gerekli tüm sipariş edinimi verilerini sağlayarak, kendisini EFA tekniğine güzelbir şekilde ödünç vermektedir.
Bölüm 4'te, arabellek arka planı çıkarılan SAXS eğrisinden modelden bağımsız SAXS analizinin temellerini göstereceğiz. Modelden bağımsız analiz, parçacığın girdap yarıçapını (Rg), korelasyon hacmini (Vc), Porod Hacimli (Vp) ve Porod-Debye Üslerini (PE) belirler. Analiz boyutsuz Kratky arsa2,4,19ile kompaktlık veya esneklik açısından parçacık termodinamik durumunun yarı kantitatif bir değerlendirme sağlar.
Son olarak, SAXS verileri karşılıklı uzay birimlerinde ölçülür ve saxs verilerini çift uzaklık, P(r), dağıtım işlevini kurtarmak için gerçek uzaya nasıl dönüştürebileceğimizi göstereceğiz. P(r)-dağılım parçacık içinde bulunan tüm mesafeler kümesidir ve parçacığın maksimum boyutu, dmaxiçerir. Bu termodinamik bir ölçüm olduğundan, P(r)-dağılımı parçacıkların konformasyonel alanının işgal ettiği fiziksel alanı temsil eder. Bir SAXS veri setinin doğru analizi, kristalografi ve kriyo-EM'den gelen yüksek çözünürlüklü bilgileri tamamlayan çözüm durumu öngörüleri sağlayabilir.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Beamline control software BsXCuBE</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BioXTAS Raw 1.2.3.</td>
			<td>MacCHESS</td>
			<td>http://bioxtas-raw.readthedocs.io/en/latest/index.html</td>
			<td>First developed in 2008 by Soren Skou as part of the biological x-ray total analysis system (BioXTAS) project. Since then it has been extensively developed, with recent work being done by Jesse B. Hopkins</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HPLC program LabSolutions</td>
			<td>Shimadzu</td>
			<td>n.a.</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ISPyB</td>
			<td>ESRF</td>
			<td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td>
			<td>local development</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NaCl</td>
			<td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td>
			<td>27808.297</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scatter</td>
			<td>Diamond Light Source Ltd</td>
			<td>http://www.bioisis.net/tutorial/9</td>
			<td>Supported by SIBYLS beamline (ALS berkeley, Ca) and Bruker Cororation (Karlsruhe, Germany)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Superdex 200 Increase 5/150 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28990945</td>
			<td>SEC-SAXS column used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris base</td>
			<td>Euromedex</td>
			<td>26-128-3094-B</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of sec-saxs data via efa deconvolution and scatter

BioSAXS, moleküler ve yapısal biyolojide çözelti yapısını, parçacık boyutunu ve şeklini, yüzey-hacim oranını ve makromoleküllerin ve makromoleküler komplekslerin konformasyonel değişimlerini belirlemek için kullanılan popüler bir tekniktir. Yapısal modelleme için yüksek kaliteli SAXS veri seti monodisperse, homojen örneklerden olmalıdır ve bu genellikle sadece sıralı kromatografi ve hemen SAXS ölçümü kombinasyonu ile ulaşılır. En yaygın olarak, boyut dışlama kromatografisi örnekleri ayırmak ve kirleticimaddeleri ve toplamaları ilgi parçacığından dışlamak için kullanılır ve bu da Tek bir protein türünün iyi çözülmüş kromatografik zirvesinden SAXS ölçümlerinin yapılmasını sağlar. Yine de, bazı durumlarda, hatta sıralı arınma monodisperse örneklerinin garantisi değildir, çünkü birden fazla bileşen boyut olarak birbirine çok yakın dır ya da algılanan elution süresini değiştirme yoluyla oluşan şekil değişiklikleri. Bu gibi durumlarda, tek tek bileşenlerin idealize Edilmiş SAXS eğrilerini elde etmek için karışımın SAXS verilerini deconvolute etmek mümkün olabilir. Burada bunun nasıl sağlandığını ve SEC-SAXS verilerinin pratik analizinin ideal ve zor numuneler üzerinde gerçekleştirilgösterdiğini gösteriyoruz. Özellikle, vaccinia E9 DNA polimeraz ekonukleaz eksi mutant SEC-SAXS analizini gösteriyoruz.

Klasik çerçeve seçimi13 üzerinde deconvolution kullanmanın avantajı, tek dağılımlı bir saçılma sinyali üreterek türlerin birbirleri üzerindeki etkisini ortadan kaldırmaktır. Bu da genellikle gürültü oranı daha iyi bir sinyal ile takip edilir. E9 exoeksi DNA'ya bağlandığında ve SEC-SAXS kullanılarak çalıştırıldığında iki tepe gözlenir(Şekil 1). Birinci, büyük tepe (yaklaşık kare 420\u2012475) E9 exoeksi-DNA kompleksi ikinci (yaklaşık kareler 475\u2012540), bağlanmamış durumdur (Bkz. Ek Veriler: Şekil 2). Çerçeve leri seçmenin klasik yaklaşımı kompleksin ilk tepenoktasında istikrarlı bir Rg sağlarken (bkz. Ek Veri: Şekil 3),ikinci tepe açıkça birleştirilir ve çizim boyunca Rg, ikinci ilgi zirvesinin çapraz tepe kontaminasyonnedeniyle istikrarlı bir Rg'ye sahip olmadığını gösterir. Sadece 5 kare bir yarı kararlı Rg gösterdi, onlar bir Rg = 36.3 ş(Şekil 2, yeşil) verdi çıkarıldığında kullanılabilir. Zirveler EFA kullanılarak dekonvoluted edildiğinde ikinci tepe için karşılık gelen eğri(Şekil 2, mavi) orijinal ile kaplanmış ve gürültü sinyali net bir azalma gösterdi ve daha düşük bir Rg, 34.1 şkaydedildi. Kratky arsa(Şekil 3) deconvoluted tepe (mavi) ile karmaşık gösterir daha küresel. Bu p (r) eğrisi tarafından doğrulanır(Şekil 4) hangi bir dmax verir 108.5 şdeconvoluted eğrisi için (mavi) olmayan dmax 120 ş(yeşil) ile daha uzun iken, bu büyük olasılıkla bağlı olmayan E9 exoeksikaynaklanan heterojenite nedeniyle .
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig01.jpg"> Şekil 1: E9 exoeksi sinyal çizimi tek başına ve karmaşık DNA ile. Üst panel, SEC-SAXS çalışmasının (açık mavi) her karesi için arka plana integral oranının bir çizimini gösterir. Kırmızı noktalar, zirvenin üzerindeki her karede Rg'yi gösterir. Alt panel, Durbin-Watson otomatik korelasyon analizine göre renkli her kare için artıkları gösteren karşılık gelen ısı haritasını gösterir, yüksek benzerlik bölgeleri renkli siyan renkli ise farklı çerçeveler pembeler için koyu mavi leri takip ederken ve son olarak da farklılığın şiddetine bağlı olarak kırmızıya kadar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig01large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig02.jpg"> Şekil 2: Yoğunluk ve dağılım vektörünün çizimi. Çıkarılan SAXS verilerinin bir bindirmesi E9 exoeksi'yi oluşturur. Yeşil 5 kare (çerçeve 517\u 2012522) ortalama ve yarı kararlı Rg bir alandan çıkarılır ve mavi temsili saçılma eğrisi SEC-SAXS tepe EFA deconvolution türetilen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig02large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig03.jpg"> Şekil 3: Boyutsuz Kratky eğrisi. E9 exoeksi gösteren dekonvoluted (mavi) ve dekonvoluted olmayan (yeşil) Kratky eğrisinin yer kaplaması küresel dir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig03large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61578/61578fig04.jpg"> Şekil 4: P(r) eğrisi. E9 exoeksiiçin deconvoluted (mavi) ve dekonvoluted olmayan (yeşil) eğrilerin bindirme . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/61578fig04large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.</a>
Ek Veriler. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61578/Supplementary%20data.docx" target="_blank">Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayınız</a>

Watch this Scientific Journal Video about Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter at JoVE.com

Analysis of SEC-SAXS data via EFA deconvolution and Scatter

Biyolojik makromoleküllerin SEC-BioSAXS ölçümleri makromoleküllerin ve komplekslerinin çözelti yapısını belirlemek için standart bir yaklaşımdır. Burada, sec-BioSAXS verilerini, tamamen çözülmüş ve kısmen çözülmüş zirvelere sahip, sık karşılaşılan iki tür SEC izlerinden analiz ediyoruz. Biz dağılım ve BioXTAS RAW kullanarak analiz ve dekonvolution göstermek.

EFA deconvolution ve Scatter ile SEC-SAXS verilerinin analizi

BioSAXS is a popular technique used in molecular and structural biology to determine the solution structure, particle size and shape, surface-to-volume ...

Biyolojik küçük açılı x-ışını saçılımı makromolekül ve makromoleküler komplekslerin yapısal ölçümlerini sağlar. İdeal olarak, ölçülecek örnek monodispersed olmalıdır. Bazı durumlarda, boyut dışlama kromatografisi SAXS monodispersity üretmek için yeterli olmasa da, saxs verilerinin yazılım tabanlı dekonvolution idealize Edilmiş Bir SAXS eğrisi üretmek için yapılabilir.Bu protokolü takiben Vaccinia virüsü DNA polimeraz exominus mutantlarını analiz etmek için bir dekonvolution programı ve kullanıcı dostu Scatter programı kullanılabilir. Boyut dışlama kromatografisi verilerinin arka plan çıkarmasını gerçekleştirmek için Java tabanlı Scatter 4 programını açın ve SEC sekmesini açın. Azaltılmış veri dosyalarını pencerenin altındaki damla verilerine sürükleyin ve bırakın ve çıktı dizini düğmesini tıklatın ve verilerin kaydedileceği çıktı dizini ayarlamak için açın.Kaydet kutusuna örnek adı girin ve İzlemeyi tıklatın. Deneysel ayrıntıları ve ilgili alanları doldurmak için ayrıntıları edin düğmesine tıklayın. Arabellek çerçevelerini el ile seçmek için arabellek leri ayarla'yı tıklatın.Yaklaşık 100 karelik boyut dışlama kromatografisi sütununun geçersiz hacminden önce izleme eğrisiüzerinde arabelleği düz olarak yeniden seçmek için sol tıklatın ve sürükleyin ve SEC dosyasını yeniden hesaplamak için arabelleği ve güncelleştirmeyi ayarla'yı tıklatın. Sinyal çiziminde ilgi çekici bir bölge seçmek için sol tıklatın ve sürükleyin ve birleştirme için kullanılacak çerçevelerin yakınlaştırma ve alt kümesini seçmek için ısı haritası çizimindeki çapraz tüyleri sol tıklatın ve sürükleyin. Başka bir sol tıklatma ile, çapraz tüylerin sağ alt alanına karşılık gelen ısı haritasındaki çerçeveleri vurgulayın.İdeal olarak, çerçeve ağırlıklı olarak silüan rengi ve girdap kararlı bir yarıçapı olan bir bölge vurgulamak gerekir. Seçili çerçevelerden memnun olduğunuzda, çıkarılan çerçeveleri birleştirmek için birleştirme'yi tıklatın ve verileri görüntülemek için çözümsekmesi sekmesini tıklatın. Verilerin deconvolution için, deconvolution programına veri kümesi yükleyin.Dosyaların altındaki denetim panelinde, verileri bulmak ve tüm DAT dosyalarını vurgulamak için klasör simgesini kullanın. Seri çiziminde kare numarasına karşı tümleşik yoğunlukta bir çizim çizilir. Seri sekmesinin altında, eğriyi vurgulamak ve LC çözümlemesi açılır penceresini açmak için tıklatın.Uygun bir arabellek bölgesi seçmek için, kromatogramın zirvesinden önce bir alan seçmek için bölge ekle'yi ve çözücü ön ve ayar arabelleği tıklattıktan sonra bir alan seçin. Açılır pencereler, arka plan için çerçevelerin seçilmediğini gösterir. EFA'yı başlatmak için vurgulanan dosyaya sağ tıklayın ve menüden EFA'yı seçin.Açılır pencerede, veri kümesinin tek değer ayrışması gözlenmelidir. Denetimler kutusunda, deconvolute için tüm tepe alanı yoğunluk çizimi kaplı olduğunu onaylamak için kullanım çerçeveleri kutusu değerlerini işaretleyin. Tekil değerler çizimi, taban çizgisinin üzerindeki tekil değerlerin yoğunluğunu gösterir.Sol ve sağ tek vektörler eşleşmiyorsa, önemli tekil vektör sayısını ikiye değiştirin ve kareleri sol ve sağ tekil vektörler benzer olana kadar hareket ettirin. EFA hesaplanacak, her vektör için ileri ve geri yönde çizimler üretilecek ve bileşenlerin seçilen boyut dışlama kromatografisi SAXS verileri için çözüm profilini ne zaman başlatıp çıkaracağını gösterir. RAW aralıkları tanımlamaya çalışır.Gerekirse, her dairenin taban çizgisinden yükselen veya taban çizgisine düşen bir çekim noktasının başlangıcı olması için aralıkları değiştirmek için okları kullanın ve sonrakini tıklatın. Ani artışları azaltmak veya ortadan kaldırmak için, bileşen aralığı denetimlerini ayarlamak için aralık denetim oklarını kullanarak hangi çerçevenin başak ile karşılık olduğunu belirleyin. En az Bir Chi kareelde edildiğinde, doğrulama denetimi gerçekleştirmek için geri tıklayın.Özgün EFA çizimleri hala geçerli görünüyorsa, sonrakini tıklatın ve çizimleri kaydetmek için EFA verilerini kaydedin. Ardından EFA penceresini kapatmak için yapılanları tıklatın. Daha sonra RAW penceresinde, eğrileri görüntülemek için çizim panelindeki profilleri açın.Denetim panelinin profiller sekmesinde, eğrileri DAT dosyaları olarak kaydetmek için sağ tıklatın. SAXS tayini için dağılım analizi sekmesini açın ve manuel Guinier analiz aracını seçmek için G'yi seçin. Arsa, eklemek veya artıkbir gülümseme veya kaş çatma özelliği yok gibi noktaları kaldırın.Guinier uyumundaki seçili veriler, 1,3 girdap sınırıyarıçapı ile çarpılarak en yüksek sırayı aşmamalıdır. Normalleştirilmiş Kratky'yi tıklatın. Ortaya çıkan çizim makromolekülün yapısal durumunun, küresel, silindirik, düzensiz, kütle için normalleştirilmiş ve konsantrasyonun bir değerlendirmesini sağlar.Korelasyon hacmini tıklatın. Toplam dağınık yoğunluk ve Q çizimlerinin bir fonksiyonu olarak toplam dağınık yoğunluğun tümleşik alanı, saçılma eğrisinin kalitesini doğrulamak için hızlı bir başvuru olarak görünür. Esneklik çözümlemesi başlatmak için esneklik'i tıklatın.Açılır penceredeki her panel, kompakt ve uzatılmış esnek biyopolimerler arasında var olan bir güç yasası ilişkisini istismar eden bir çizim gösterecektir. Çizimlerden birinde bir plato ulaşılAna kadar verilerin görünümünü değiştirmek için kutunun altındaki kaydırıcıyı kullanın. Esneklik çözümlemesi yaptıktan hemen sonra ses düzeyini tıklatın.Üç grafiklik bir açılır pencere oluşturulur. Porod-Debye çizimi, esneklik çizimindeki kaydırıcının bırakıldığı yeri izler ve platolanmış alan verilerini gösterir. Parçacığın hacmini hesaplamak için, başlangıç ve bitiş noktalarını, çizimdeki mavi çizgi yaylalı bölgeye uyana kadar hareket ettirin.Tarafsız bir sonuç için, Porod-Debye üs güç yasası uygun artıkları hiçbir desen göstermelidir. R'nin P sekmesi altında, gerçek boşluk dağılımı ve örnek için dağılım eğrisi gözlemlenebilir. İdeal olarak, dağıtım eğrisi hiçbir dalga ile pürüzsüz olmalı ve sadece yavaşça x-eksenine dokunmalıdır.Örnek adı sağ tıklatın ve yeni bir pencere açmak için DMAX'ı bul'a tıklayın. Maksimum boyut sınırları önerilen maksimum Q aralığı, hesaplama için kullanılacak maksimal veri noktaları, alt ve üst maksimum boyut sınırları ve alt ve üst alfa skoru ile önceden ayarlanır. Başlat'ı tıklatın.Önerilen maksimum boyut ve alfa düzeyiyle birlikte bileşik bir dağılım oluşturulur. Bu veriler kabul edilebilirse, karşılıklı alan çiziminin önerilen maksimum Q aralığıyla eşleşecek şekilde kırpılanınca R'nin P sekmesine dönmek için pencereyi kapatın. Daha fazla model seçin ve açılır pencereden önerilen değerlere alfa düzeyini ve maksimum boyutu ayarlamak için arka planı tıklatın.Rafine'i tıklatın. Herhangi bir noktanın kırmızıda belirtildiği şekilde reddedilmesi gerekip gerekmediğini gösteren bir çapraz doğrulama çizimi açılır. Yalnızca birkaç reddedilen nokta varsa ve dağıtım iyi görünüyorsa, model iyidir.Analiz sekmesine bir rapor yazdıracaksınız. Örneği vurgulamak için sol tıklatın ve örnek adına sağ tıklayın. Tek veri kümesinden rapor oluştur'u seçin.Yorumlara izin vermek için bir metin kutusu açılır ve oluşturulan tüm rakamları ve değerleri gösteren bir PDF belgesi oluşturulur. Bu temsili analizde, E9 DNA polimeraz ekonukleaz eksi mutant DNA'ya bağlandı ve boyut dışlama kromatografisi küçük açılı x-ışını saçılımı kullanılarak çalıştırıldı. İki zirve gözlendi.İlk büyük tepe, E9 DNA polimeraz eksonekleaz eksi mutant DNA kompleksini temsil eder. Ve ikincisi, bağlanmamış durumu gösterir. Çerçeveleri seçme klasik yaklaşım ilk tepede karmaşık girdap istikrarlı bir yarıçap sağlarken, ikinci zirve açıkça birleştirilir ve arsa genelinde girdap yarıçapı ilgi ikinci zirve çapraz tepe kontaminasyon nedeniyle gyrasyon istikrarlı bir yarıçapı olmadığını gösterir.Bu analizde, sadece beş kare girdap yarı kararlı yarıçapı gösterdi kullanılabilir. Çıkarılınca, 36.3 angstrom'luk bir girdap yarıçapı verdiler. Zirveler EFA kullanılarak dekonvoluted edildiğinde, ikinci tepe için karşılık gelen eğri orijinal ile kaplanmış, gürültü ve 34.1 angstroms jivrasyon düşük yarıçapı sinyal net bir azalma gösteren.Verilerin Kratky bir arsa kıvrık tepe ile karmaşık daha küresel olarak deconvoluted eğrisi için 108.5 angstroms maksimum boyut verir PR eğrisi tarafından doğrulandı ortaya koymaktadır. Bu analiz için deconvoluted olmayan veriler daha fazla 120 angstroms maksimum boyut ile uzatılmış, büyük olasılıkla bağlanmamış E9 polimeraz eksi eksoneklease mutant kaynaklanan heterojenite nedeniyle. En kritik adımlar tekil değerleri ve bu büyük ölçüde deconvolution doğruluğunu etkiler olarak kullanılan veri aralığı seçiminde vardır.Sonuçlar kendi başlarına alınmamalı, daha fazla analitik santrifüj veya çok açılı lazer ışık saçılımı gibi ek teknikler kullanılarak biyolojik yorumlanmasına izin verilmelidir. In-line sütun-deconvolution ve program Scatter gibi kullanıcı dostu arayüzü ile birlikte saxs bile özünde zor sistemlerden anlamlı yapısal veri sağlamak için güçlü bir pakettir.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Production, Crystallization and Structure Determination of C. difficile PPEP-1 via Microseeding and Zinc-SAD

Üretim, Kristalleşme ve Yapı Tayini ve<em&gt; C. difficile</em&gt; PPEP-1 mikro-tohumlama ve Çinko-SAD aracılığıyla

New therapies are needed to treat Clostridium difficile infections that are a major threat to human health. The C. difficile metalloprotease PPEP-1 is a ...

Anaerobic Protein Purification and Kinetic Analysis via Oxygen Electrode for Studying DesB Dioxygenase Activity and Inhibition

Anaerobik Protein Saflaştırma ve DesB Dioxygenase etkinliği ve inhibisyon çalışmak için oksijen elektrodu ile kinetik Analizi

Oxygen-sensitive proteins, including those enzymes which utilize oxygen as a substrate, can have reduced stability when purified using traditional aerobic ...

Fully Autonomous Characterization and Data Collection from Crystals of Biological Macromolecules

Tamamen Özerk karakterizasyonu ve biyolojik oluştururlar kristalleri üzerinden veri toplama

High-brilliance X-ray beams coupled with automation have&#160;led to the use of synchrotron-based macromolecular X-ray crystallography (MX) beamlines for ...

Using the Open-Source MALDI TOF-MS IDBac Pipeline for Analysis of Microbial Protein and Specialized Metabolite Data

Mikrobiyal protein ve özel metabolit verilerinin analizi için açık kaynak MALDı TOF-MS ıdbac Pipeline kullanma

In order to visualize the relationship between bacterial phylogeny and specialized metabolite production of bacterial colonies growing on nutrient agar, ...

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea (Camellia Sinensis L.) Leaves

Study on the Metabolism of Six Systemic Insecticides in a Newly Established Cell Suspension Culture Derived from Tea Camellia Sinensis L. Leaves

Çay (Camellia sinensis L.) türetilmiştir yeni kurulan hücre süspansiyon kültürü altı sistemik Böcek Ilacı metabolizması üzerinde çalışma Yaprak -ları

A platform for studying insecticide metabolism using in vitro tissues of tea plant was developed. Leaves from sterile tea plantlets were induced to form ...

Perturbing Endothelial Biomechanics via Connexin 43 Structural Disruption

Connexin 43 Yapısal Bozulma ile Perturbing Endotel Biyomekanik

Endothelial cells have been established to generate intercellular stresses and tractions, but the role gap junctions play in endothelial intercellular ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomik Tesis Gönderimi ve Müteakip Veri Analizi için TMT Örnek Hazırlama

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

Fixed Target Serial Data Collection at Diamond Light Source

Diamond Light Source'da Sabit Hedef Seri Veri Toplama

Serial data collection is a relatively new technique for synchrotron users. A user manual for fixed target data collection at I24, Diamond Light Source is ...

Proteomic Profile of EPS-Urine through FASP Digestion and Data-Independent Analysis

FASP Sindirimi ve Veriden Bağımsız Analiz yoluyla EPS-İdrarın Proteomik Profili

Filter-aided sample protocol (FASP) is widely used for proteomics sample preparation because it allows to concentrate diluted samples and it is compatible ...