Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

हम राष्ट्रीय सामान्य चिकित्सा विज्ञान संस्थान अनुदान R43GM125420-01 से अनुसंधान वित्तपोषण को स्वीकार करते हैं, जो उच्च ऊर्जा एफओपी के लिए मानकीकरण और डॉसिमेट्री प्रोटोकॉल के विकास के लिए एक बेंचटॉप एफपीओपी डिवाइस और R01GM127267 के वाणिज्यिक विकास का समर्थन करता है।

1. एफओपी के लिए ऑप्टिकल बेंच और केशिका तैयार करें
सावधानी: KrF एक्सिमर लेजर अत्यधिक आंखों के खतरे हैं, और प्रत्यक्ष या परिलक्षित प्रकाश स्थायी आंखों को नुकसान पहुंचा सकता है। हमेशा उचित आंखों की...

द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक तकनीकों, जिसमें हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज, रासायनिक क्रॉस-लिंकिंग, सहसंयोजक लेबलिंग, और देशी स्प्रे मास स्पेक्ट्रोमेट्री और आयन गतिशीलता शामिल ह?...

प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (FPOP) प्रोटीन के विलायक उजागर सतह क्षेत्र के अल्ट्रा-फास्ट सहसंयोजक संशोधन द्वारा प्रोटीन स्थलाकृतिक परिवर्तनों के निर्धारण के लिए एक उभरती हुई तकनीक है जिसके बाद एलसी-एमएस1द्वारा पता लगाया जाता है। एफओपी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के यूवी लेजर फ्लैश फोटोलिसिस द्वारा सीटू में हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की उच्च सांद्रता उत्पन्न करता है। ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स बहुत प्रतिक्रियाशील और अल्पकालिक होते हैं, जो एफओपी शर्तों2के तहत लगभग एक माइक्रोसेकंड टाइमस्केल पर खपत होते हैं। ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स पानी के माध्यम से फैलते हैं और गतिज दरों पर समाधान में विभिन्न कार्बनिक घटकों को ऑक्सीकरण करते हैं आम तौर पर तेजी से (~ 106 एम-1 एस-1)से लेकरप्रसार-नियंत्रित 3तक। जब हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी एक प्रोटीन सतह का सामना करता है, तो कट्टरपंथी प्रोटीन सतह पर अमीनो एसिड साइड चेन को ऑक्सीकरण करेगा, जिसके परिणामस्वरूप उस अमीनो एसिड (आमतौर पर एक ऑक्सीजन परमाणु का शुद्ध जोड़)4का एक बड़ा बदलाव होगा। किसी भी अमीनो एसिड पर ऑक्सीकरण प्रतिक्रिया की दर दो कारकों पर निर्भर करती है: उस अमीनो एसिड की अंतर्निहित प्रतिक्रियाशीलता (जो साइड चेन और अनुक्रम संदर्भ पर निर्भर करती है)4,,5 और उस साइड चेन की पहुंच डिफ्यूजिंग हाइड्रोक्सिल रेडिकल से होती है, जो औसत सॉल्वेंट सुलभ सतह क्षेत्र6,,7से निकटता से संबंधित है। ग्लाइसिन को छोड़कर सभी मानक अमीनो एसिड FPOP प्रयोगों में इन अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों द्वारा लेबल के रूप में देखा गया है, हालांकि व्यापक रूप से अलग पैदावार पर; व्यवहार में, सेर, थ्र, एसेन और अला को शायद ही कभी उच्च कट्टरपंथी खुराकों को छोड़कर अधिकांश नमूनों में ऑक्सीकृत के रूप में देखा जाता है और सावधान और संवेदनशील लक्षित ईटीडी विखंडन8, 9,द्वारा पहचानाजाताहै। ऑक्सीकरण के बाद, हाइड्रोजन पेरोक्साइड और माध्यमिक ऑक्सीडेंट (सुपरऑक्साइड, सिंगलेट ऑक्सीजन, पेप्टिडाइल हाइड्रोपेरॉक्साइड आदि) को हटाने के लिए नमूने बुझाए जाते हैं। शमन नमूनों को ऑक्सीडाइज्ड पेप्टाइड्स के मिश्रण उत्पन्न करने के लिए प्रोटियोलिटिक रूप से पचाया जाता है, जहां संरचनात्मक जानकारी विभिन्न पेप्टाइड्स(चित्रा 1)के ऑक्सीकरण उत्पादों के पैटर्न में रासायनिक "स्नैपशॉट" के रूप में जम जाती है। उस पेप्टाइड के ऑक्सीकृत और अक्ओसीडीकृत संस्करणों की सापेक्ष तीव्रता के आधार पर दिए गए प्रोटियोलिटिक पेप्टाइड में अमीनो एसिड के ऑक्सीकरण की मात्रा को मापने के लिए बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री (एलसी-एमएस) के साथ मिलकर तरल क्रोमेटोग्राफी का उपयोग किया जाता है। विभिन्न अनुरूप परिस्थितियों (उदाहरण के लिए, लिगांड-बाउंड बनाम लिगांड-मुक्त) के तहत प्राप्त एक ही प्रोटीन के इस ऑक्सीडेटिव पदचिह्न की तुलना करके, प्रोटीन के किसी दिए गए क्षेत्र के ऑक्सीकरण की मात्रा में अंतर सीधे उस क्षेत्र के विलायक-सुलभ सतह क्षेत्र में अंतर के साथ सहसंबद्ध किया जा सकता है6,,7। प्रोटीन स्थलाकृतिक जानकारी प्रदान करने की क्षमता प्रोटीन चिकित्सीय खोज और विकास10, 11,11सहित प्रोटीन के उच्च क्रम संरचना निर्धारण के लिए एफओपी एक आकर्षक तकनीक बनाती है।
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> चित्रा 1: FPOP का अवलोकन। प्रोटीन की सतह को अत्यधिक प्रतिक्रियाशील हाइड्रोक्सिल कणों द्वारा सहसंयोजक रूप से संशोधित किया जाता है। हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स प्रोटीन की अमीनो एसिड साइड चेन के साथ एक दर पर प्रतिक्रिया करेंगे जो साइड चेन की सॉल्वेंट पहुंच से दृढ़ता से प्रभावित होता है। स्थलाकृतिक परिवर्तन (उदाहरण के लिए, ऊपर दिखाए गए लिगामेंट के बाध्यकारी के कारण) हाइड्रोक्सिल कणों के साथ प्रतिक्रिया करने से बातचीत के क्षेत्र में अमीनो एसिड की रक्षा करेगा, जिसके परिणामस्वरूप एलसी-एमएस सिग्नल में संशोधित पेप्टाइड की तीव्रता में कमी आएगी। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
एफओपी समाधान में मौजूद विभिन्न घटकों (उदाहरण के लिए, लिगांड, एक्सपिएजेंट्स, बफ़र्स) में हाइड्रोजन पेरोक्साइड3के लेजर फोटोलिसिस पर उत्पन्न हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की ओर अलग-अलग सफाई गतिविधि होती है। इसी तरह, पेरोक्साइड एकाग्रता, लेजर फ्लूसेंस और बफर संरचना में एक छोटा सा परिवर्तन प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को बदल सकता है, जिससे नमूनों में और विभिन्न प्रयोगशालाओं के बीच एफपीओपी डेटा का प्रजनन चुनौतीपूर्ण हो सकता है। इसलिए , यह महत्वपूर्ण है कि प्रत्येक नमूने में प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए उपलब्ध हाइड्रोक्सिल रेडिकल डोज की तुलना करने में सक्षम होना चाहिए, जिसमें से एक कई उपलब्ध हाइड्रोक्सिल रेडिकल डोसीमीटर12,13 ,14,15,16में16से एक है । हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी कणों के पूल के लिए एनालिट (और समाधान में सभी सफाई कर्मियों के साथ) के साथ प्रतिस्पर्धा करके हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसिमेटर कार्य करते हैं; हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स की प्रभावी खुराक को डोसिमीटर के ऑक्सीकरण की मात्रा को मापकर मापा जाता है। ध्यान दें कि "प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक" हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी उत्पन्न की प्रारंभिक एकाग्रता और कट्टरपंथी के आधे जीवन दोनों का एक कार्य है। ये दोनों पैरामीटर आंशिक रूप से एक-दूसरे पर निर्भर हैं, जिससे सैद्धांतिक गतिज मॉडलिंग कुछ जटिल(चित्रा 2)हो जाती है । दो नमूनों बेतहाशा अलग प्रारंभिक कट्टरपंथी आधा जीवन हो सकता है, जबकि अभी भी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी का गठन की प्रारंभिक एकाग्रता को बदलने के द्वारा एक ही प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को बनाए रखने; वे अभी भी समान पैरों के निशानउत्पन्न करेंगे 17. एडेनिन13 और ट्राइस12 सुविधाजनक हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी डोसीमीटर हैं क्योंकि ऑक्सीकरण के उनके स्तर को वास्तविक समय में यूवी स्पेक्ट्रोस्कोपी द्वारा मापा जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को प्रभावी हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी खुराक के साथ समस्या होने पर जल्दी से पहचानने और उनकी समस्या का निवारण करने की अनुमति मिलती है। इस समस्या को हल करने के लिए, विकिरण की साइट के बाद सीधे प्रवाह प्रणाली में स्थित एक इनलाइन डोसिमेटर जो वास्तविक समय में एडेनिन अवशोषण परिवर्तनों से संकेत की निगरानी कर सकता है महत्वपूर्ण है। यह बफ़र्स या किसी अन्य एक्सपिएजेंट में एफपीओपी प्रयोगों को करने में मदद करता है जिसमें हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी मैला ढोने की क्षमता17के व्यापक रूप से भिन्न स्तर हैं । इस कट्टरपंथी खुराक मुआवजा वास्तविक समय में किया जा सकता है, प्रभावी कट्टरपंथी खुराक को समायोजित करके एक ही अनुरूप के लिए सांख्यिकीय अविवेच्य परिणाम उपज ।
इस प्रोटोकॉल में, हमारे पास आंतरिक ऑप्टिकल कट्टरपंथी डोसिमेटर के रूप में एडेनिन का उपयोग करके कट्टरपंथी खुराक मुआवजे के साथ एक विशिष्ट एफओपी प्रयोग करने के लिए विस्तृत प्रक्रियाएं हैं। यह विधि जांचकर्ताओं को एफपीओपी स्थितियों में पैरों के निशान की तुलना करने की अनुमति देती है जिनमें वास्तविक समय में मुआवजा देकर अलग-अलग सफाई क्षमता होती है।
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> चित्रा 2: डोसिमेट्री-आधारित मुआवजे का काइनेटिक सिमुलेशन। 1 एमएमए एडीन डोसिमेटर प्रतिक्रिया को 1 एमएम प्रारंभिक हाइड्रोक्सिल रेडिकल एकाग्रता (▪ओएच टी1/2=53 एनएस) के साथ 5 माइक्रोन लिसोजिमे विश्लेषण में मापा जाता है, और एक लक्ष्य डोसिमेटर प्रतिक्रिया (काला) के रूप में निर्धारित किया जाता है। मेहतर के 1 mm के अलावा हिस्टिडीन उत्तेजित, डोसिमेटर प्रतिक्रिया (नीला) आनुपातिक तरीके से प्रोटीन ऑक्सीकरण की मात्रा के साथ कम हो जाती है (सियान)। हाइड्रोक्सिल रेडिकल का आधा जीवन भी कम हो जाता है (▪ओएच टी1/2=39 एनएस)। जब हाइड्रोक्सिल रेडिकल उत्पन्न की मात्रा में वृद्धि होती है, तो 1 एमएम हिस्टिडीन मेहतर के साथ नमूने में ऑक्सीडाइज्ड डोसिमेटर की बराबर उपज देने के लिए, जैसा कि मेहतर (लाल) की अनुपस्थिति में 1 एमएम हाइड्रोक्सिल रेडिकल के साथ हासिल किया जाता है, तो प्रोटीन ऑक्सीकरण की मात्रा जो होती है वह समान (मैजेंटा) हो जाती है, जबकि हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी आधा जीवन और भी कम हो जाता है (▪ ओह टी1/2=29 ns) । शार्प जेएस, एएम फार्मासियूट रेव 22, 50-55, 2019 से अनुमति के साथ अनुकूलित। <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण (एफपीओपी) एक बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री आधारित संरचनात्मक जीव विज्ञान तकनीक है जो प्रोटीन के विलायक-सुलभ सतह क्षेत्र की जांच करती है। यह तकनीक हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स के साथ अमीनो एसिड साइड चेन की प्रतिक्रिया पर निर्भर करती है जो समाधान में स्वतंत्र रूप से फैलाना है। एफओपी हाइड्रोजन पेरोक्साइड के लेजर फोटोलिसिस द्वारा सीटू में इन कणों को उत्पन्न करता है, जो हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स का एक फट पैदा करता है जो माइक्रोसेकंड के क्रम पर समाप्त हो जाता है। जब ये हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स सॉल्वेंट-सुलभ अमीनो एसिड साइड चेन के साथ प्रतिक्रिया करते हैं, तो प्रतिक्रिया उत्पाद एक बड़े पैमाने पर बदलाव प्रदर्शित करते हैं जिसे बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा मापा और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। चूंकि अमीनो एसिड की प्रतिक्रिया की दर उस अमीनो एसिड की औसत सॉल्वेंट सुलभ सतह पर निर्भर करती है, इसलिए प्रोटीन के किसी दिए गए क्षेत्र के ऑक्सीकरण की मात्रा में मापा गया परिवर्तन विभिन्न अनुरूपों के बीच उस क्षेत्र की विलायक पहुंच में परिवर्तन से सीधे सहसंबद्ध हो सकता है (जैसे, लिगांड-बाउंड बनाम लिगांड-फ्री, मोनोमर बनाम कुल, आदि) एफपीओपी को जीव विज्ञान में कई समस्याओं में लागू किया गया है, जिसमें प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन, प्रोटीन कॉन्फॉर्मेशनल बदलाव और प्रोटीन-लिगांड बाइंडिंग शामिल हैं । चूंकि हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथियों की उपलब्ध एकाग्रता एफओपी प्रयोग में कई प्रयोगात्मक स्थितियों के आधार पर भिन्न होती है, इसलिए प्रभावी कट्टरपंथी खुराक की निगरानी करना महत्वपूर्ण है जिसके लिए प्रोटीन एनालिटे उजागर होता है। इस निगरानी को FPOP प्रतिक्रिया से संकेत को मापने के लिए एक इनलाइन डोसिमेटर को शामिल करके कुशलतापूर्वक प्राप्त किया जाता है, जिसमें ऑक्सीकरण की वांछित मात्रा को प्राप्त करने के लिए वास्तविक समय में लेजर फ्लूसेंस समायोजित किया जाता है। इस मुआवजे के साथ, प्रोटीन स्थलाकृति में परिवर्तन अनुरूप परिवर्तन, ligand बाध्यकारी सतहों को दर्शाती है, और/या प्रोटीन-प्रोटीन इंटरैक्शन इंटरफेस अपेक्षाकृत कम नमूना मात्रा का उपयोग कर विषम नमूनों में निर्धारित किया जा सकता है ।

फॉस्फेट बफर में अडालिमुमाब बायोसमान के भारी चेन पेप्टाइड पदचिह्न की तुलना और जब 1 एच के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर गर्म दिलचस्प परिणाम दिखाते हैं। छात्र के टी-टेस्ट का उपयोग पेप्टाइड्स की पहचान के लिए कि?...

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Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

प्रोटीन का फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण प्रोटीन के संरचनात्मक लक्षण वर्णन के लिए एक उभरती हुई तकनीक है। विभिन्न सॉल्वेंट एडिटिव्स और लिगामेंट्स में विभिन्न हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी सफाई गुण होते हैं। विभिन्न परिस्थितियों में प्रोटीन संरचना की तुलना करने के लिए, प्रतिक्रिया में उत्पन्न हाइड्रोक्सिल कणों के वास्तविक समय के मुआवजे की प्रतिक्रिया स्थितियों को सामान्य करने के लिए आवश्यक है।

प्रोटीन स्थलाकृति परिवर्तन के निर्धारण के लिए प्रोटीन के फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीडेशन में वास्तविक समय मुआवजा सक्षम करना

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

विधि प्रोटीन पुष्टि और प्रोटीन इंटरैक्शन के माप की सुविधा प्रदान करती है। बफर संरचना, नमूना शुद्धता और प्रोटीन एकाग्रता आवश्यकताएं चुनौतीपूर्ण संरचनात्मक समस्याओं का समाधान करने की विधि की अनुमति देने वाली लचीली हैं। यह तकनीक विभिन्न बफर सिस्टम की एक विस्तृत विविधता में नमूनों के संपीड़न की अनुमति देती है।हमारे डॉसिमेट्री विधि का उपयोग करना, शोधकर्ताओं की निगरानी कर सकते है कितनी अच्छी तरह उनके लेबलिंग प्रतिक्रियाओं वास्तविक समय में काम कर रहे हैं । इस तकनीक का एक आवेदन दवा के विकास में है क्योंकि यह शोधकर्ताओं को व्यापक रूप से विभिन्न दवा योगों का परीक्षण करने की अनुमति देता है और वे प्रोटीन संरचना को कैसे प्रभावित करते हैं। ताकि एफओपी ऑप्टिकल बेंच तैयार की जा सके।सबसे पहले लेजर चालू करें और लेजर को बाहरी ट्रिगर, निरंतर ऊर्जा और कोई गैस प्रतिस्थापन के लिए सेट करें। जब लेजर गर्म है पल्स प्रति पल्स प्रति 80 से 120 मिलीग्राम के बीच लेजर ऊर्जा सेट और एक ब्यूटेन मशाल का उपयोग करने के लिए धीरे से जगह है जिस पर इनलाइन dosimeter लेजर जोखिम के बाद २६५ नैनोमीटर पर अवशोषित संकेत पढ़ा जाएगा पर केशिका की कोडिंग जला । केशिका से मलबे को धीरे-धीरे पोंछने के लिए एक लिंट-फ्री वाइप और मेथनॉल का उपयोग करें और लेजर के बीम पथ के माध्यम से और इनलाइन डोसिमेटर में साफ किए गए केशिका को रखें।काज को खोलने और चुंबकीय धारकों को हटाने के लिए इनलाइन डॉसिमेटर के शीर्ष पर लीवर दबाएं। केशिका को जगह में केशिका रखने के लिए चुंबकीय धारकों का उपयोग करके इनलाइन डॉसिमेटर की मशीन नाली में केशिका रखें और केशिका पर काज को बंद कर दें जब तक कि लीवर जगह में ताले नहीं हो जाता। एक्सिमर लेजर को फायरिंग शुरू करने के लिए डोसिमेट्री सॉफ्टवेयर में स्टार्ट फ्लैश बटन पर क्लिक करें और लेजर फायरिंग के साथ डोसिमेट्री सॉफ्टवेयर में 10 से 20 हर्ट्ज के बीच प्रीसेट पुनरावृत्ति दर निर्धारित करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि बीम एपर्चर पर केंद्रित रहता है और केशिका का सिल्हूट भर में देखा जा सकता है।फिर कम से कम एक मिनट के लिए प्रति मिनट 20 माइक्रोलीटर पर पानी के साथ केशिका फ्लश और क्लिक करें डेटा संग्रह शुरू करने से पहले पानी के लिए डोसिमेटर शून्य करने के लिए डोसिमेटर सॉफ्टवेयर में डेटा प्लस ऑटो शून्य शुरू करें। एफओपी प्रयोग करने के लिए एफपीओपी समाधान के 18 माइक्रोलीटर में हाइड्रोजन पेरोक्साइड के दो माइक्रोलीटर जोड़ें और समाधान को धीरे-धीरे मिलाने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें ताकि समाधान को जल्दी से अपकेंद्री द्वारा ट्यूब के नीचे एकत्र किया जा सके और तुरंत एक सिरिंज पंप में समाधान लोड करने के लिए गैस टाइट सिरिंज का उपयोग किया जा सके। क्लिक करें पंप शुरू करें और डोसिमीटर सॉफ्टवेयर में डेटा शुरू करने के लिए उपयुक्त प्रवाह दर पर सिरिंज पंप पर प्रवाह शुरू करने और इनलाइन dosimeter का उपयोग करने के लिए वास्तविक समय एडेनाइन पढ़ने की निगरानी जब तक २६५ नैनोमीटर पर शोषक संकेत एक अपशिष्ट कंटेनर में नमूना इकट्ठा स्थिर ।प्रीसेट पुनरावृत्ति दर पर लेजर फायरिंग शुरू करने के लिए अंत ऊर्जा डॉसिमेटर सॉफ्टवेयर में स्टार्ट फ्लैश बटन क्लिक करें और वास्तविक समय एडेनिन पढ़ने की निगरानी के लिए इनलाइन डोसिमेटर का उपयोग करें। लेजर बंद और लेजर पर 265 नैनोमीटर पर अवशोषण में अंतर 265 नैनोमीटर पढ़ने पर डेल्टा शोषक होगा। यह सुनिश्चित करने के लिए कि विभिन्न नमूनों में प्रोटीन के साथ प्रतिक्रिया करने के लिए तुलनीय हाइड्रोक्सिल रेडिकल्स उपलब्ध हैं।पिछले प्रयोगों या नियंत्रणों से प्राप्त 265 नैनोमीटर पढ़ने पर इच्छा डेल्टा शोषकों के साथ इनलाइन डोसिमेटर के साथ प्राप्त 265 नैनोमीटर रीडिंग पर डेल्टा शोषकों की तुलना करें। यदि रीडिंग वांछित स्तर पर है तो क्वेंच बफर में लेजर या विकिरण के तुरंत बाद नमूना एकत्र करें। प्रभावी कट्टरपंथी खुराक की भरपाई करने के लिए अवशोषण रीडिंग हाइड्रोजन पेरोक्साइड एकाग्रता बदलने के लिए, पल्स प्रति लेजर ऊर्जा बदलने या लेजर प्रवाह को बढ़ाने के लिए ध्यान केंद्रित लेंस के फोकल विमान बदल जाते हैं ।डेल्टा शोषकों में 10 से अधिक मिली अवशोषित इकाई परिवर्तन करने के लिए कम या ज्यादा हाइड्रोजन पेरोक्साइड के साथ नमूना रीमेक और प्रदर्शन के रूप में नमूना फिर से दौड़ना । वास्तविक समय में अवशोषण पढ़ने में एक छोटा सा परिवर्तन करने के लिए, घटना बीम के फोकल विमान को समायोजित करने के लिए ध्यान केंद्रित लेंस की स्थिति को समायोजित करने के लिए 50 मिलीमीटर मोटरचालित चरण का उपयोग करें। लेजर विकिरण के बाद नमूने में मौजूद हाइड्रोक्सिल कट्टरपंथी की प्रभावी मात्रा को मापने के लिए एक इनलाइन यूवी केशिका डिटेक्टर के साथ वास्तविक समय में 265 नैनोमीटर पर एडेनिन डेल्टा शोषकों की निगरानी करने के लिए लेंस की स्थिति को समायोजित करने के लिए जब तक 265 नैनोमीटर पढ़ने पर डेल्टा शोषक वांछित पढ़ने के बराबर है।फॉस्फेट बफर में आदिलुमुमाब बायोसमान के भारी श्रृंखला पेप्टाइड पदचिह्न की तुलना और एक घंटे के लिए 55 डिग्री सेल्सियस पर गर्म करने के बाद पता चलता है कि संकेत पेप्टाइड क्षेत्रों सॉल्वैंट्स से महत्वपूर्ण सुरक्षा प्रदर्शित करता है जब प्रोटीन को एकत्र करने के लिए गर्म किया जाता है। लेजर या विकिरण से पहले और बाद में एडेनिन शोषकों में अंतर की निगरानी करने के लिए वास्तविक समय में एक इनलाइन डॉसिमेटर का उपयोग करना इंगित करता है कि फॉस्फेट बफर की तुलना में एमईएस बफर में एडेनिन शोषक स्तर में तुलनीय परिवर्तन देखा जाता है। जबकि फॉस्फेट बफर की तुलना में एमईएस बफर की उपस्थिति में पेप्टाइड्स का औसत ऑक्सीकरण कम होता है।हालांकि, लेजर फ्लूसेंस के बराबर एडेनिन डोसिमेट्री प्रतिक्रिया के लिए बढ़ जाता है औसत पेप्टाइड ऑक्सीकरण मूल्य एफओपी और एमईएस बफर और फॉस्फेट बफर के बाद लगभग समान होते हैं। के रूप में डॉसिमेट्री पढ़ने लेजर फ्लूसेंस पेरोक्साइड एकाग्रता के साथ ही कट्टरपंथी मेहतर से प्रभावित है। ध्यान रखें कि नमूना सर्वेक्षण के बीच डॉसिमेट्री प्रतिक्रिया एक दूसरे के करीब है।साइट निर्देशित म्यूटेनेसिस का उपयोग अक्सर एफओपी में संरक्षित साइटों की जांच करने के लिए किया जाता है। यह शोधकर्ताओं को यह निर्धारित करने की अनुमति देता है कि एलिस्टेयर के कारण परिवर्तन होते हैं या नहीं। यह तकनीक विभिन्न बफ़र्स या योगों में प्रोटीन की तुलना की सुविधा प्रदान करती है जो शोधकर्ताओं को प्रोटीन की पुष्टि पर विभिन्न एडिटिव्स के प्रभाव को निर्धारित करने की अनुमति देती है।

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

प्रोटीन संरचना और गतिशीलता के अध्ययन के लिए समय का समाधान electrospray ionization हाइड्रोजन-ड्यूटेरियम एक्सचेंज मास स्पेक्ट्रोमेट्री

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

स्मार्टफ़ोन द्वारा डीएनए फ्रेगमेंट पृथक्करण का वास्तविक समय ट्रैकिंग

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Cyanobacteria में ग्लाइकोजन सामग्री का निर्धारण

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

सरणी गोल्ड Microelectrodes के पुनर्जनन एक वास्तविक समय सेल विश्लेषक के लिए सुसज्जित

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

मालदी द्वारा माउस ऊतक निष्कर्षों में विशिष्टता को छेड़ने का संकल्प-तोफ मास स्पेक्ट्रोमेट्री: विशिष्टता परिवर्तन के कारण पीएच हेर-फेर

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

एकल अणु बल स्पेक्ट्रोस्कोपी के लिए प्रोटीन की आबंध स्थिरीकरण

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

डीएनए किनारा विनिमय प्रतिक्रिया की वास्तविक समय अवलोकन Rad51 द्वारा मध्यस्थता

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

वास्तविक समय, अर्ध-स्वचालित वायुमार्ग की सतह तरल प्राथमिक मानव Airway उपकला कोशिकाओं के pH का मापन

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

प्रोटीन के इन-सेल फास्ट फोटोकेमिकल ऑक्सीकरण के साथ सेलुलर प्रोटीन की विशेषता

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

मस्तिष्क झिल्ली प्रोटीन के Palmitoylation के मात्रात्मक निर्धारण के लिए Acyl-PEGyl एक्सचेंज जेल शिफ्ट परख

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...