Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Vi anerkjenner forskningsmidler fra National Institute of General Medical Sciences stipend R43GM125420-01for å støtte kommersiell utvikling av en benkeplate FPOP enhet og R01GM127267 for utvikling av standardisering og dosimetry protokoller for høyenergi FPOP.

1. Klargjør den optiske benken og kapillæren for FPOP
FORSIKTIG: KrF excimer lasere er ekstreme øyefarer, og direkte eller reflektert lys kan forårsake permanent øyeskade. Bruk alltid passende øyebeskyttelse, unngå tilstedeværelse av reflekterende gjenstander i nærheten av strålebanen når det er mulig, og bruk tekniske kontroller for å forhindre uautorisert tilgang til en aktiv laser og for å begrense eventuelle bortkommen refleksjoner.
<ol><li>Klargjør den optiske FPOP-benken....

Massespektrometribaserte strukturelle teknikker, inkludert hydrogendeuteriumutveksling, kjemisk krysskobling, kovalent merking og innfødt spraymassespektrometri og ionmobilitet har vokst raskt i popularitet på grunn av deres fleksibilitet, følsomhet og evne til å håndtere komplekse blandinger. FPOP har flere fordeler som har økt sin popularitet i området massespektrometribaserte strukturelle teknikker. Som de fleste kovalente merkingsstrategier gir det et stabilt kjemisk øyeblikksbilde av proteintopografi som er ...

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en fremvoksende teknikk for bestemmelse av proteintografiske endringer ved ultrarask kovalent modifisering av det løsemiddelutsatte overflatearealet av proteiner etterfulgt av deteksjon av LC-MS1. FPOP genererer en høy konsentrasjon av hydroksylradikaler in situ ved UV laser flash fotolyse av hydrogenperoksid. Disse hydroksylradikale er svært reaktive og kortvarige, forbrukes på omtrent et mikrosekund tidsskala under FPOP forhold2. Disse hydroksylradikale diffuse gjennom vann og oksiderer ulike organiske komponenter i oppløsning ved kinetiske priser generelt fra rask (~ 106 M-1 s-1) til diffusjonskontrollert3. Når hydroksylradikale møter en proteinoverflate, vil radikaleren oksidere aminosyresidekjedene på proteinoverflaten, noe som resulterer i et masseskifte av den aminosyren (oftest nettotillegget av ett oksygenatom)4. Frekvensen av oksidasjonsreaksjonen ved en hvilken som helst aminosyre avhenger av to faktorer: den iboende reaktiviteten til aminosyren (som avhenger av sidekjeden og sekvenskonteksten)4,5 og tilgjengeligheten til sidekjeden til den diffuse hydroksylradikale, som nøye korrelerer til gjennomsnittlig løsningsmiddel tilgjengelig overflate6,,7. Alle standard aminosyrer unntatt glycin har blitt observert som merket av disse svært reaktive hydroksylradikale i FPOP eksperimenter, om enn ved vidt forskjellige utbytter; I praksis blir Ser, Thr, Asn og Ala sjelden sett på som oksidert i de fleste prøver unntatt under høye radikale doser og identifisert ved forsiktig og følsom målrettet ETD fragmentering8,9. Etter oksidasjon slukkes prøvene for å fjerne hydrogenperoksid og sekundære oksidanter (superoksid, enkeltoksygen, peptidyhydroperoksider osv.) De slukkede prøvene blir deretter proteolytisk fordøyd for å generere blandinger av oksidert peptider, hvor den strukturelle informasjonen er frosset som et kjemisk "øyeblikksbilde" i mønstrene til oksidasjonsprodukter av de ulike peptidene (figur 1). Flytende kromatografi kombinert med massespektrometri (LC-MS) brukes til å måle mengden oksidasjon av aminosyrer i et gitt proteolytisk peptid basert på de relative intensitetene i de oksiderte og ukoksidiserte versjonene av dette peptidet. Ved å sammenligne dette oksidative fotavtrykket av det samme proteinet oppnådd under forskjellige konformasjonsforhold (f.eks. ligand-bundet versus ligand-fri), kan forskjeller i mengden oksidasjon av et gitt proteinområde være direkte korrelert med forskjeller i det løsemiddeltilfredse overflatearealet i den regionen6,7. Evnen til å gi protein topografisk informasjon gjør FPOP til en attraktiv teknologi for høyere rekkefølge struktur bestemmelse av proteiner, inkludert i protein terapeutisk oppdagelse og utvikling10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> Figur 1: Oversikt over FPOP. Overflaten av proteinet er kovalent modifisert av svært reaktive hydroksylradikaler. Hydroksylradikale vil reagere med aminosyre sidekjeder av proteinet i en hastighet som er sterkt påvirket av løsemiddel tilgjengeligheten av sidekjeden. Topografiske endringer (for eksempel på grunn av bindingen av en ligand som vist ovenfor) vil beskytte aminosyrer i samhandlingsområdet fra å reagere med hydroksylradikale, noe som resulterer i en reduksjon i intensiteten av modifisert peptid i LC-MS-signalet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
Ulike bestanddeler som finnes i FPOP-løsningen (f.eks. ligands, hjelpestoffer, buffere) har forskjellig scavenging aktivitet mot hydroksylradikale generert på laserfotolyse av hydrogenperoksid3. På samme måte kan en liten endring i peroksidkonsentrasjon, laserflyt og buffersammensetning endre den effektive radikale dosen, noe som gjør reproduksjonen av FPOP-data utfordrende på tvers av prøvene og mellom forskjellige laboratorier. Derfor er det viktig å kunne sammenligne hydroksylradikal dose tilgjengelig for å reagere med protein i hver prøve ved hjelp av en av flere tilgjengelige hydroksylradikale dosimeters12,13,,14,,15,,16. Hydroxylradikale dosimeters handle ved å konkurrere med analytten (og med alle scavengers i løsning) for bassenget av hydroksylradikale; den effektive dosen av hydroksylradikaler måles ved å måle mengden oksidasjon av dosimeteret. Legg merke til at "effektiv hydroksylradikal dose" er en funksjon av både den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikal generert og radikalens halveringstid. Disse to parametrene er delvis avhengige av hverandre, noe som gjør den teoretiske kinetiske modelleringen noe kompleks (figur 2). To prøver kan ha svært forskjellige innledende radikale halveringsliv samtidig som den opprettholder den samme effektive radikale dosen ved å endre den opprinnelige konsentrasjonen av hydroksylradikale dannet; de vil fortsatt generere identiske fotavtrykk17. Adenine13 og Tris12 er praktiske hydroksylradikale dosimeters fordi deres oksidasjonsnivå kan måles ved UV-spektroskopi i sanntid, slik at forskerne raskt kan identifisere når det er et problem med effektiv hydroksylradikal dose og for å feilsøke problemet. For å løse dette problemet er det viktig å finne en innebygd dosimeter i strømningssystemet rett etter bestrålingsstedet som kan overvåke signalet fra adeninabsorbansendringer i sanntid. Dette bidrar til å utføre FPOP eksperimenter i buffere eller andre hjelpestoffer med vidt forskjellige nivåer av hydroxyl radikal scavenging kapasitet17. Denne radikale doseringskompensasjonen kan utføres i sanntid, noe som gir statistisk umulige resultater for samme samsvar ved å justere den effektive radikale dosen.
I denne protokollen har vi detaljerte prosedyrer for å utføre et typisk FPOP-eksperiment med radikal doseringskompensasjon ved hjelp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Denne metoden gjør det mulig for etterforskere å sammenligne fotavtrykk på tvers av FPOP-forhold som har forskjellig scavenging kapasitet ved å utføre kompensasjon i sanntid.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetrybasert kompensasjon. 1 m Adenin dosimeter respons måles i 5 μM lysozymanalytt med en 1 mM innledende hydroksylradikal konsentrasjon (▪OH t1/2=53 ns), og satt som en måldoserrespons (svart). Ved tilsetning av 1 mM av scavenger hjelpende histidin, dosimeter respons (blå) reduseres sammen med mengden protein oksidasjon på en proporsjonal måte (cyan). Halveringstiden til hydroksylradikalen reduseres også (▪OH t1/2=39 ns). Når mengden hydroksylradikal generert økes for å gi et tilsvarende utbytte av oksidert dosimeter i prøven med 1 mM histidin scavenger som oppnås med 1 mM hydroksylradikal i fravær av scaveng (rød), mengden proteinoksidasjon som oppstår på samme måte blir identisk (magenta), mens hydroksylradikal halveringstid reduseres ytterligere (▪OH t1/2=29 ns). Tilpasset med tillatelse fra Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner (FPOP) er en massespektrometribasert strukturbiologiteknikk som sonderer det løsemiddeltilfredse overflatearealet av proteiner. Denne teknikken er avhengig av reaksjonen av aminosyre sidekjeder med hydroksylradikaler fritt diffusering i løsningen. FPOP genererer disse radikaler in situ ved laser fotolyse av hydrogenperoksid, og skaper et utbrudd av hydroksylradikaler som er utarmet i rekkefølgen av et mikrosekund. Når disse hydroksylradikale reagerer med en løsningsmiddeltil hjelp tilgjengelig aminosyre sidekjede, viser reaksjonsproduktene et masseskifte som kan måles og kvantifiseres ved massespektrometri. Siden reaksjonshastigheten av en aminosyre avhenger delvis av den gjennomsnittlige løsningsmiddeltilgjengelige overflaten av aminosyren, kan målte endringer i mengden oksidasjon av et gitt proteinområde være direkte korrelert til endringer i oppløsningsvæsketilgjengeligheten i den regionen mellom forskjellige konformasjoner (f.eks ligand-bundet versus ligand-fri, monomer vs. aggregert, etc.) FPOP har blitt brukt i en rekke problemer i biologi, inkludert protein-protein interaksjoner, protein konformasjonsendringer, og protein-ligand binding. Etter hvert som den tilgjengelige konsentrasjonen av hydroksylradikaler varierer basert på mange eksperimentelle forhold i FPOP-eksperimentet, er det viktig å overvåke den effektive radikale dosen som proteinanalyttet eksponeres for. Denne overvåkingen oppnås effektivt ved å innlemme en inline dosimeter for å måle signalet fra FPOP-reaksjonen, med laserflyt justert i sanntid for å oppnå ønsket mengde oksidasjon. Med denne kompensasjonen kan endringer i proteintopografi som gjenspeiler konformasjonsendringer, ligandbindende overflater og/eller proteininteraksjonsgrensesnitt bestemmes i heterogene prøver ved hjelp av relativt lave prøvemengder.

Sammenligning av det tunge kjedepeptidavtrykket til adalimumab biosimilar i fosfatbufferen og ved oppvarming ved 55 °C i 1 time viser interessante resultater. Studentens t-test brukes til identifisering av peptider som er betydelig endret under disse to forholdene (p ≤ 0,05). Peptidene 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 og 414-420 viser betydelig beskyttelse mot løsemiddel når proteinet varmes opp for å danne aggregater (figur 5)30. Dette eksperim...

Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Rask fotokjemisk oksidasjon av proteiner er en fremvoksende teknikk for strukturell karakterisering av proteiner. Ulike løsemiddeltilsetningsstoffer og ligandes har varierte hydroksylradikale scavenging egenskaper. For å sammenligne proteinstrukturen under forskjellige forhold, er sanntidskompensasjon av hydroksylradikaler generert i reaksjonen nødvendig for å normalisere reaksjonsforholdene.

Muliggjør sanntidskompensasjon i raske fotokjemiske oksidasjoner av proteiner for bestemmelse av proteintopografiendringer

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Metoden letter måling av proteinbekreftelse og proteininteraksjoner. Buffersammensetningen, prøverenhet og proteinkonsentrasjonskrav er fleksible, slik at metoden kan løse utfordrende strukturelle problemer. Denne teknikken tillater en komprimering av prøver i et bredt utvalg av forskjellige buffersystemer.Ved hjelp av vår dosimetry metode, forskere kan overvåke hvor godt deres merking reaksjoner fungerer i sanntid. En anvendelse av denne teknologien er i narkotikautvikling fordi det tillater forskere å teste vidt forskjellige legemiddelformuleringer og hvordan de påvirker proteinstrukturen. For å forberede FPOP optisk benk.Slå først på laseren og sett laseren til ekstern utløser, konstant energi og ingen gassutskifting. Når laseren har varmet inn laserenergien per puls til mellom 80 og 120 milligram per puls og bruk en butanpistol til å forsiktig brenne polyimidkodingen av kapillæren på stedet der den innebygde dosimeteren vil lese det absorberende signalet ved 265 nanometer etter lasereksponering. Bruk en lofri tørk og metanol til å forsiktig tørke avfallet fra kapillæren og plasser den rengjorte kapillæren gjennom strålebanen til laseren og inn i den inline dosimeteren.Trykk spaken på toppen av den innebygde dosimeteren for å åpne hengslet og fjerne magnetholderne. Plasser kapillæren i maskinsporet på den innebygde dosimeteren ved hjelp av magnetholderne for å holde kapillæren på plass og lukke dosimeterhengslet over kapillæren ved å trykke på hengslet til spaken låses på plass. Klikk på start flash-knappen i dosimetry-programvaren for å begynne å skyte excimer laseren og angi den forhåndsinnstilte repetisjonshastigheten mellom 10 til 20 Hertz i dosimetry-programvaren med laseravfyringen, flytt det motoriserte stadiet gjennom bevegelsesområdet, slik at strålen forblir sentrert på blenderåpningen og at silhuetten av kapillæren kan observeres gjennom.Skyll deretter kapillæren med vann ved 20 mikroliter per minutt i minst ett minutt og klikk start data pluss automatisk null i dosimeterprogramvaren for å nulle dosimetereteret til vannet før du begynner datainnsamlingen. For å utføre et FPOP-eksperiment legger du til to mikroliter hydrogenperoksid til 18 mikroliter FPOP-løsning og bruker en pipette til å forsiktig blande oppløsningen raskt samle opp oppløsningen nederst på røret ved sentrifugering og umiddelbart bruke en gasstett sprøyte til å laste løsningen inn i en sprøytepumpe. Klikk start pumpen og start data i dosimeterprogramvaren for å starte strømmen på sprøytepumpen med riktig strømningshastighet og bruk den innebygde dosimeteren til å overvåke sanntids adeninavlesningen til det absorberende signalet ved 265 nanometer stabiliserer innsamlingen av prøven i en avfallsbeholder.For å begynne å skyte laseren på den forhåndsinnstilte repetisjonshastigheten sluttenergi, klikk start flash-knappen i dosimeterprogramvaren og bruk den innebygde dosimeteren til å overvåke sanntids adeninlesning. Forskjellen i absorbansen ved 265 nanometer med laseren av og laseren på vil være deltaabsorberende ved 265 nanometer lesing. For å sikre at sammenlignbare hydroksylradikale er tilgjengelig for å reagere med proteiner på tvers av ulike prøver.Sammenlign deltaabsorbettene ved 265 nanometer avlesning oppnådd med inline dosimeter med ønsket deltaabsorbeter ved 265 nanometer lesing hentet fra tidligere eksperimenter eller kontroller. Hvis avlesningen er på ønsket nivå, må du samle prøven umiddelbart etter laser eller stråling i slukkingsbufferen. For å kompensere den effektive radikale dosen for å utjevne absorbansavlesningene endrer hydrogenperoksidkonsentrasjonen, endrer du laserenergien per puls eller endrer fokusplanet til fokuslinsen for å øke laserfløyten.For å gjøre en større enn 10 milli absorbans enhet endring i deltaet absorberende lese remake prøven med mer eller mindre hydrogenperoksid og kjøre prøven som demonstrert. For å gjøre en liten endring i absorbansavlesningen i sanntid, bruk det 50 millimeter motoriserte stadiet til å justere posisjonen til fokuslinsen for å justere fokalplanet til hendelsesstrålen. For å måle den effektive mengden hydroksylradikale som finnes i prøven etter laserstråling, overvåker adenindeltaet absorpsjonsmiddelet ved 265 nanometer i sanntid med en innebygd UV-kapillærdetektor ved hjelp av det motoriserte stadiet for å justere linseposisjonen til deltaet absorberer ved 265 nanometers lesing er lik ønsket lesing.Sammenligning av det tunge kjedepeptidavtrykket til adilumumabbiosimilar i fosfatbufferen, og etter oppvarming ved 55 grader Celsius i en time avslører de angitte peptidområdene betydelig beskyttelse mot løsemidler når proteinet varmes opp for å danne aggregater. Bruk av en inline dosimeter i sanntid for å overvåke forskjellen i adeninabsorbetter før og etter laser eller stråling indikerer at en sammenlignbar endring i adeninabsorbetens nivå observeres i MES-buffer sammenlignet med fosfatbuffer. Mens gjennomsnittlig oksidasjon av peptidene er lavere i nærvær av MES-buffer sammenlignet med fosfatbuffer.Men, som laser flyt er økt for å ha en lik adenin dosimetry respons gjennomsnittlig peptid oksidasjon verdier er nesten det samme etter FPOP og MES buffer og fosfat buffer. Som dosimetry lesing påvirkes av laserfluens peroksid konsentrasjon samt den radikale scavenger. Vær forsiktig med at dosimetryresponsen mellom utvalgsundersøkelsen nær hverandre.Nettstedet rettet mutagenesis brukes ofte til å sondere nettsteder beskyttet i FPOP. Dette gjør det mulig for forskere å avgjøre om endringer skyldes Alistair. Denne teknikken letter sammenligningen av proteiner i forskjellige buffere eller formuleringer slik at forskere kan bestemme effekten av forskjellige tilsetningsstoffer på proteinbekreftelse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Time-løst elektrospray-ionisering Hydrogen-deuterium Veksling massespektrometri for å studere Protein struktur og dynamikk

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Sporing av DNA-fragmenter i sanntid etter Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestemmelse av glykogeninnholdet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering av plassert gull Microelectrodes utstyrt for en sanntid celle Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Fastsettelse av Protease spesifisitet i musen vev ekstrakter av MALDI-TOF massespektrometri: manipulere PH å forårsake spesifisitet endringer

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalente immobilisering av proteiner for ett molekyl Force spektroskopi

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Sanntid observasjon av DNA Strand Exchange reaksjonen formidlet av Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-time, semi-automatisert fluorescerende måling av luftveiene overflaten flytende pH av primær menneskelige Luftveisepitel celler

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisere cellulære proteiner med i cellfast fotokjemisk oksidasjon av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analyse for kvantitativ bestemmelse av palmitoylering av hjernemembranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...