Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Vi anerkender forskningsmidler fra National Institute of General Medical Sciences tilskud R43GM125420-01for at støtte kommerciel udvikling af en benchtop FPOP enhed og R01GM127267 til udvikling af standardisering og dosimetri protokoller for høj-energi FPOP.

1. Forbered den optiske bænk og kapillær til FPOP
FORSIGTIG: KrF excimer lasere er ekstreme øjenfarer, og direkte eller reflekteret lys kan forårsage permanent øjenskade. Bær altid passende øjenbeskyttelse, undgå tilstedeværelsen af reflekterende genstande i nærheden af strålevejen, når det er muligt, og brug tekniske kontroller til at forhindre uautoriseret adgang til en aktiv laser og til at begrænse eventuelle omstrejfende refleksioner.
<ol><li>Forbered den optiske FPOP-bænk...

Massespektrometri-baserede strukturelle teknikker, herunder hydrogen-deuterium udveksling, kemiske krydsbinding, kovalent mærkning, og indfødte spray massespektrometri og ion mobilitet har været hastigt voksende i popularitet på grund af deres fleksibilitet, følsomhed og evne til at håndtere komplekse blandinger. FPOP kan prale af flere fordele, der har øget sin popularitet inden for massespektrometri-baserede strukturelle teknikker. Ligesom de fleste kovalente mærkning strategier, giver det en stabil kemisk øje...

Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en ny teknik til bestemmelse af proteintopografiske ændringer ved ultrahurtig kovaent ændring af proteiners opløsningsmiddeludsynlige overfladeareal efterfulgt af påvisning af LC-MS1. FPOP genererer en høj koncentration af hydroxyl radikaler in situ ved UV laser flash fotolyse af hydrogenperoxid. Disse hydroxyl radikaler er meget reaktive og kortvarig, forbruges på nogenlunde en microsecond tidsskala under FPOP betingelser2. Disse hydroxyl radikaler diffus gennem vand og oxidere forskellige organiske komponenter i opløsning ved kinetiske satser generelt spænder fra hurtig (~ 106 M-1 s-1) til diffusion-kontrollerede3. Når hydroxyl radikal støder på et protein overflade, den radikale vil oxidere aminosyren sidekæder på proteinoverfladen, hvilket resulterer i en masse skift af denne aminosyre (oftest netto tilsætning af en ilt atom)4. Oxidationsreaktionen ved enhver aminosyre afhænger af to faktorer: den iboende reaktivitet af denne aminosyre (som afhænger af sidekæden og sekvenskonteksten)4,5 ogtilgængeligheden af denne sidekæde til den spredende hydroxylrifrielle, som korrelerer tæt til det gennemsnitlige opløsningsmiddel, der er tilgængeligtoverfladeareal6,7. Alle standard aminosyrer undtagen glycin er blevet observeret som mærket af disse meget reaktive hydroxyl radikaler i FPOP eksperimenter, om end ved vidt forskellige udbytter; i praksis ses Ser, Thr, Asn og Ala sjældent som oxideret i de fleste prøver undtagen under høje radikale doser og identificeres ved omhyggelig og følsom målrettet MÅLRETTET ETD-fragmentering8,9. Efter oxidation slukkes prøverne for at fjerne hydrogenperoxid og sekundære oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider osv.) De slukkete prøver fordøjes derefter proteolytisk for at generere blandinger af oxiderede peptider, hvor de strukturelle oplysninger fryses som et kemisk "øjebliksbillede" i mønstrene for oxidationsprodukter af de forskellige peptider (figur 1). Flydende kromatografi koblet til massespektrometri (LC-MS) anvendes til at måle mængden af oxidation af aminosyrer i et givet proteolytisk peptid baseret på de relative intensiteter af de oxiderede og ikke-oxiderede versioner af det pågældende peptid. Ved at sammenligne dette oxidative fodaftryk af det samme protein, der er fremstillet under forskellige konformationsforhold (f.eks. ligandbundet versus ligandfri), kan forskelle i mængden af oxidation af et givet område af proteinet korreleres direkte med forskelle i det opløsningsmiddeltilgængelige overfladeareal i den pågældende region6,7. Evnen til at give protein topografisk information gør FPOP en attraktiv teknologi til højere orden struktur bestemmelse af proteiner, herunder i protein terapeutisk opdagelse og udvikling10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> Figur 1: Oversigt over FPOP. Overfladen af proteinet er kovalent modificeret af meget reaktive hydroxyl radikaler. Hydroxyl radikaler vil reagere med aminosyre sidekæder af proteinet med en hastighed, der er stærkt påvirket af opløsningsmiddel tilgængelighed af sidekæden. Topografiske ændringer (f.eks. på grund af bindingen af en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i interaktionsregionen mod at reagere med hydroxyl radikaler, hvilket resulterer i et fald i intensiteten af modificeret peptid i LC-MS signal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
Forskellige bestanddele, der findes i FPOP-opløsningen (f.eks. ligander, hjælpestoffer, buffere), har forskellige skylleaktivitet i forhold til hydroxyldriberne, der genereres på laserfotolyse af hydrogenperoxid3. Tilsvarende kan en lille ændring i peroxid koncentration, laser fluence, og buffer sammensætning ændre den effektive radikale dosis, hvilket gør reproduktion af FPOP data udfordrende på tværs af prøverne og mellem forskellige laboratorier. Det er derfor vigtigt at kunne sammenligne den hydroxylriske dosis, der er tilrådighed,til at reagere med protein i hver prøve ved hjælp af et af flere tilgængelige hydroxylrekromiske dosimeterer12,13,14,15,16. Hydroxyl radikale dosimetre handle ved at konkurrere med analysand (og med alle skyllevæsker i opløsning) for puljen af hydroxyl radikaler; den effektive dosis af hydroxyl radikaler måles ved at måle mængden af oxidation af dosimeteret. Bemærk, at "effektiv hydroxyl radikal dosis" er en funktion af både den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale genereret og halveringstid af den radikale. Disse to parametre er delvist afhængige af hinanden, hvilket gør den teoretiske kinetiske modellering noget kompleks (figur 2). To prøver kunne have vildt forskellige indledende radikale halveringsliv og samtidig opretholde den samme effektive radikale dosis ved at ændre den oprindelige koncentration af hydroxyl radikale dannet; de vil stadig generere identiske fodspor17. Adenin13 og Tris12 er praktisk hydroxyl radikale dosimeterer, fordi deres niveau af oxidation kan måles ved UV spektroskopi i realtid, giver mulighed for forskere til hurtigt at identificere, når der er et problem med effektiv hydroxyl radikal dosis og til fejlfinding af deres problem. For at løse dette problem er et inline dosimeter placeret i flowsystemet umiddelbart efter bestrålingsstedet, der kan overvåge signalet fra adeninabsorbanceændringer i realtid, vigtigt. Dette hjælper med at udføre FPOP-forsøg i buffere eller andre hjælpestoffer med vidt forskellige niveauer af hydroxylremmelig skyllekapacitet17. Denne radikale dosering kompensation kan udføres i realtid, giver statistisk skelnes resultater for den samme konforme ved at justere den effektive radikale dosis.
I denne protokol, Vi har detaljerede procedurer for at udføre en typisk FPOP eksperiment med radikale dosering kompensation ved hjælp af adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metode gør det muligt for efterforskere at sammenligne fodspor på tværs af FPOP-forhold, der har forskellige skyllekapacitet ved at udføre kompensation i realtid.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> Figur 2: Kinetisk simulering af dosimetribaseret kompensation. 1 mM adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozym analysand med en 1 mM indledende hydroxyl radikal koncentration (▪OH t1/2=53 ns), og indstilles som et mål dosimeter respons (sort). Ved tilsætning af 1 mM af scavenger excipient histidin, dosimeter respons (blå) falder sammen med mængden af protein oxidation i en proportional måde (cyan). Halveringstiden for hydroxyl radikalen falder også (▪OH t1/2=39 ns). Når mængden af hydroxyl radikal genereret øges for at give et tilsvarende udbytte af oxideret dosimeter i prøven med 1 mM histidine skyllevæske som opnået med 1 mM hydroxyl radikal i mangel af sca (rød), mængden af proteinoxidation, der opstår på samme måde bliver identisk (magenta), mens hydroxyl radikale halveringstid falder endnu mere (▪OH t1 / 2=29 ns). Tilpasset med tilladelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner (FPOP) er en massespektrometribaseret strukturel biologiteknik, der sonderer proteiners opløsningsmiddeltilgængelige overfladeareal. Denne teknik er afhængig af reaktionen fra aminosyre sidekæder med hydroxyl radikaler frit sprede i opløsning. FPOP genererer disse radikaler in situ ved laser fotolyse af hydrogenperoxid, hvilket skaber en byge af hydroxyl radikaler, der er opbrugt på bestilling af et mikrosekund. Når disse hydroxyl radikaler reagerer med en opløsningsmiddel-tilgængelig aminosyre sidekæde, reaktionsprodukterne udviser en masse skift, der kan måles og kvantificeres ved massespektrometri. Da en aminosyres reaktionshastighed til dels afhænger af den gennemsnitlige tilgængelige opløsningsmiddeloverflade af den pågældende aminosyre, kan målte ændringer i mængden af oxidation af et givet proteinområde være direkte korreleret med ændringer i opløsningsmiddeltilgængeligheden i den pågældende region mellem forskellige konformeringer (f.eks. ligandbundet versus ligandfri, monomer vs. aggregat osv.) FPOP er blevet anvendt i en række problemer i biologi, herunder protein-protein interaktioner, protein kropslige ændringer, og protein-ligand bindende. Da den tilgængelige koncentration af hydroxyl radikaler varierer baseret på mange eksperimentelle betingelser i FPOP eksperiment, er det vigtigt at overvåge den effektive radikale dosis, som proteinanalyt er udsat for. Denne overvågning opnås effektivt ved at indarbejde et inline dosimeter til måling af signalet fra FPOP-reaktionen, med laserfluence justeret i realtid for at opnå den ønskede mængde oxidation. Med denne kompensation kan ændringer i proteintopografi, der afspejler konformationelle ændringer, ligandbindende overflader og/eller proteinproteininteraktionsgrænseflader, bestemmes i heterogene prøver ved hjælp af relativt lave prøvemængder.

Sammenligning af adalimumab-bioimilæres tunge kædepeptryk i fosfatbufferen og ved opvarmning ved 55 °C i 1 time viser interessante resultater. Studerendes t-test bruges til identifikation af peptider, der er væsentligt ændret i disse to betingelser (p ≤ 0,05). Peptiderne 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 og 414-420 udviser betydelig beskyttelse mod opløsningsmiddel, når proteinet opvarmes til aggregater (Figur 5)30. Dette eksperiment identific...

Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Hurtig fotokemisk oxidation af proteiner er en ny teknik til strukturel karakterisering af proteiner. Forskellige opløsningsmiddeltilsætningsstoffer og ligands har varieret hydroxyl radikale skyllevæske egenskaber. For at sammenligne proteinstrukturen under forskellige forhold kræves der en real-time kompensation af hydroxyl radikaler genereret i reaktionen for at normalisere reaktionsbetingelserne.

Aktivering af real-time kompensation i hurtige fotokemiske oxidationer af proteiner til bestemmelse af Protein Topografi Ændringer

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Metoden letter måling af proteinbekræftelse og proteininteraktioner. Buffersammensætningen, prøverenhed og proteinkoncentrationskrav er fleksible, hvilket gør det muligt at håndtere udfordrende strukturelle problemer. Denne teknik giver mulighed for kompression af prøver i en bred vifte af forskellige buffersystemer.Ved hjælp af vores dosimetri metode, kan forskerne overvåge, hvor godt deres mærkning reaktioner arbejder i realtid. En anvendelse af denne teknologi er i udviklingen af lægemidler, fordi det giver forskerne mulighed for at teste vidt forskellige lægemiddelformuleringer, og hvordan de påvirker proteinstrukturen. Til forberedelse af den optiske FPOP-bænk.Først tænde laseren og indstille laseren til ekstern udløser, konstant energi og ingen gas udskiftning. Når laseren har varmet indstille laserenergi per puls til mellem 80 til 120 mg pr puls og bruge en butan fakkel til forsigtigt at brænde polyimid kodning af kapillær på det sted, hvor den inline dosimeter vil læse absorberende signal på 265 nanometer efter laser eksponering. Brug en fnugfri tørre og methanol til forsigtigt at tørre snavs fra kapillær og placere den rensede kapillær gennem strålen stien af laseren og ind i inline dosimeter.Tryk håndtaget på toppen af det indbyggede dosimeter for at åbne hængslet og fjerne de magnetiske holdere. Anlæg kapillæren i maskinens rille på det indbyggede dosimeter ved hjælp af de magnetiske holdere for at holde kapillæren på plads og lukke dosimeterhængslet over kapillæren og trykke på hængslet, indtil håndtaget låses på plads. Klik på startflash-knappen i dosimetri software til at begynde at affyre excimer laser og indstille den forudindstillede gentagelse sats mellem 10 til 20 Hertz i dosimetri software med laser fyring flytte motoriserede fase gennem sin vifte af bevægelse, sikre, at strålen forbliver centreret på blænden, og at silhuetten af kapillær kan observeres hele vejen igennem.Skyl derefter kapillæren med vand ved 20 mikroliter i minuttet i mindst et minut, og klik på startdata plus automatisk nul i dosimetersoftwaren for at nulstille dosimeteret til vandet, før dataindsamlingen påbegyndes. For at udføre et FPOP-eksperiment skal du tilføje to mikroliter hydrogenperoxid til 18 mikroliter FPOP-opløsning og bruge en pipette til forsigtigt at blande opløsningen, der hurtigt opsamler opløsningen i bunden af røret ved centrifugering, og brug straks en gastæt sprøjte til at indlæse opløsningen i en sprøjtepumpe. Klik startpumpe og start data i dosimeter software til at starte strømmen på sprøjten pumpen på passende strømningshastighed og bruge inline dosimeter til at overvåge real-time adenin læsning, indtil absorberende signal på 265 nanometer stabiliserer indsamle prøven i en affaldsbeholder.For at begynde at affyre laseren på den forudindstillede gentagelseshastighed slutenergi skal du klikke på startflashknappen i dosimetersoftwaren og bruge det indbyggede dosimeter til at overvåge adeninaflæsning i realtid. Forskellen i absorbans ved 265 nanometer med laseren slukket og laseren på vil være deltaabsorberende ved 265 nanometer læsning. For at sikre, at sammenlignelige hydroxyl radikaler er tilgængelige til at reagere med proteiner på tværs af forskellige prøver.Deltaabsorberende stoffer sammenlignes ved 265 nanometeraflæsning opnået med det inline dosimometer med ønsket deltaabsorberende stoffer ved 265 nanometeraflæsning opnået fra tidligere forsøg eller kontroller. Hvis aflæsningen er på det ønskede niveau, indsamles prøven umiddelbart efter laser eller stråling i dæmpningsbufferen. For at kompensere for den effektive radikale dosis for at udligne absorbansaflæsningerne ændre hydrogenperoxid koncentration, ændre laser energi per puls eller ændre brændplanet af fokusobjektet for at øge laser fluence.For at foretage en større end 10 milli absorbansenhedsændring i deltaabsorberende stoffer, der aflæsning, genformes prøven med mere eller mindre hydrogenperoxid, og prøven køres igen som påvist. For at foretage en lille ændring i absorbansaflæsningen i realtid skal du bruge den 50 millimeter motoriserede fase til at justere fokuslinsens position for at justere hændelsesstrålens brændplan. For at måle den effektive mængde hydroxyl radikal til stede i prøven efter laserstråling overvåge adenin deltaabsorberende stoffer på 265 nanometer i realtid med en inline UV kapillær detektor ved hjælp af motoriserede fase til at justere linsen position, indtil deltaabsorberende ved 265 nanometer læsning er lig med den ønskede læsning.En sammenligning af adilumumab-biosimilære aluminiumsfodaftryk i fosfatbufferen og efter opvarmning ved 55 grader Celsius i en time viser, at de angivne peptidregioner udviser betydelig beskyttelse mod opløsningsmidler, når proteinet opvarmes til at danne aggregater. Brug af et inline dosimometer i realtid til at overvåge forskellen i adeninabsorberingsannober før og efter laser eller stråling indikerer, at der observeres en sammenlignelig ændring i adeninabsorberingsniveauet i MES-buffer sammenlignet med fosfatbuffer. Mens den gennemsnitlige oxidation af peptiderne er lavere i nærværelse af MES buffer sammenlignet med fosfat buffer.Men da laser fluence øges for at have en lige adenin dosimetri respons den gennemsnitlige peptid oxidation værdier er næsten den samme efter FPOP og MES buffer og fosfat buffer. Som dosimetri læsning påvirkes af laser fluence peroxid koncentration samt den radikale skyllevæske. Pas på, at dosimetriresponset mellem stikprøveundersøgelsen er tæt på hinanden.Site rettet mutagenese bruges ofte til sonde steder beskyttet i FPOP. Dette gør det muligt for forskere at afgøre, om ændringer skyldes Alistair. Denne teknik letter sammenligningen af proteiner i forskellige buffere eller formuleringer, der gør det muligt for forskere at bestemme virkningen af forskellige tilsætningsstoffer på proteinbekræftelse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrosprayioniserings Brint-deuterium Exchange-massespektrometri til at studere proteiners struktur og Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing af DNA-fragmenter i realtid af Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse af glycogenindholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering af klædt guld Microelectrodes udstyret til en Real-Time celle Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestemmelse af Protease specificitet i mus væv ekstrakter af MALDI-TOF-massespektrometri: manipulere PH for at forårsage specificitet ændringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering af proteiner for enkelt molekyle kraft spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Real-time overvågning af DNA streng Exchange reaktion medieret af Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatiseret fluorescerende måling af luftvejene overflade flydende pH af primære Human luftvejs epitelial celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakteriserecellulære proteiner med in-cell hurtig fotokemisk oxidation af proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for kvantitativ bestemmelse af palmitoyllation af hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...