Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

نحن نعترف بتمويل البحوث من المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة منحة R43GM125420-010 لدعم التنمية التجارية لجهاز FPOP على مقاعد البدلاء وR01GM127267 لتطوير توحيد ومقاييس بروتوكولات لFPOP عالية الطاقة.

1. إعداد مقاعد البدلاء البصرية والشعيراتية لFPOP
تنبيه: أشعة الليزر KrF excimer هي مخاطر قصوى للعين، والضوء المباشر أو المنعك يمكن أن يسبب تلفًا دائمًا للعين. ارتدي دائماً حماية مناسبة للعين، وتجنب وجود أي أجسام عاكسة بالقرب من مسار الحزمة عند الإمكان، واستخدم الضوابط الهندسية لمن?...

تقنيات التحاليل الطيفية القائمة على الكتلة، بما في ذلك تبادل الهيدروجين الديوتيريوم، الربط الكيميائي، وضع العلامات التكافؤة، وقياس الطيف الكتلي للرذاذ الأصلي وحركة الأيونات قد تزايد بسرعة في شعبيتها بسبب مرونتها وحساسيتها وقدرتها على التعامل مع الخلائط المعقدة. FPOP تفتخر العديد من الم?...

الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة للبروتينات (FPOP) هي تقنية ناشئة لتحديد التغيرات الطوبوغرافية البروتينية عن طريق تعديل فائق السرعة في منطقة السطح المكشوفة للمذيبات من البروتينات متبوعاً بالكشف عن البروتينات LC-MS1. FPOP يولد تركيز عال من الجذور الهيدروكسيل في الموقع بواسطة الليزر الأشعة فوق البنفسجية فلاش ضوء بيروكسيد الهيدروجين. هذه الجذور الهيدروكسيل هي رد الفعل جدا وقصيرة الأجل، تستهلك على مقياس زمني تقريبا ميكرو ثانية في ظل ظروف FPOP2. هذه الجذور الهيدروكسيل تنتشر من خلال المياه وأكسدة مختلف المكونات العضوية في حل بمعدلات حركية تتراوح عموما من سريع (~6 6 M-1 S-1)لنشر التي تسيطر عليها3. عندما الهيدروكسيل الراديكالية لقاءات سطح البروتين، فإن الراديكالية تتأكسد سلاسل جانبية الأحماض الأمينية على سطح البروتين، مما أدى إلى تحول كتلة من أن الأحماض الأمينية (الأكثر شيوعاً الجمع الصافي لذرة أكسجين واحدة)4. يعتمد معدل تفاعل الأكسدة في أي حمض أميني على عاملين: التفاعل المتأصل في تلك الأحماض الأمينية (التي تعتمد على السلسلة الجانبية والسياق التسلسلي)4،5 وإمكانية الوصول إلى تلك السلسلة الجانبية إلى جذر الهيدروكسيل الناشر ، الذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بمتوسط مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من المذيبات6،7. وقد لوحظ كل من الأحماض الأمينية القياسية باستثناء الجليسين كما وصفت هذه الجذور الهيدروكسيل عالية التفاعل في التجارب FPOP, وإن كان في غلة مختلفة على نطاق واسع; في الممارسة العملية، Ser، Thr، Asn، وعلاء ونادرا ما ينظر إليها على أنها المؤكدة في معظم العينات إلا تحت جرعات متطرفة عالية والتي حددتها دقيق وحساسة ETD التجزئةالمستهدفة 8،9. بعد الأكسدة، يتم إخماد العينات لإزالة بيروكسيد الهيدروجين والمواد تأكسدية ثانوية (أكسيد فائق، أكسجين مفرد، هيدروبيروكسيد البيبتيديل، الخ.) ثم يتم هضم العينات المطفأة بشكل بروتيوليالي لتوليد خليط من الببتيدات المؤكدة ، حيث يتم تجميد المعلومات الهيكلية كـ "لقطة" كيميائية في أنماط منتجات الأكسدة من مختلف الببتيدات(الشكل 1). يستخدم الكروماتوغرافيا السائلة مقرونة إلى القياس الطيفي الشامل (LC-MS) لقياس كمية أكسدة الأحماض الأمينية في الببتيد البروتيني معين استناداً إلى الكثافة النسبية للإصدارات المؤسدة وغير المؤكد من ذلك الببتيد. بمقارنة هذه البصمة التأسدية من نفس البروتين التي تم الحصول عليها في ظل ظروف مختلفة من التشكل (على سبيل المثال، ملزمة بالليغان مقابل ليجوند خالية)، يمكن أن ترتبط الاختلافات في كمية أكسدة منطقة معينة من البروتين بشكل مباشر مع الاختلافات في مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من قبل المذيبات في تلك المنطقة6،7. القدرة على توفير معلومات الطبوغرافية البروتين يجعل FPOP تكنولوجيا جذابة لتحديد هيكل أعلى من أجل البروتينات، بما في ذلك في اكتشاف البروتين العلاجي والتنمية10،11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> الشكل 1: نظرة عامة على FPOP. يتم تعديل سطح البروتين بشكل مُساهم بواسطة الجذور الهيدروكسيلية شديدة التفاعل. سوف تتفاعل الجذور الهيدروكسيل مع سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية من البروتين بمعدل يتأثر بقوة بإمكانية الوصول إلى المذيبات في السلسلة الجانبية. التغيرات الطبوغرافية (على سبيل المثال، بسبب ربط ليغاند كما هو مبين أعلاه) سوف تحمي الأحماض الأمينية في منطقة التفاعل من التفاعل مع الجذور الهيدروكسيل، مما يؤدي إلى انخفاض في كثافة الببتيد المعدلة في إشارة LC-MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
مكونات مختلفة موجودة في حل FPOP (على سبيل المثال، اليغاندات، واسحات، والمخازن) لها نشاط الكسح مختلفة نحو الجذور الهيدروكسيل ولدت على التحليل الضوئي ليزر من بيروكسيد الهيدروجين3. وبالمثل، قد يغير تغير صغير في تركيز البيروكسيد، والفلونة بالليزر، وتكوين المخزن المؤقت الجرعة الجذرية الفعالة، مما يجعل استنساخ بيانات FPOP يشكل تحديا عبر العينات وبين مختبرات مختلفة. ولذلك، فمن المهم أن تكون قادرة على مقارنة جرعة الهيدروكسيل الراديكالية المتاحة للرد مع البروتين في كل عينة باستخدام واحدة من عدة الجرعات الهيدروكسيل الجذر المتاحة12،13،14،15،16. تعمل مقاييس الهيدروكسيل الراديكالية من خلال التنافس مع التحليل (ومع جميع الزبالين في الحل) لتجمع الجذور الهيدروكسيلية؛ يتم قياس الجرعة الفعالة من الجذور الهيدروكسيل عن طريق قياس كمية أكسدة الدوسيمتر. لاحظ أن "الجرعة الجذرية الهيدروكسيل الفعالة" هي وظيفة من كل من التركيز الأولي للهيدروكسيل الراديكالية المتولدة ونصف العمر من الراديكالية. هذه المعلمتين تعتمد جزئيا على بعضها البعض، مما يجعل النمذجة الحركية النظرية معقدة إلى حد ما (الشكل 2). يمكن أن يكون اثنين من العينات مختلفة بعنف جذرية الأولية نصف حياة مع الحفاظ على نفس الجرعة الراديكالية الفعالة عن طريق تغيير التركيز الأولي من الهيدروكسيل الراديكالية التي شكلت; أنها لا تزال تولد آثار أقدام متطابقة17. Adenine13 و Tris12 هي مريحة hydroxyl الجذر دوسيمترات لأن مستوى الأكسدة الخاصة بهم يمكن قياسها عن طريق مطياف الأشعة فوق البنفسجية في الوقت الحقيقي، مما يسمح للباحثين لتحديد بسرعة عندما يكون هناك مشكلة مع جرعة جذرية الهيدروكسيل فعالة واستكشاف مشكلتهم. لحل هذه المشكلة، من المهم وجود مقياس الجرعات المضمن الموجود في نظام التدفق مباشرة بعد موقع التشعيع الذي يمكنه مراقبة الإشارة من تغيرات امتصاص الأدينين في الوقت الفعلي. وهذا يساعد في تنفيذ التجارب FPOP في المخازن المؤقتة أو أي سذر الأخرى مع مستويات مختلفة على نطاق واسع من الهيدروكسيل قدرة الكسحالجذرية 17. ويمكن تنفيذ هذا التعويض الجرعة الجذرية في الوقت الحقيقي, تسفر عن نتائج لا يمكن تحديدها إحصائيا لنفس المطابقة عن طريق تعديل الجرعة الراديكالية الفعالة.
في هذا البروتوكول، لدينا إجراءات مفصلة لتنفيذ تجربة FPOP نموذجية مع تعويض الجرعة الراديكالية باستخدام أدينين كمقياس الجرعات الراديكالية البصرية الداخلية. هذه الطريقة تسمح للمحققين بمقارنة آثار الأقدام عبر ظروف FPOP التي لديها قدرة الكسح المختلفة من خلال أداء التعويض في الوقت الحقيقي.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> الشكل 2: محاكاة حركية للتعويض القائم على قياس الجرعات. 1 mM أدينين دوسيميت يتم قياس الاستجابة في 5 μM lysozyme التحليل مع تركيز جذري هيدروكسيل 1 mM الأولي (▪أو تي1/2=53 ن س), وتعيين كاستجابة مقياس الجرعات المستهدفة (أسود). عند إضافة 1 mM من الهستيدين الكاسح الزبال، استجابة مقياس الجرعات (الأزرق) يقلل جنبا إلى جنب مع كمية أكسدة البروتين بطريقة متناسبة (السماوي). وينخفض أيضا نصف عمر جذر الهيدروكسيل (▪OH t1/2=39 ns). عندما يتم زيادة كمية من هيدروكسل جذري ولدت لإعطاء عائد مكافئ من الجرعات المؤسدة في العينة مع 1 mm الهستيدين الكاسح كما يتحقق مع 1 mM هيدروكسل الراديكالية في غياب زبال (الأحمر)، وكمية أكسدة البروتين التي تحدث على نحو مماثل يصبح متطابقة (أرجواني)، في حين أن نصف العمر الراديكالي الهيدروكسيل يقلل أكثر من ذلك (▪OH ر1/2=29 ن). تم تكييفها بإذن من Sharp J.S.، Am Pharmaceut Rev 22، 50-55، 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

التأكسد الكيميائي الضوئي السريع للبروتينات (FPOP) هو تقنية بيولوجيا هيكلية تعتمد على القياس الطيفي الكتلي الذي يسبر مساحة السطح التي يمكن الوصول إليها من البروتينات. تعتمد هذه التقنية على رد فعل سلاسل جانبية من الأحماض الأمينية مع الجذور الهيدروكسيلية تنتشر بحرية في الحل. FPOP يولد هذه الجذور في الموقع عن طريق التحليل الضوئي بالليزر من بيروكسيد الهيدروجين، وخلق انفجار من الجذور الهيدروكسيل التي تستنفد على ترتيب ميكروثانية. عندما تتفاعل هذه الجذور الهيدروكسيل مع سلسلة جانبية من الأحماض الأمينية التي يمكن الوصول إليها من المذيبات ، فإن منتجات التفاعل تظهر تحولًا جماعيًا يمكن قياسه وتحديده كمًا بواسطة قياس الطيف الكتلي. وبما أن معدل رد فعل الأحماض الأمينية يعتمد جزئياً على متوسط سطح المذيبات التي يمكن الوصول إليها من تلك الأحماض الأمينية، فإن التغيرات المقاسة في كمية أكسدة منطقة معينة من البروتين يمكن أن ترتبط بشكل مباشر بالتغيرات في إمكانية الوصول إلى المذيبات في تلك المنطقة بين التشكلات المختلفة (على سبيل المثال، اللتيند المقيد مقابل الليغاند الحر، والمونمر مقابل التجميع، إلخ.) وقد طبقت FPOP في عدد من المشاكل في علم الأحياء، بما في ذلك التفاعلات البروتين البروتين، والتغيرات البروتين التشكلية، والبروتين liga.1. كما أن التركيز المتاح من الجذور الهيدروكسيل يختلف استناداً إلى العديد من الظروف التجريبية في تجربة FPOP، من المهم رصد الجرعة الجذرية الفعالة التي يتعرض لها تحليل البروتين. ويتحقق هذا الرصد بكفاءة من خلال دمج مقياس الجرعات مضمنة لقياس إشارة من تفاعل FPOP، مع فلونس الليزر تعديلها في الوقت الحقيقي لتحقيق المبلغ المطلوب من الأكسدة. مع هذا التعويض، يمكن تحديد التغيرات في تضاريس البروتين التي تعكس التغيرات التكونية، والأسطح ملزمة ليغاند، و/ أو التفاعل البروتين البروتيني واجهات التفاعل في عينات غير متجانسة باستخدام كميات عينة منخفضة نسبيا.

مقارنة من البصمة الببتيد سلسلة الثقيلة من adalimumab biosimilar في العازلة الفوسفات وعند تسخينها في 55 درجة مئوية لمدة 1 ح تظهر نتائج مثيرة للاهتمام. يستخدم اختبار t للطالب لتحديد الببتيدات التي تتغير بشكل كبير في هذين الشرطين (p ≤ 0.05). الببتيدات 20-38، 99-125، 215-222، 223-252، 260-278، 376-413، و 414-420 تظهر حماية كبيرة م?...

Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

أكسدة سريعة للبروتينات الضوئية هي تقنية ناشئة للتوصيف الهيكلي للبروتينات. مختلف المذيبات المضافة و ligands تختلف خصائص الهيدروكسيل الراديكالية الكسح. لمقارنة بنية البروتين في ظروف مختلفة، مطلوب التعويض في الوقت الحقيقي من الجذور الهيدروكسيل ولدت في رد الفعل لتطبيع ظروف رد الفعل.

تمكين التعويض في الوقت الحقيقي في الأكسدة الكيميائية الضوئية السريعة من البروتينات لتحديد التغيرات في تضاريس البروتين

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

الطريقة يسهل قياس البروتين تأكيد والتفاعلات البروتين. التركيب العازلة، نقاء العينة ومتطلبات تركيز البروتين مرنة مما يسمح للطريقة لمعالجة المشاكل الهيكلية الصعبة. هذه التقنية تسمح ضغط العينات في مجموعة واسعة من أنظمة العازلة المختلفة.باستخدام أسلوب قياس الجرعات لدينا، يمكن للباحثين مراقبة مدى نجاح ردود فعل العلامات الخاصة بهم في الوقت الحقيقي. أحد تطبيقات هذه التكنولوجيا هو في تطوير المخدرات لأنها تسمح للباحثين لاختبار تركيبات الأدوية المختلفة على نطاق واسع وكيف تؤثر على بنية البروتين. لإعداد مقاعد البدلاء البصرية FPOP.أول بدوره على الليزر وتعيين الليزر إلى الزناد الخارجي، والطاقة المستمرة وعدم استبدال الغاز. عندما يكون الليزر قد دفأ تعيين طاقة الليزر لكل نبضة إلى ما بين 80 إلى 120 ملليغرام لكل نبضة واستخدام شعلة البوتان لحرق بلطف ترميز بوليميد من الشعرية في المكان الذي سوف يقرأ مقياس الجرعات مضمنة إشارة ماصة في 265 نانومتر بعد التعرض بالليزر. استخدم مسحًا وميثانولًا خاليًا من الوبر لمسح الحطام بلطف من الشعيرات الدموية ووضع الشعيرات الدموية النظيفة من خلال مسار شعاع الليزر وإلى مقياس الجرعات المضمن.اضغط على ذراع في الجزء العلوي من مقياس الجرعات المضمن لفتح المفصلي وإزالة الاقطاب المغناطيسية. ضع الشعيرية في الأخدود الجهاز من الجرعات المضمّنة باستخدام حاملات المغناطيسية للحفاظ على الشعرية في مكانها وإغلاق المفصلي الجرعات فوق الشعرية التي تضغط على المفصل حتى أقفال الرافعة في مكانها. انقر فوق زر الفلاش البداية في برنامج قياس الجرعات لبدء إطلاق ليزر إكسيميمر وتعيين معدل التكرار المسبق بين 10 إلى 20 هيرتز في برنامج قياس الجرعات مع إطلاق الليزر يحرك المرحلة الآلية من خلال نطاق حركتها ، وضمان أن يبقى الشعاع مركزًا على الفتحة وأنه يمكن ملاحظة صورة ظلية من الشعيرات الدموية في جميع أنحاء.ثم تدفق شعرية مع الماء في 20 ميكرولتررس في الدقيقة الواحدة لمدة دقيقة واحدة على الأقل وانقر فوق البيانات بدء بالإضافة إلى السيارات صفر في برنامج مقياس الجرعات الصفر مقياس الجرعات إلى الماء قبل البدء في جمع البيانات. لتنفيذ تجربة FPOP إضافة اثنين microliters من بيروكسيد الهيدروجين إلى 18 ميكرولترات من محلول FPOP واستخدام ماصة لخلط بلطف الحل بسرعة جمع الحل في الجزء السفلي من الأنبوب عن طريق الطرد المركزي واستخدام حقنة الغاز ضيق على الفور لتحميل الحل في مضخة حقنة. انقر فوق بدء تشغيل المضخة وبدء البيانات في برنامج مقياس الجرعات لبدء التدفق على مضخة الحقنة بمعدل التدفق المناسب واستخدام مقياس الجرعات المضمن لمراقبة قراءة الأدينين في الوقت الحقيقي حتى تستقر إشارة ماصة عند 265 نانومتر في جمع العينة في حاوية نفايات.لبدء اطلاق الليزر في سرعة سرعة التكرار مسبقا الطاقة انقر فوق زر فلاش بدء في البرنامج دوسيمتر واستخدام مقياس الجرعات المضمنة لمراقبة القراءة في الوقت الحقيقي adenine. الفرق في الامتصاص في 265 نانومتر مع الليزر قبالة والليزر على سيكون ماصة دلتا في 265 nanometers القراءة. لضمان أن تكون الجذور الهيدروكسيل قابلة للمقارنة متاحة للتفاعل مع البروتينات عبر عينات مختلفة.قارن ماصة دلتا في 265 nanometer القراءة التي تم الحصول عليها مع دوسيمتر مضمنة مع ماصة دلتا الرغبة في 265 nanometers القراءة التي تم الحصول عليها من التجارب السابقة أو عناصر التحكم. إذا كانت القراءة في المستوى المطلوب جمع العينة مباشرة بعد الليزر أو الإشعاع في المخزن المؤقت لإخماد. لتعويض الجرعة الراديكالية الفعالة لمعادلة قراءات الامتصاص تغيير تركيز بيروكسيد الهيدروجين، تغيير الطاقة الليزر لكل نبضة أو تغيير الطائرة المحورية للعدسة التركيز لزيادة فلونس الليزر.لجعل أكبر من 10 ملليمتر وحدة امتصاص التغيير في دلتا ماصة قراءة إعادة تشكيل العينة مع بيروكسيد الهيدروجين أكثر أو أقل وإعادة تشغيل العينة كما هو موضح. لإجراء تغيير صغير في القراءة امتصاص في الوقت الحقيقي، واستخدام المرحلة 50 ملليمتر الآلية لضبط موقف العدسة التركيز لضبط الطائرة البؤرية لشعاع الحادث. لقياس الكمية الفعالة من الهيدروكسيل الراديكالية الموجودة في العينة بعد أشعة الليزر رصد ماصة دلتا أدينين في 265 نانومتر في الوقت الحقيقي مع كاشف الشعيرات الدموية للأشعة فوق البنفسجية مضمنة باستخدام المرحلة الآلية لضبط موقف العدسة حتى ماصة الدلتا في 265 نانومتر القراءة يساوي القراءة المطلوبة.المقارنة بين البصمة الببتيد سلسلة الثقيلة من التدليل biosimilar في العازلة الفوسفات وبعد التدفئة في 55 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة يكشف عن أن المناطق الببتيد المشار إليها تظهر حماية كبيرة من المذيبات عندما يتم تسخين البروتين لتشكيل المجاميع. إن استخدام مقياس الجرعات المضمن في الوقت الحقيقي لرصد الفرق في ماصة الأدينين قبل وبعد الليزر أو الإشعاع يشير إلى أن هناك تغيراً مماثلاً في مستوى امتصاصات الأدينين لوحظ في حاجز MES مقارنةً بالمخزن المؤقت للفوسفات. في حين أن متوسط أكسدة الببتيدات أقل في وجود حاجز MES مقارنة مع عازلة الفوسفات.ومع ذلك، كما يتم زيادة فلونس الليزر أن يكون لها استجابة قياس الجرعات عدنين على قدم المساواة متوسط قيم أكسدة الببتيد هي نفسها تقريبا بعد FPOP ومخزن ميث العازلة والفوسفات العازلة. كما تتأثر القراءة قياس الجرعات من تركيز بيروكسيد الفلورس بالليزر وكذلك زبال الراديكالية. خذ العناية بأن استجابة قياس الجرعات بين عينة المسح قريبة من بعضها البعض.غالباً ما يستخدم الموقع الطفرات الموجهة للتحقيق في المواقع المحمية في FPOP. وهذا يسمح للباحثين لتحديد ما إذا كانت التغييرات بسبب أليستر. هذه التقنية تسهل مقارنة البروتينات في المخازن المؤقتة المختلفة أو التركيبات التي تسمح للباحثين بتحديد تأثير الإضافات المختلفة على تأكيد البروتين.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

وقت حل التأين electrospray الهيدروجين، الديوتيريوم تبادل الطيف الكتلي لدراسة بنية البروتين وديناميكية

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

في الوقت الحقيقي تتبع فصل جزء من الحمض النووي عن طريق الهاتف الذكي

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

تحديد محتوى الجليكوجين في البكتيريا الزرقاء

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

تجديد ميكروليكتروديس الذهب صفت مجهزة لهو محلل خلية في الوقت الحقيقي

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

مقتطفات البت في حوزتي خصوصية في الأنسجة الماوس باستخدام TOF الكتلي: التلاعب بدرجة الحموضة تسبب التغييرات النوعية

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

تجميد التساهمية من البروتينات للتحليل الطيفي قوة جزيء واحد

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

المراقبة في الوقت الحقيقي من رد تبادل حبلا الحمض النووي توسط Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

في الوقت الحقيقي ، وشبه التلقائي قياس الفلورسنت من الدرجة الهوائية السائل سطح المجري الجوي للخلايا الاساسيه الإنسان الظهاريه

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

توصيف البروتينات الخلوية مع الأكسدة الضوئية السريعة في الخلية من البروتينات

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl تبادل جل تحويلة القول لتحديد كمي من البالميتويشن من بروتينات غشاء الدماغ

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...