Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
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Reconhecemos que o financiamento de pesquisa do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais concede R43GM125420-01 para apoiar o desenvolvimento comercial de um dispositivo FPOP benchtop e R01GM127267 para o desenvolvimento de protocolos de padronização e dosimetria para FPOP de alta energia.

1. Prepare o Banco Óptico e o Capilar para FPOP
ATENÇÃO: Os lasers excimer krf são perigos extremos dos olhos, e a luz direta ou refletida pode causar danos permanentes nos olhos. Use sempre proteção ocular adequada, evite a presença de quaisquer objetos reflexivos perto do caminho do feixe quando possível, e use controles de engenharia para impedir o acesso não autorizado a um laser ativo e conter quaisquer reflexos perdidos.
<ol><li>Prepare o banco óptico FPOP.<ol>
<li>Ligue o la...

Técnicas estruturais baseadas em espectrometria de massa, incluindo troca de deutério de hidrogênio, ligação química, rotulagem covalente e espectrometria de massa de spray nativo e mobilidade de íons têm crescido rapidamente em popularidade devido à sua flexibilidade, sensibilidade e capacidade de lidar com misturas complexas. O FPOP possui várias vantagens que aumentaram sua popularidade na área de técnicas estruturais baseadas em espectrometria de massa. Como a maioria das estratégias de rotulagem covalen...

A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica emergente para a determinação de alterações topográficas proteicas por modificação covalente ultrarrápida da área de superfície exposta ao solvente de proteínas seguida pela detecção por LC-MS1. FPOP gera uma alta concentração de radicais hidroxílicos in situ por fotolise flash laser UV de peróxido de hidrogênio. Esses radicais hidroxis são muito reativos e de curta duração, consumidos em aproximadamente uma escala de tempo microssegundos sob as condições FPOP2. Esses radicais hidroxis se difundem através da água e oxidam vários componentes orgânicos em solução a taxas cinéticas geralmente variando de rápido (~106 M-1 s-1) a3controlados por difusão . Quando o radical hidroxyl encontra uma superfície proteica, o radical oxidará as cadeias laterais de aminoácidos na superfície da proteína, resultando em uma mudança em massa desse aminoácido (mais comumente a adição líquida de um átomo de oxigênio)4. A taxa de reação de oxidação em qualquer aminoácido depende de dois fatores: a reatividade inerente desse aminoácido (que depende da cadeia lateral e do contexto sequencial)4,5 e a acessibilidade dessa cadeia lateral ao radical hidroxílico difusor, que se correlaciona intimamente com a área média de superfície acessívelsolvente 6,,7. Todos os aminoácidos padrão, exceto a glicina, foram observados como rotulados por esses radicais hidroxil altamente reativos em experimentos FPOP, embora em rendimentos amplamente diferentes; na prática, Ser, Thr, Asn e Ala raramente são vistos como oxidados na maioria das amostras, exceto sob altas doses radicais e identificados pela cuidadosa e sensível fragmentação de ETD8,,9. Após a oxidação, as amostras são saciadas para remover peróxido de hidrogênio e oxidantes secundários (superóxido, oxigênio singlet, hidroperóxidos de peptidyl, etc.) As amostras saciadas são então digeridas proteolíticos para gerar misturas de peptídeos oxidados, onde as informações estruturais são congeladas como um "instantâneo" químico nos padrões dos produtos de oxidação dos vários peptídeos(Figura 1). A cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) é usada para medir a quantidade de oxidação de aminoácidos em um determinado peptídeo proteolítico baseado nas intensidades relativas das versões oxidadas e nãoxidizadas desse peptídeo. Comparando esta pegada oxidativa da mesma proteína obtida em diferentes condições conformais (por exemplo, ligadura versus sem ligante), as diferenças na quantidade de oxidação de uma determinada região da proteína podem estar diretamente correlacionadas com diferenças na superfície acessível ao solvente daquela região6,,7. A capacidade de fornecer informações topográficas proteicas torna o FPOP uma tecnologia atraente para a determinação da estrutura de alta ordem de proteínas, inclusive na descoberta e desenvolvimento terapêutico de proteínas10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> Figura 1: Visão geral do FPOP. A superfície da proteína é covalentemente modificada por radicais hidroxil altamente reativos. Os radicais hidroxis reagirão com cadeias laterais de aminoácidos da proteína a uma taxa fortemente influenciada pela acessibilidade solvente da cadeia lateral. As alterações topográficas (por exemplo, devido à ligação de um ligante como mostrado acima) protegerão os aminoácidos na região de interação de reagir com radicais hidroxílicos, resultando em uma diminuição na intensidade do peptídeo modificado no sinal LC-MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Diferentes constituintes presentes na solução FPOP (por exemplo, ligantes, excipientes, tampões) têm diferentes atividades de limpeza em direção aos radicais hidroxílicos gerados sobre a fotolise laser do peróxido de hidrogênio3. Da mesma forma, uma pequena mudança na concentração de peróxido, fluência laser e composição de buffer pode alterar a dose radical eficaz, tornando a reprodução de dados FPOP desafiadora entre as amostras e entre diferentes laboratórios. Portanto, é importante poder comparar a dose radical hidroxyl disponível para reagir com proteína em cada amostra usando um dosímetros radicais hidroxílicos disponíveis12,,13,,14,,15,,16. Os dosímetros radicais hidroxilas atuam competindo com o analito (e com todos os catadores em solução) para a piscina de radicais hidroxila; a dose efetiva de radicais hidroxis é medida medindo a quantidade de oxidação do dosímetro. Note que a "dose radical hidroxíl" eficaz é uma função tanto da concentração inicial de radical hidroxílico gerada quanto da meia-vida do radical. Esses dois parâmetros são parcialmente dependentes um do outro, tornando a modelagem cinética teórica um pouco complexa(Figura 2). Duas amostras poderiam ter meias-vidas radicais iniciais extremamente diferentes enquanto ainda mantinham a mesma dose radical eficaz alterando a concentração inicial de radicais hidroxis formados; eles ainda vão gerar pegadas idênticas17. Adenina13 e Tris12 são dosímetros radicais hidroxílicos convenientes porque seu nível de oxidação pode ser medido pela espectroscopia UV em tempo real, permitindo que os pesquisadores identifiquem rapidamente quando há um problema com a dose radical hidroxílida eficaz e para solucionar seus problemas. Para resolver esse problema, um dosímetro inline localizado no sistema de fluxo logo após o local da irradiação que pode monitorar o sinal a partir de mudanças de absorção de adenina em tempo real é importante. Isso ajuda na realização de experimentos FPOP em buffers ou qualquer outro excipiente com níveis amplamente diferentes de capacidade de limpeza radical hidroxis17. Essa compensação de dosagem radical pode ser realizada em tempo real, produzindo resultados estatisticamente indistinguíveis para o mesmo conformador, ajustando a dose radical eficaz.
Neste protocolo, temos procedimentos detalhados para a realização de um experimento típico de FPOP com compensação de dosagem radical usando adenina como um dosímetro radical óptico interno. Este método permite que os pesquisadores comparem pegadas em condições FPOP que têm capacidade de limpeza diferente, realizando compensação em tempo real.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> Figura 2: Simulação cinética de compensação baseada em dosimetria. A resposta dosímetro de adenina de 1 mM é medida em 5 μM de analito de lymo com uma concentração radical hidráxil inicial de 1 mM (▪OH t1/2=53 ns), e definida como resposta dosímetro alvo (preto). Após a adição de 1 mM da histidina excipiente catraca, a resposta dosímetro (azul) diminui junto com a quantidade de oxidação proteica de forma proporcional (ciano). A meia-vida do radical hidroxíll também diminui (▪OH t1/2=39 ns). Quando a quantidade de radical hidroxílico gerada é aumentada para dar um rendimento equivalente de dosímetro oxidado na amostra com 1 mM de histidina como alcançado com 1 mM radical hidroxyl na ausência de sca verador (vermelho), a quantidade de oxidação proteica que ocorre de forma semelhante torna-se idêntica (magenta), enquanto a meia-vida radical hidroxis diminui ainda mais (▪OH t1/2=29 ns). Adaptado com permissão da Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

A oxidação fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) é uma técnica de biologia estrutural baseada em espectrometria de massa que sonda a área de superfície acessível de solventes das proteínas. Esta técnica se baseia na reação de cadeias laterais de aminoácidos com radicais hidroxil livremente difundindo em solução. FPOP gera esses radicais in situ por fotolise laser de peróxido de hidrogênio, criando uma explosão de radicais hidroxil que está esgotado na ordem de um microssegundo. Quando esses radicais hidroxis reagem com uma cadeia lateral de aminoácidos acessível a solventes, os produtos de reação exibem uma mudança de massa que pode ser medida e quantificada pela espectrometria de massa. Uma vez que a taxa de reação de um aminoácido depende, em parte, da superfície acessível de solvente médio desse aminoácido, mudanças medidas na quantidade de oxidação de uma determinada região de uma proteína podem estar diretamente correlacionadas com mudanças na acessibilidade solvente daquela região entre diferentes conformações (por exemplo, ligadura versus sem ligante, monômero vs. agregado, etc.) O FPOP tem sido aplicado em uma série de problemas na biologia, incluindo interações proteína-proteína, alterações conformacionais proteicas e ligação proteína-ligante. Como a concentração disponível de radicais hidroxilas varia de acordo com muitas condições experimentais no experimento FPOP, é importante monitorar a dose radical eficaz à qual o analito proteico é exposto. Este monitoramento é eficientemente alcançado incorporando um dosímetro inline para medir o sinal da reação FPOP, com fluência laser ajustada em tempo real para alcançar a quantidade desejada de oxidação. Com essa compensação, mudanças na topografia proteica refletindo alterações conformais, superfícies de ligação de ligantes e interfaces de interação proteína-proteína podem ser determinadas em amostras heterogêneas usando quantidades amostrais relativamente baixas.

Comparação da pegada de peptídeo de corrente pesada do biossimilar adalimumabe em tampão fosfato e quando aquecido a 55 °C por 1 h mostram resultados interessantes. O teste t do aluno é utilizado para a identificação de peptídeos que são significativamente alterados nessas duas condições (p ≤ 0,05). Os peptídeos 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 e 414-420 mostram proteção significativa do solvente quando a proteína é aquecida para formar agregados(Figura 5)...

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Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

A oxidação fotoquímica rápida das proteínas é uma técnica emergente para a caracterização estrutural das proteínas. Diferentes aditivos e ligantes de solventes têm variadas propriedades de limpeza radical hidroxyl. Para comparar a estrutura proteica em diferentes condições, a compensação em tempo real dos radicais hidroxis gerados na reação é necessária para normalizar as condições de reação.

Permitindo compensação em tempo real em oxidações fotoquímicas rápidas de proteínas para a determinação de mudanças de topografia de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

O método facilita a medição da confirmação de proteínas e interações proteicas. A composição do buffer, a pureza da amostra e os requisitos de concentração de proteínas são flexíveis, permitindo que o método resolva problemas estruturais desafiadores. Esta técnica permite uma compressão de amostras em uma grande variedade de diferentes sistemas tampão.Usando nosso método de dosimetria, os pesquisadores podem monitorar o quão bem suas reações de rotulagem estão funcionando em tempo real. Uma aplicação dessa tecnologia está no desenvolvimento de medicamentos porque permite aos pesquisadores testar formulações de medicamentos amplamente diferentes e como elas afetam a estrutura proteica. Para preparar o banco óptico FPOP.Primeiro ligue o laser e coloque o laser no gatilho externo, energia constante e sem substituição de gás. Quando o laser tiver aquecido, ajuste a energia do laser por pulso entre 80 a 120 miligramas por pulso e use uma tocha de butano para queimar suavemente a codificação de poliimida do capilar no local em que o dosímetro inline lerá o sinal absorvente a 265 nanômetros após a exposição ao laser. Use um lenço sem fiapos e metanol para limpar suavemente os detritos do capilar e colocar o capilar limpo através do caminho do feixe do laser e no dosímetro inline.Pressione a alavanca na parte superior do dosímetro da linha para abrir a dobradiça e remova os suportes magnéticos. Coloque o capilar no sulco da máquina do dosímetro inline usando os suportes magnéticos para manter o capilar no lugar e feche a dobradiça dosímetro sobre a dobradiça capilar pressionando a dobradiça até que a alavanca se esvaie no lugar. Clique no botão flash iniciar no software de dosimetria para começar a disparar o laser excimer e definir a taxa de repetição predefinida entre 10 a 20 Hertz no software de dosimetria com o disparo a laser mover o estágio motorizado através de sua amplitude de movimento, garantindo que o feixe permaneça centrado na abertura e que a silhueta do capilar possa ser observada por toda parte.Em seguida, lave o capilar com água a 20 microliters por minuto por minuto e clique em dados de partida mais automático zero no software dosímetro para zerar o dosímetro na água antes de iniciar a coleta de dados. Para realizar um experimento FPOP adicione dois microliters de peróxido de hidrogênio a 18 microliters de solução FPOP e use uma pipeta para misturar suavemente a solução rapidamente coletar a solução na parte inferior do tubo por centrifugação e usar imediatamente uma seringa apertada a gás para carregar a solução em uma bomba de seringa. Clique na bomba inicial e inicie os dados no software dosímetro para iniciar o fluxo na bomba de seringa na taxa de fluxo apropriada e use o dosímetro inline para monitorar a leitura de adenina em tempo real até que o sinal absorvente em 265 nanômetros estabilize a coleta da amostra em um recipiente de resíduos.Para começar a disparar o laser na taxa de repetição predefinida, clique no botão flash iniciar no software dosímetro e use o dosímetro inline para monitorar a leitura de adenina em tempo real. A diferença na absorção em 265 nanômetros com o laser desligado e o laser ligado serão os absorventes delta a 265 nanômetros de leitura. Para garantir que radicais hidroxil comparáveis estejam disponíveis para reagir com proteínas em diferentes amostras.Compare os absorventes delta em 265 nanômetros de leitura obtidos com o dosímetro inline com os absorventes delta desejo em 265 nanômetros de leitura obtida de experimentos ou controles anteriores. Se a leitura estiver no nível desejado, colete a amostra imediatamente após o laser ou radiação no tampão de saciar. Para compensar a dose radical eficaz para equalizar as leituras de absorvência alteram a concentração de peróxido de hidrogênio, alteram a energia do laser por pulso ou alteram o plano focal da lente focal para aumentar a fluência do laser.Para fazer uma mudança de unidade de absorção maior que 10 militos nos absorventes delta lendo refaz a amostra com mais ou menos peróxido de hidrogênio e reprisar a amostra como demonstrado. Para fazer uma pequena mudança na leitura de absorvância em tempo real, use o estágio motorizado de 50 milímetros para ajustar a posição da lente focal para ajustar o plano focal do feixe incidente. Para medir a quantidade efetiva de radical hidroxila presente na amostra após o monitoramento da radiação laser os absorventes delta de adenina a 265 nanômetros em tempo real com um detector capilar UV inline usando o estágio motorizado para ajustar a posição da lente até que os absorventes delta em 265 nanômetros de leitura seja igual à leitura desejada.A comparação da pegada de peptídeo de cadeia pesada do biossimilar adilumumabe no tampão fosfato e após o aquecimento a 55 graus Celsius por uma hora revela que as regiões de peptídeo indicadas demonstram proteção significativa dos solventes quando a proteína é aquecida para formar agregados. O uso de um dosímetro inline em tempo real para monitorar a diferença nos absorventes de adenina antes e depois do laser ou radiação indica que uma mudança comparável no nível de absorventes de adenina é observada no buffer mes em comparação com o tampão de fosfato. Enquanto a oxidação média dos peptídeos é menor na presença de tampão MES em comparação com o tampão fosfato.No entanto, à medida que a fluência a laser é aumentada para ter uma resposta de dosimetria de adenina igual, os valores médios de oxidação do peptídeo são quase os mesmos após o tampão e tampão de fosfato FPOP e MES. Como a leitura da dosimetria é afetada pela concentração de peróxido de fluência laser, bem como o carniceiro radical. Tome cuidado para que a resposta da dosimetria entre a pesquisa amostral próxima uma da outra.Mutagênese dirigida ao site é frequentemente usada para sondar locais protegidos no FPOP. Isso permite que os pesquisadores determinem se as mudanças são devidas a Alistair. Esta técnica facilita a comparação de proteínas em diferentes buffers ou formulações, permitindo que os pesquisadores determinem o efeito de diferentes aditivos na confirmação da proteína.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

resolvida no tempo com ionização por electrospray Hidrogénio-deutério troca Espectrometria de Massa para estudar a estrutura e dinâmica das proteínas

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Bioquímica

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Rastreamento em tempo real da separação de fragmentos de DNA por smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Determinação do conteúdo de glicogênio em cianobactérias

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regeneração da matriz microeletrodos ouro equipado para um analisador de celular em tempo real

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

A determinação da especificidade da Protease no Mouse tecido extrai por espectrometria de massa MALDI-TOF: manipulando o PH para causar alterações de especificidade

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Imobilização covalente de proteínas para a espectroscopia de força única molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Observação em tempo real da reação de troca de fita de DNA mediada por Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-tempo, semi-automatizado de medição fluorescente do pH líquido de superfície das vias aéreas das células epiteliais das vias aéreas humanas primárias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterização de proteínas celulares com oxidação fotoquímica rápida de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Ensaio de mudança de gel de troca acila-PEGyl para determinação quantitativa de palmitoilação de proteínas de membrana cerebral

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...