Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

אנו מכירים מימון מחקר מהמכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים להעניק R43GM125420-01 כדי לתמוך בפיתוח מסחרי של התקן FPOP ספסל ו R01GM127267 לפיתוח פרוטוקולי סטנדרטיזציה וdsimetry עבור FPOP אנרגיה גבוהה.

1. להכין את הספסל האופטי ואת נערך עבור FPOP
התראה: לייזרים של KrF excimer הם סכנות עיניים קיצוניות, ואור ישיר או משתקף עלול לגרום לנזק בלתי הפיך לעיניים. תלבש תמיד הגנת עיניים מתאימה, הימנע מנוכחות של עצמים מחזירי אור ליד נתיב הקרן במידת האפשר, והשתמש בבקרות הנדסיות כדי למנוע גישה בלת?...

טכניקות מבניות מבוססות ספקטרומטריה מסה, כולל החלפת מימן-דיטריום, קישור צולב כימי, תיוג קוולנטי, ספקטרומטריה מסה ספריי מקורית וניידות יון גדלו במהירות בפופולריות בשל הגמישות שלהם, רגישות, והיכולת להתמודד עם תערובות מורכבות. FPOP מתגאה במספר יתרונות שהגבירו את הפופולריות שלה בתחום של טכניקו?...

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) היא טכניקה מתפתחת לקביעת שינויים טופוגרפיים חלבון על ידי שינוי קוולנטי אולטרה מהיר של שטח הפנים חשוף ממס של חלבונים ואחריו זיהוי על ידי LC-MS1. FPOP מייצר ריכוז גבוה של רדיקלים הידרוקסיל ב situ על ידי לייזר UV פלאש פוטוליזה של מי חמצן. רדיקלים הידרוקסיל אלה הם מאוד תגובתיים וקצרים, נצרך בערך ציר זמן microsecond בתנאים FPOP2. רדיקלים הידרוקסיל אלה לפזר דרך מים וחמצון רכיבים אורגניים שונים בתמיסה בקצבים קינטיים בדרך כלל החל מהיר (~10 6 M-1 s-1)כדי דיפוזיהמבוקרת 3. כאשר הרדיקלי הידרוקסיל נתקל משטח חלבון, הרדיקלי יהיה חמצון שרשראות צד חומצת אמינו על פני השטח של החלבון, וכתוצאה מכך שינוי המוני של חומצת אמינו (בדרך כלל תוספת נטו של אטום חמצן אחד)4. קצב תגובת החמצון בכל חומצת אמינו תלוי בשני גורמים: תגובתיות הטבועה של חומצת אמינו זו (התלויה בשרשרת הצדדית ובהקשר הרצף)4,,5, ונגישות השרשרת הצדדית לרדיקל הידרוקסיל המפזר, המתאם באופן הדוק לאזור הממסהממוצע הנגיש 6,,7. כל חומצות אמינו סטנדרטיות למעט גליצין נצפו כפי שכותרתו על ידי רדיקלים הידרוקסיל תגובתיים מאוד אלה בניסויי FPOP, אם כי בתשואות שונות באופן נרחב; בפועל, סר, ת'ר, אסן ועלא נתפסים לעתים נדירות כחמצון ברוב הדגימות למעט במינונים קיצוניים גבוהים ומזדהים על ידי פיצול ETD ממוקד זהירורגיש 8,9. לאחר חמצון, דגימות מרווה כדי להסיר מי חמצן וחמצון משני (superoxide, חמצן singlet, הידרופרוקסיד פפטידיל, וכו ') הדגימות המיוות מתעכלות לאחר מכן כדי ליצור תערובות של פפטידים מחומצנים, כאשר המידע המבני מוקפא כ"תצלום בזק" כימי בתבניות של מוצרי חמצון של הפפטידיםהשונים (איור 1). כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב ספקטרומטריה מסה (LC-MS) משמש כדי למדוד את כמות חמצון של חומצות אמינו בפפטיד פרוטאוליטי נתון בהתבסס על העוצמות היחסיות של גירסאות מחומצנות ולא חמצון של פפטיד זה. על ידי השוואת טביעת הרגל החמצונית של אותו חלבון המתקבל בתנאים קונפורמיים שונים (למשל, ליגנד-bound לעומת ליגנד חינם), הבדלים בכמות החמצון של אזור נתון של החלבון יכול להיות מתואם ישירות עם הבדלים באזור פני השטח נגיש ממס שלאזור זה 6,7. היכולת לספק מידע טופוגרפי חלבון הופך FPOP טכנולוגיה אטרקטיבית לקביעת מבנה בסדר גבוה יותר של חלבונים, כולל גילוי טיפוליחלבון ופיתוח 10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> איור 1: מבט כולל על FPOP. פני השטח של החלבון משתנים באופן קוולנטי על ידי רדיקלים הידרוקסיל תגובתיים מאוד. הרדיקלים הידרוקסיל יגיבו עם שרשראות צד חומצת אמינו של החלבון בקצב כי הוא מושפע מאוד על ידי הנגישות ממס של השרשרת הצדדית. שינויים טופוגרפיים (לדוגמה, בשל הכריכה של ליגנד כפי שהראה לעיל) יגנו על חומצות אמינו באזור של אינטראקציה מתן תגובה עם רדיקלים הידרוקסיל, וכתוצאה מכך ירידה בעוצמה של פפטיד שונה באות LC-MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
מרכיבים שונים הנוכחים בתמיסת FPOP (למשל, ליגנדים, excipients, מאגרים) יש פעילות טיהור שונה כלפי רדיקלים hydroxyl שנוצר על פוטו-ליזה לייזר של מיחמצן 3. באופן דומה, שינוי קטן בריכוז מי חמצן, פלור לייזר, והרכב מאגר עשוי לשנות את המינון הרדיקלי היעיל, מה שהופך את הרבייה של נתוני FPOP מאתגר על פני הדגימות ובין מעבדות שונות. לכן, חשוב להיות מסוגל להשוות את המינון הרדיקלי hydroxyl זמין להגיב עם חלבון בכל מדגם באמצעות אחד מכמה dosimeters רדיקליהידרוקסיל זמין 12,,13,,14,,15,16. הידרוקסיל רדיקל dosimeters לפעול על ידי מתחרה עם analyte (ועם כל אוכלי הנבלות בתמיסה) עבור הבריכה של רדיקלים הידרוקסיל; המינון היעיל של רדיקלים הידרוקסיל נמדד על ידי מדידת כמות חמצון של הדוסימטר. שים לב כי "מינון רדיקלי הידרוקסיל יעיל" היא פונקציה של הריכוז הראשוני של הידרוקסיל רדיקלי שנוצר ואת מחצית החיים של הרדיקלי. שני פרמטרים אלה תלויים זה בזה חלקית, מה שהופך את המודל הקינטי התיאורטי למורכב במקצת(איור 2). שתי דגימות יכול להיות שונה בפראות רדיקלי ים מחצית חיים תוך שמירה על אותו מינון רדיקלי יעיל על ידי שינוי הריכוז הראשוני של הידרוקסיל רדיקלי נוצר; הם עדיין ייצרו עקבות זהות17. Adenine13 ו Tris12 הם נוח הידרוקסיל רדיקלי dosimeters כי רמת חמצון שלהם ניתן למדוד על ידי ספקטרוסקופיה UV בזמן אמת, המאפשר לחוקרים לזהות במהירות כאשר יש בעיה עם מינון רדיקלי הידרוקסיל יעיל כדי לפתור את הבעיה שלהם. כדי לפתור בעיה זו, dosimeter מוטבע הממוקם במערכת הזרימה מיד לאחר האתר של הקרן שיכול לפקח על האות משינויים בספיגת אדנין בזמן אמת חשוב. זה עוזר בביצוע ניסויים FPOP במאגרים או כל excipient אחר עם רמות שונות באופן נרחב של הידרוקסיל רדיקלי קיבולתניבים 17. פיצוי מינון רדיקלי זה יכול להתבצע בזמן אמת, מניב תוצאות סטטיסטיות לא שונות עבור אותו conformer על ידי התאמת המינון הרדיקלי היעיל.
בפרוטוקול זה, יש לנו הליכים מפורטים לביצוע ניסוי FPOP טיפוסי עם פיצוי מינון רדיקלי באמצעות אדנין כמו מינון רדיקלי אופטי פנימי. שיטה זו מאפשרת לחוקרים להשוות עקבות בין תנאי FPOP בעלי יכולת נקה שונה על-ידי ביצוע פיצוי בזמן אמת.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> איור 2: סימולציה קינטית של פיצוי מבוסס ניסיון. 1 mM אדנין דוסימטר תגובה נמדדת 5 μM ליזוזים analyte עם 1 mM ריכוז רדיקלי הידרוקסיל ראשוני (▪OH t1/2=53 ns), ולהגדיר כתגובה דוסימטר היעד (שחור). עם תוספת של 1 מ"מ של היסטדין אוכלי נבלות, תגובת הדוסימטר (כחול) פוחתת יחד עם כמות חמצון חלבון באופן פרופורציונלי (ציאן). גם מחצית החיים של הרדיקלי הידרוקסיל פוחתת (▪OH t1/2=39 ns). כאשר כמות הידרוקסיל רדיקלי שנוצר גדל כדי לתת תשואה שווה ערך של דוזימטר מחומצן בדגימה עם 1 mM היסטידין אוכל נבלות כפי שהושג עם 1 mM הידרוקסיל רדיקלי בהיעדר s נבלות (אדום), כמות חמצון חלבון המתרחשת באופן דומה הופך זהה (מג'טנטה), בעוד המחצית חיים רדיקלי hydroxyl פוחתת עוד יותר (▪OH t1/2=29 ns). מותאם באישור שארפ J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים (FPOP) היא טכניקת ביולוגיה מבנית מבוססת ספקטרומטריה מסה הבדיקה את שטח פני השטח נגיש ממס של חלבונים. טכניקה זו מסתמכת על התגובה של שרשראות צד חומצת אמינו עם רדיקלים hydroxyl מפזר בחופשיות בתמיסה. FPOP מייצר רדיקלים אלה ב situ על ידי פוטו-ליזה לייזר של מי חמצן, יצירת פרץ של רדיקלים הידרוקסיל כי הוא מרוקן על סדר של microsecond. כאשר רדיקלים הידרוקסיל אלה מגיבים עם שרשרת צד חומצת אמינו נגישה ממס, מוצרי התגובה להפגין שינוי המוני שניתן למדוד וכמת על ידי ספקטרומטריית מסה. מאחר שקצב התגובה של חומצת אמינו תלוי בחלקו במשטח הנגיש הממוצע של חומצת אמינו זו, שינויים מדודים בכמות החמצון של אזור נתון של חלבון יכולים להיות קשורים ישירות לשינויים בנגישות ממס של אזור זה בין קונפורמציות שונות (למשל, ליגנד-bound לעומת ליגנד חינם, מונומר לעומת צבירה, וכו ') FPOP הוחל במספר בעיות בביולוגיה, כולל אינטראקציות חלבון-חלבון, שינויים קונפורמציה חלבון, וכריכת חלבון ליגנד. כמו הריכוז הזמין של רדיקלים הידרוקסיל משתנה בהתאם לתנאים ניסיוניים רבים בניסוי FPOP, חשוב לפקח על המינון הרדיקלי היעיל אליו אנליטיט החלבון נחשף. ניטור זה מושגת ביעילות על ידי שילוב dosimeter מוטבע כדי למדוד את האות מתגובת FPOP, עם fluence לייזר מותאם בזמן אמת כדי להשיג את הכמות הרצויה של חמצון. עם פיצוי זה, ניתן לקבוע שינויים בטופוגרפיה של חלבונים המשקפים שינויים קונפורמיים, משטחים מחייבים ליגנד ו/או ממשקי אינטראקציה חלבון-חלבון ניתן לקבוע בדגימות הטרוגניות באמצעות כמויות מדגם נמוכות יחסית.

השוואה של טביעת הרגל פפטיד שרשרת כבדה של adalimumab biosimilar במאגר פוספט וכאשר מחומם ב 55 ° C עבור 1 h להראות תוצאות מעניינות. מבחן t של התלמיד משמש לזיהוי פפטידים שהשתנו באופן משמעותי בשני תנאים אלה (p ≤ 0.05). הפפטידים 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413, ו 414-420 מראים הגנה משמעותית מפני ממס כאשר החלבון מחומם לאצ?...

Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים היא טכניקה מתפתחת לאפיון מבני של חלבונים. תוספי ממס שונים ליגנדים יש תכונות שונות הידרוקסיל רדיקלי ים. כדי להשוות את מבנה החלבון בתנאים שונים, פיצוי בזמן אמת של רדיקלים הידרוקסיל שנוצר בתגובה נדרש כדי לנרמל את תנאי התגובה.

מתן אפשרות לפיצוי בזמן אמת בחומציות פוטוכימיות מהירות של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

השיטה מאפשרת מדידה של אישור חלבון ואינטראקציות חלבון. הרכב החיץ, טוהר הדגימה ודרישות ריכוז החלבון גמישים ומאפשרים לשיטה לטפל בבעיות מבניות מאתגרות. טכניקה זו מאפשרת דחיסה של דגימות במגוון רחב של מערכות חיץ שונות.באמצעות שיטת dosimetry שלנו, חוקרים יכולים לפקח על כמה טוב התגובות שלהם תיוג עובדים בזמן אמת. יישום אחד של טכנולוגיה זו הוא בפיתוח תרופות כי זה מאפשר לחוקרים לבדוק ניסוחים שונים באופן נרחב סמים וכיצד הם משפיעים על מבנה החלבון. כדי להכין את הספסל האופטי FPOP.תחילה להפעיל את הלייזר ולהגדיר את הלייזר להדק חיצוני, אנרגיה מתמדת ללא החלפת גז. כאשר הלייזר התחמם להגדיר את אנרגיית הלייזר לכל פולס בין 80 ל 120 מיליגרם לדופק ולהשתמש לפיד בוטאן בעדינות לשרוף את קידוד פולימיד של נימי במקום שבו dosimeter מוטבע יקרא את האות סופג ב 265 ננומטר לאחר חשיפה לייזר. השתמש לנגב ללא מוך ומתנול כדי לנגב בעדינות את הפסולת מן נימי ולהניח את נימי ניקה דרך נתיב הקרן של הלייזר לתוך dosimeter מוטבע.לחץ על הידית בחלק העליון של dosimeter מוטבע כדי לפתוח את הציר ולהסיר את המחזיקים המגנטיים. מניחים את נימי חריץ המכונה של dosimeter מוטבע באמצעות המחזיקים המגנטיים כדי לשמור על נימי במקום ולסגור את ציר dosimeter מעל נימי לחיצה על הציר עד המנוף ננעל במקום. לחץ על כפתור פלאש ההתחלה בתוכנת dosimetry כדי להתחיל לירות בלייזר excimer ולהגדיר את קצב החזרה מראש בין 10 ל 20 הרץ בתוכנת dosimetry עם ירי לייזר להזיז את השלב ממונע דרך טווח התנועה שלה, להבטיח כי הקרן נשארת מרוכזת על הצמצם, כי הצללית של נימי ניתן לראות לאורך כל הדרך.לאחר מכן לשטוף את נימי עם מים ב 20 microliters לדקה לפחות דקה ולחץ להתחיל נתונים בתוספת אפס אוטומטי בתוכנת dosimeter לאפס את dosimeter למים לפני תחילת איסוף הנתונים. כדי לבצע ניסוי FPOP להוסיף שני microliters של מי חמצן ל 18 microliters של פתרון FPOP ולהשתמש פיפטה בעדינות לערבב את הפתרון במהירות לאסוף את הפתרון בתחתית הצינור על ידי צנטריפוגה מיד להשתמש מזרק גז הדוק כדי לטעון את הפתרון לתוך משאבת מזרק. לחץ להתחיל משאבה ולהתחיל נתונים בתוכנת dosimeter כדי להתחיל את הזרימה על משאבת המזרק בקצב הזרימה המתאים ולהשתמש dosimeter מוטבע כדי לפקח על קריאת אדנין בזמן אמת עד האות סופג ב 265 ננומטר מייצב איסוף המדגם במיכל פסולת.כדי להתחיל לירות בלייזר בקצב החזרה המוגדר מראש, לחץ על לחצן הפלאש של ההפעלה בתוכנת dosimeter ולהשתמש ב- dosimeter מוטבע כדי לפקח על קריאת אדנין בזמן אמת. ההבדל בספיגה ב 265 ננומטר עם הלייזר כבוי הלייזר על יהיה סופגי דלתא ב 265 ננומטר קריאה. כדי להבטיח כי רדיקלי הידרוקסיל דומים זמינים להגיב עם חלבונים על פני דגימות שונות.השווה את סופגי הדלתא בקריאה של 265 ננומטר שהושגה עם הדוזימטר ההפניתי עם ספיגת הדלתא הרצויה בקריאה של 265 ננומטר שהתקבלה מניסויים או פקדים קודמים. אם הקריאה היא ברמה הרצויה לאסוף את המדגם מיד לאחר לייזר או קרינה במאגר מרווה. כדי לפצות על המינון הרדיקלי היעיל כדי להשוות את קריאות הספיגה לשנות את ריכוז מי חמצן, לשנות את אנרגיית הלייזר לכל פולס או לשנות את מישור המוקד של עדשת ההתמקדות כדי להגדיל את שטף הלייזר.כדי לבצע שינוי יחידת ספיגה של יותר מ -10 מילי בדלתא סופגים קוראים מחדש את המדגם עם מי חמצן פחות או יותר והפעלה חוזרת של המדגם כפי שהוכח. כדי לבצע שינוי קטן בקריאת הספיגה בזמן אמת, השתמש בשלב ממונע 50 מילימטר כדי להתאים את המיקום של עדשת ההתמקדות כדי להתאים את מישור המוקד של קרן האירוע. כדי למדוד את הכמות האפקטיבית של הידרוקסיל רדיקלי נוכח המדגם לאחר קרינת לייזר לפקח על ספיגת דלתא אדנין ב 265 ננומטר בזמן אמת עם גלאי נימי UV מוטבע באמצעות השלב ממונע כדי להתאים את מיקום העדשה עד הדלתא סופג ב 265 ננומטר קריאה שווה לקריאה הרצויה.השוואה של טביעת הרגל פפטיד שרשרת כבדה של biosimilar adilumumab במאגר פוספט ולאחר חימום ב 55 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת מגלה כי אזורי פפטיד המצוין להפגין הגנה משמעותית מפני ממיסים כאשר החלבון מחומם כדי ליצור אגרגטים. שימוש dosimeter מוטבע בזמן אמת כדי לפקח על ההבדל סופג אדנין לפני ואחרי לייזר או קרינה עולה כי שינוי דומה ברמת סופג אדנין נצפתה במאגר MES לעומת חיץ פוספט. בעוד החמצון הממוצע של הפפטידים נמוך יותר בנוכחות מאגר MES בהשוואה למאגר פוספט.עם זאת, כמו שטף הלייזר הוא גדל יש תגובה שווה אדנין dosimetry ערכי חמצון פפטיד הממוצע הם כמעט זהים לאחר FPOP ומאגר MES ומאגר פוספט. כמו קריאת dosimetry מושפע ריכוז חמצן שטף לייזר, כמו גם נבלות רדיקלי. יש לדאוג כי התגובה dosimetry בין סקר מדגם קרוב זה לזה.mutagenesis מכוון האתר משמש לעתים קרובות כדי לחקור אתרים מוגנים FPOP. זה מאפשר לחוקרים לקבוע אם השינויים נובעים אליסטר. טכניקה זו מקלה על השוואת חלבונים במאגרים שונים או ניסוחים המאפשרים לחוקרים לקבוע את ההשפעה של תוספים שונים על אישור חלבון.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

המרת מימן-דאוטריום electrospray יינון זמן נפתרה ספקטרומטריית מסה לימוד מבנה החלבון Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

קביעת תוכן הגליקוגן בקיאנובקטריה

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

חידוש ערוכים Microelectrodes זהב מצויד מנתח תא בזמן אמת

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

קביעת כמות מועטת פרוטאז ברקמת העכבר של תמציות באמצעות ספקטרומטר מסה MALDI-תוף: מניפולציה PH כדי לגרום לשינויים ירידה לפרטים

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

בזמן אמת, חצי אוטומטי מדידה פלורסנט של משטח נתיב האוויר הנוזלי של ה-pH העיקרי של תאים אפיתל דרכי האוויר האנושי

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

אפיון חלבונים סלולריים עם החמצון בתוך תא מהיר לפוטוכימיקלים של חלבונים

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl החליפין ג'ל שינוי שיטת להגדרה כמותית של פלמילציה של חלבונים קרום המוח

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...