Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
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우리는 고에너지 FPOP에 대한 표준화 및 dosimetry 프로토콜의 개발을위한 벤치 탑 FPOP 장치 및 R01GM127267의 상업적 개발을 지원하는 일반 의학 연구소의 연구 자금을 인정합니다.

1. 광학 벤치와 FPOP용 모세관 준비
주의: KrF 엑시머 레이저는 극도의 눈 의 위험이며, 직접 또는 반사된 빛은 영구적인 눈 손상을 일으킬 수 있습니다. 항상 적절한 눈 보호 기능을 착용하고, 가능한 경우 빔 경로 근처에 반사 물체가 있는지 방지하고, 엔지니어링 컨트롤을 사용하여 활성 레이저에 대한 무단 액세스를 방지하고 길 잃은 반사를 억제합니다.
<ol><li>FPOP 옵티컬 벤?...

수소-중수소 교환, 화학 교차 연결, 공유 라벨링, 네이티브 스프레이 질량 분석 및 이온 이동성을 포함한 질량 분광계 기반 구조 기술은 유연성, 감도 및 복잡한 혼합물을 처리하는 능력으로 인해 빠르게 인기를 얻고 있습니다. FPOP는 질량 분석 기반 구조 기술 분야에서 인기를 강화한 몇 가지 장점을 자랑합니다. 대부분의 공유 라벨링 전략과 마찬가지로, 대부분의 포스트 라벨링 공정(예: 트립신 ?...

단백질(FPOP)의 빠른 광화학 산화는 LC-MS1에의해 검출된 단백질의 용매 노출 표면적의 초고속 공유 변형에 의한 단백질 지형 변화를 측정하기 위한 새로운 기술이다. FPOP는 과산화수소의 UV 레이저 플래시 광분해에 의해 시상에서 고농도의 하이드록실 라디칼을 생성합니다. 이러한 하이드록실 라디칼은 매우 반응적이고 수명이 짧으며, FPOP 조건2하에서대략 마이크로초 단위로 소비된다. 이러한 하이드록실 라디칼은 물을 통해 확산되고 일반적으로 빠른(~106M -1 s-1)에서확산제어3에이르는 운동 속도로 용액의 다양한 유기 성분을 산화한다. 하이드록실 라디칼이 단백질 표면을 만날 때, 라디칼은 단백질 표면의 아미노산 측망을 산화시켜 그 아미노산의 질량 이동(가장 일반적으로 하나의 산소 원자의 순첨가)을 생성한다. 어떤 아미노산에서 산화 반응의 속도는 두 가지 요인에 따라 달라집니다: 그 아미노산의 고유 반응 (사이드 체인 및 서열 컨텍스트에 따라 달라집니다)4,,5 및 확산 하이드록실 라디칼에 그 측 체인의 접근성, 이는 밀접하게 평균 용매 접근 표면적 6에 상관 관계6,,7. 글리신을 제외한 모든 표준 아미노산은 FPOP 실험에서 이러한 반응성이 높은 하이드록실 라디칼에 의해 표지된 것으로 관찰되었지만, 이는 널리 다른 수율에도 불구하고; 실제로, Ser, Thr, Asn 및 Ala는 고라디칼 복용량을 제외하고 대부분의 샘플에서 산화된 것으로 거의 보이며 신중하고 민감한 표적 ETD 단편화8,,9에의해 식별됩니다. 산화 후, 시료는 과산화수소 및 이차 산화제 (슈퍼 산화물, 단일 산소, 펩디딜 하이드로퍼산화물 등)를 제거하기 위해 담금질됩니다. 담금질된 시료는 산화 펩티드의 혼합물을 생성하기 위해 프로테오틸리로 소화되며, 여기서 구조 정보는 다양한 펩티드의 산화 제품의 패턴에서 화학적 "스냅샷"으로 동결된다(도1). 질량 분석법(LC-MS)에 결합된 액체 크로마토그래피는 해당 펩타이드의 산화 및 산화되지 않은 버전의 상대적 강도에 기초하여 주어진 프로테오리틱 펩타이드에서 아미노산의 산화량을 측정하는 데 사용된다. 상이한 형태 조건하에서 수득된 동일한 단백질의 이러한 산화 발자국(예를 들어, 리간드-바운드 대 리간드 프리)을 비교함으로써, 단백질의 주어진 부위의 산화량의 차이는 해당6영역6,7의용매 접근 표면적의 차이와 직접 상관관계가 있을 수 있다. 단백질 지형 정보를 제공하는 능력은 FPOP단백질 치료 발견 및개발(10,,11)을포함한 단백질의 고차 구조 측정을 위한 매력적인 기술이다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> 그림 1: FPOP 개요입니다. 단백질의 표면은 반응성이 높은 하이드록실 라디칼에 의해 공유적으로 변형됩니다. 하이드록실 라디칼은 측면 사슬의 용매 접근성에 의해 강하게 영향을 받는 속도로 단백질의 아미노산 측면 사슬과 반응할 것이다. 지형 변화(예를 들어, 위와 같이 리간드의 결합으로 인한)은 하이드록실 라디칼과 반응하지 않도록 상호작용 영역에서 아미노산을 보호하여 LC-MS 신호에서 수정된 펩타이드의 강도의 감소를 초래한다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
FPOP 용액(예를 들어, 리간드, 부형제, 완충제)에 존재하는 상이한 성분들은 과산화수소3의레이저 광분해시에 생성된 하이드록실 라디칼을 향한 상이한 청소 활성을 갖는다. 유사하게, 과산화수소 농도의 작은 변화, 레이저 유창및 완충 조성물은 효과적인 라디칼 복용량을 변화시킬 수 있으며, 샘플 전체와 다른 실험실 사이에서 FPOP 데이터의 재생이 도전적일 수 있다. 따라서, 사용 가능한 여러 하이드록실 라디칼 도시미터,,12,13,14,15,,16중 하나를 사용하여 각 시료에서 단백질과 반응할 수 있는 하이드록실 라디칼 용량을 비교할 수 있어야 한다., 하이드록실 라디칼 도지계는 하이드록실 라디칼 풀을 위해 마취제(및 용액의 모든 청소부와 경쟁하여) 작용합니다. 하이드록실 라디칼의 유효 용량은 도시계의 산화량을 측정하여 측정됩니다. 참고 "효과적인 하이드록실 라디칼 복용량"은 유체실 라디칼의 초기 농도와 라디칼의 반감기 모두의 기능이다. 이 두 매개 변수는 부분적으로 서로 의존하여 이론적 운동 모델링이 다소 복잡합니다(그림2). 두 샘플은 여전히 형성 된 하이드록실 급진적 인 의 초기 농도를 변경하여 동일한 효과적인 급진적 인 용량을 유지하면서 격렬하게 다른 초기 급진적 인 반감기를 가질 수 있습니다; 그들은 여전히 동일한 발자국을 생성합니다(17). 아데닌13 과 트리스12 산화의 그들의 수준을 실시간으로 UV 분광기에 의해 측정 될 수 있기 때문에 편리한 하이드록실 급진적 인 도시미터, 연구원은 신속하게 효과적인 하이드록실 급진적 인 용량에 문제가있을 때 식별하고 자신의 문제를 해결 할 수 있도록. 이 문제를 해결하기 위해, 실시간으로 adenine 흡광도 변화로부터 신호를 모니터링할 수 있는 조사 현장 직후 유량 시스템에 위치한 인라인 도지계가 중요하다. 이것은 버퍼 또는 하이드록실 라디칼 청소용량(17)의광범위하게 다른 수준으로 다른 부형제에서 FPOP 실험을 수행하는 데 도움이 된다. 이러한 급진적인 복용량 보정 실시간으로 수행 될 수 있습니다., 효과적인 라 디 칼 복용량을 조정 하 여 동일한 conformer에 대 한 통계적으로 구별 할 수 있는 결과 산출.
이 프로토콜에서, 우리는 내부 광학 급진적 인 도시계로 아데닌을 사용하여 급진적 인 투여 보상과 전형적인 FPOP 실험을 수행하기위한 자세한 절차가 있습니다. 이 방법을 사용하면 조사관이 실시간으로 보상을 수행하여 용량이 다른 FPOP 조건에서 발자국을 비교할 수 있습니다.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> 그림 2: dosimetry 기반 보상의 역학 시뮬레이션. 1 mM 아데닌 도시계 응답은 1mM 초기 하이드록실 라디칼 농도(▪OH t1/2=53ns)로 5 μM 리소지메 단량으로 측정되고 표적 도시계 응답(black)으로 설정한다. 폐포부부율이 1mM을 첨가하면, 체계 반응(blue)은 단백질 산화의 양과 함께 비례적 방식으로 감소(시안). 하이드록실 라디칼의 반감기도 감소합니다(▪OH t1/2=39ns). 생성된 하이드록실 라디칼의 양이 증가하여 1mM 히스티딘 스캐빈거로 1mM 히스티딘 스캐빈거와 동일한 수율을 부여하여 1mM 하이드록실 라디칼라디칼(red)이 없는 경우, 유사하게 발생하는 단백질 산화의 양이 동일해지는 t반면,▪2.2=ns.2=2.1=2.2.1=2.2.1μg=2.00μg.m.mm-s-29=29μg/tOH=29μg/tOH=29μg=29μg==29μg/tOH=29μg/tOH.는 수압실라디칼의 반감기 감소(nsOH=29)를 더욱 감소시키는 반면, 1mM 히스티딘 스캐빈거로 1mM의 하이드록실 폐약량으로 달성하면 유사하게 발생하는 단백질 산화의 양이 동일해지고 있다(2OH=29).1/2= 샤프 J.S.의 허가로 적응, Am Pharmaceut 레브 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

단백질(FPOP)의 빠른 광화학 적 산화는 단백질의 용매 접근 표면적을 조사하는 질량 분광계 기반 구조 생물학 기술입니다. 이 기술은 하이드록실 라디칼이 자유롭게 용액에서 확산되는 아미노산 측면 사슬의 반응에 의존합니다. FPOP는 과산화수소의 레이저 광분해에 의해 이러한 라디칼을 시동하여 생성하여 마이크로초 의 순서로 고갈되는 하이드록실 라디칼의 파열을 생성합니다. 이러한 하이드록실 라디칼이 용매에 접근할 수 있는 아미노산 측 사슬과 반응할 때, 반응 제품은 질량 분광법에 의해 측정되고 정량화될 수 있는 질량 변화를 나타낸다. 아미노산의 반응 속도는 그 아미노산의 평균 용매 접근 표면에 부분적으로 의존하기 때문에, 단백질의 주어진 영역의 산화량의 측정된 변화는 서로 다른 적합성(예를 들어, 리간드 바운드 대 리간드 프리, 단백제 대 골합 등) 사이의 해당 영역의 용매 접근성의 변화와 직접 상관관계가 있을 수 있습니다. FPOP는 단백질 단백질 상호 작용, 단백질 형성 변화 및 단백질 리간드 결합을 포함하여 생물학에 있는 문제의 수에서 적용되었습니다. 하이드록실 라디칼의 사용 가능한 농도는 FPOP 실험에서 많은 실험 조건에 따라 다르기 때문에 단백질 해석이 노출되는 효과적인 라디칼 용량을 모니터링하는 것이 중요합니다. 이 모니터링은 FPOP 반응에서 신호를 측정하기 위해 인라인 도지계를 통합하여 효율적으로 달성되며, 레이저 플루온은 원하는 양의 산화를 달성하기 위해 실시간으로 조정됩니다. 이러한 보상으로, 균형성 변화, 리간드 결합 표면 및/또는 단백질 단백질 상호 작용 인터페이스를 반영하는 단백질 지형의 변화는 상대적으로 낮은 시료양을 사용하여 이질적인 샘플에서 결정될 수 있다.

인산염 완충제에서 아달리무맙 바이오시밀러의 중사슬 펩티드 발자국을 비교하고 55°C에서 1h로 가열하면 흥미로운 결과를 나타낸다. 학생의 t-테스트는 이 두 가지 조건에서 크게 변경되는 펩티드의 식별에 사용됩니다 (p ≤ 0.05). 펩타이드 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 및 414-420은 단백질이 골재를 형성하도록 가열될 때 용매로부터 상당한 보호를나타낸다(도 5)<sup cl...

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Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

단백질의 빠른 광화학 산화는 단백질의 구조적 특성화를 위한 새로운 기술입니다. 다른 용매 첨가제와 리간드는 다양한 하이드록실 라디칼 청소 특성을 가지고 있습니다. 상이한 조건에서 단백질 구조를 비교하기 위해서는 반응에서 생성된 하이드록실 라디칼의 실시간 보상이 반응 조건을 정상화하는 데 요구된다.

단백질 지형 변화의 측정을 위한 단백질의 빠른 광화학 산화에 실시간 보상 가능하게

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

이 방법은 단백질 확인 및 단백질 상호 작용의 측정을 용이하게합니다. 완충 조성물, 시료 순도 및 단백질 농도 요구 사항은 유연하여 까다로운 구조적 문제를 해결할 수 있습니다. 이 기술을 사용하면 다양한 버퍼 시스템에서 샘플을 압축할 수 있습니다.우리의 dosimetry 방법을 사용하여, 연구원은 그들의 레이블링 반응이 실시간으로 얼마나 잘 작동하는지 감시할 수 있습니다. 이 기술의 한 응용 프로그램은 연구원이 널리 다른 약물 제형과 단백질 구조에 미치는 영향을 테스트 할 수 있기 때문에 약물 개발에 있습니다. FPOP 광학 벤치를 준비합니다.먼저 레이저를 켜고 레이저를 외부 트리거, 일정한 에너지 및 가스 교체로 설정합니다. 레이저가 따뜻해지면 펄스당 레이저 에너지를 펄스당 80~120밀리그램으로 설정하고 부탄 토치를 사용하여 인라인 도지미터가 레이저 노출 후 265나노미터에서 흡수성 신호를 판독하는 지점에서 모세관의 폴리이미드 코딩을 부드럽게 태울 수 있습니다. 보풀이 없는 와이프와 메탄올을 사용하여 모세관의 잔해를 부드럽게 닦고 청소된 모세관을 레이저의 빔 경로를 통해 인라인 도시계에 넣습니다.인라인 도지계 상단의 레버를 눌러 힌지를 열고 자기 홀더를 제거합니다. 모세관을 마그네틱 홀더를 사용하여 인라인 도지계의 기계 홈에 모세관을 배치하여 모세관을 제자리에 유지하고 레버가 제자리에 잠기 때까지 힌지를 누르는 모세관 위에 도시계 힌지를 닫습니다. 도시메트리 소프트웨어의 시작 플래시 버튼을 클릭하여 엑시머 레이저를 발사하기 시작하고 레이저 발사로 도시메트리 소프트웨어에서 10~20 헤르츠 사이의 사전 설정 반복 속도를 설정하여 이동 범위를 통해 전동 스테이지를 이동하여 빔이 조리개 에 중심을 유지하고 모세관의 실루엣을 전체적으로 관찰할 수 있도록 합니다.그런 다음 모세관을 분당 20 마이크로리터에서 1분 이상 물로 플러시하고 데이터 수집을 시작하기 전에 도시계 소프트웨어의 시작 데이터와 자동 0을 클릭하여 물으로 도시계를 0으로 클릭합니다. FPOP 실험을 수행하려면 과산화수소 2마이크로리터를 FPOP 용액 18마이크로리터에 추가하고 파이펫을 사용하여 원심분리에 의해 튜브 바닥의 용액을 신속하게 수집하고 즉시 가스가 단단한 주사기를 사용하여 용액을 주사기 펌프에 로드합니다. 측정기 소프트웨어에서 펌프를 시작하고 데이터를 시작하여 적절한 유량으로 주사기 펌프의 흐름을 시작하고 인라인 도지계를 사용하여 265 나노미터의 흡수신호가 폐기물 용기에서 시료를 수집안정화할 때까지 실시간 아데닌 판독값을 모니터링합니다.사전 설정된 반복 속도 엔드 에너지에서 레이저를 발사하기 시작하려면 도시계 소프트웨어의 시작 플래시 버튼을 클릭하고 인라인 도시계를 사용하여 실시간 아데닌 판독값을 모니터링합니다. 레이저끄기와 레이저가 켜진 265 나노미터의 흡광도차이는 265나노미터 판독에서 델타 흡수제가 될 것입니다. 비교 가능한 하이드록실 라디칼이 다른 시료에 걸쳐 단백질과 반응할 수 있도록 합니다.인라인 도지계로 얻은 265 나노미터 판독값에서 델타 흡수제와 이전 실험 또는 제어에서 얻은 265나노미터 판독값의 델타 흡수제와 비교합니다. 판독값이 원하는 수준에 있는 경우 담금질 버퍼에서 레이저 또는 방사선 직후 샘플을 수집한다. 흡광도 판독값을 균등화하는 효과적인 라디칼 용량을 보정하여 과산화수소 농도를 변화시키고, 펄스당 레이저 에너지를 변화하거나, 레이저 플루언스를 증가시키기 위해 초점 렌즈의 초점 평면을 변경한다.델타 흡수제에서 10밀리 이상의 흡광도 단위 를 변경하려면 과산화수소가 다소 있는 시료를 리메이크하고 시연된 대로 시료를 재실행한다. 흡광도 판독을 실시간으로 작은 변화시키기 위해 50mm 전동 스테이지를 사용하여 초점 렌즈의 위치를 조정하여 인시던트 빔의 초점 평면을 조정합니다. 레이저 방사선 후 시료에 존재하는 활성량의 하이드록실 라디칼라디칼의 유효량을 측정하기 위해 265 나노미터 판독에서 델타 흡수제가 원하는 판독과 같을 때까지 전동 스테이지를 사용하는 인라인 UV 모세관 검출기를 사용하여 실시간으로 265 나노미터에서 아데닌 델타 흡수체를 모니터링한다.인산염 완충제에서 아딜루무맙 바이오시밀러의 중사슬 펩티드 발자국을 비교하고 1시간 동안 섭씨 55도에서 가열한 후 표시된 펩티드 영역이 단백질이 응집체를 형성하도록 가열될 때 용매로부터 상당한 보호를 입증한다는 것을 알 수 있다. 레이저 또는 방사선 전후의 아데닌 흡수제의 차이를 실시간으로 모니터링하기 위해 인라인 도지계를 사용하면 인산염 완충액에 비해 MES 버퍼에서 아데닌 흡수제 수준의 유사한 변화가 관찰되고 있음을 나타낸다. 펩티드의 평균 산화는 인산염 완충제에 비해 MES 버퍼의 존재가 낮지만.그러나, 레이저 유동이 증가함에 따라 평균 펩티드 산화 값은 FPOP 및 MES 버퍼 및 인산염 버퍼 후 거의 동일하다. 도시트리 판독은 레이저 플루엔트 과산화수소 농도뿐만 아니라 급진적 인 청소부에 의해 영향을받습니다. 샘플 조사 사이의 도시에이트 응답이 서로 가까이 있다는 것을 주의하십시오.사이트 지시 돌연변이 발생은 종종 FPOP에서 보호되는 사이트를 조사하는 데 사용됩니다. 이를 통해 연구자들은 알리스테어에 대한 변경 사항이 있는지 확인할 수 있습니다. 이 기술은 연구원이 단백질 확인에 다른 첨가제의 효력을 결정할 수 있도록 다른 완충제 또는 제형에 있는 단백질의 비교를 용이하게 합니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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연구

생화학

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세포 내 빠른 광화학적 단백질 산화로 세포 단백질 특성화

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

아실-PEGyl 교환 젤 시프트 분석은 뇌막 단백질의 팔미토일화의 정량적 측정을 위한 것입니다.

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...