Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
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Reconocemos la financiación de investigación del Instituto Nacional de Ciencias Médicas Generales subvención R43GM125420-01 para apoyar el desarrollo comercial de un dispositivo FPOP de sobremesa y R01GM127267 para el desarrollo de protocolos de estandarización y dosimetría para FPOP de alta energía.

1. Prepare el banco óptico y el capilar para FPOP
ADVERTENCIA: Los láseres de excimer KrF son peligros oculares extremos, y la luz directa o reflejada puede causar daños oculares permanentes. Use siempre la protección adecuada para los ojos, evite la presencia de objetos reflectantes cerca de la trayectoria del haz cuando sea posible y utilice controles de ingeniería para evitar el acceso no autorizado a un láser activo y para restringir cualquier reflejo perdido.
<ol><li>Prepare el ba...

Las técnicas estructurales basadas en espectrometría de masas, incluyendo el intercambio de hidrógeno-deuterio, la reticulación química, el etiquetado covalente y la espectrometría de masas de pulverización nativa y la movilidad de iones han crecido rápidamente en popularidad debido a su flexibilidad, sensibilidad y capacidad para manejar mezclas complejas. FPOP cuenta con varias ventajas que han aumentado su popularidad en el área de técnicas estructurales basadas en espectrometría de masas. Al igual que la m...

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) es una técnica emergente para la determinación de cambios topográficos proteicos mediante la modificación covalente ultrarrápida de la superficie expuesta al disolvente de proteínas seguida de la detección por LC-MS1. FPOP genera una alta concentración de radicales hidroxilo in situ por fotolisis flash láser UV de peróxido de hidrógeno. Estos radicales hidroxilo son muy reactivos y de corta duración, consumidos en aproximadamente una escala de tiempo de microsegundos bajo condiciones FPOP2. Estos radicales hidroxilo se difunden a través del agua y oxidan varios componentes6 orgánicos en solución a tasas cinéticas que generalmente van desde rápido (10 M-1 s-1) a3controlado por difusión. Cuando el radical hidroxilo se encuentra con una superficie de proteína, el radical oxidará las cadenas laterales de aminoácidos en la superficie de la proteína, lo que resulta en un cambio de masa de ese aminoácido (más comúnmente la adición neta de un átomo de oxígeno)4. La velocidad de la reacción de oxidación en cualquier aminoácido depende de dos factores: la reactividad inherente de ese aminoácido (que depende de la cadena lateral y del contexto de secuencia)4,5 y la accesibilidad de esa cadena lateral al radical hidroxilo difusor, que se correlaciona estrechamente con la superficie accesible del disolvente medio6,7. Todos los aminoácidos estándar excepto la glicina se han observado como etiquetado por estos radicales hidroxilo altamente reactivos en experimentos FPOP, aunque con rendimientos muy diferentes; en la práctica, Ser, Thr, Asn y Ala rara vez se consideran oxidados en la mayoría de las muestras, excepto bajo dosis de radicales altos e identificados por la cuidadosa y sensible fragmentación específica de ETD8,,9. Después de la oxidación, las muestras se apagan para eliminar el peróxido de hidrógeno y los oxidantes secundarios (superóxido, oxígeno singlete, hidroperóxidos de peptidil, etc.) Las muestras insaciadas se digieren proteolíticamente para generar mezclas de péptidos oxidados, donde la información estructural se congela como una "instantánea" química en los patrones de los productos de oxidación de los diversos péptidos (Figura 1). La cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) se utiliza para medir la cantidad de oxidación de aminoácidos en un péptido proteolítico determinado basado en las intensidades relativas de las versiones oxidadas y no oxidadas de ese péptido. Al comparar esta huella oxidativa de la misma proteína obtenida en diferentes condiciones de conformacional (por ejemplo, ligando frente frente frente a ligando libre), las diferencias en la cantidad de oxidación de una región determinada de la proteína pueden correlacionarse directamente con las diferencias en la superficie accesible al disolvente de esa región6,,7. La capacidad de proporcionar información topográfica de proteínas hace de FPOP una tecnología atractiva para la determinación de la estructura de orden superior de las proteínas, incluso en el descubrimiento terapéutico proteico y el desarrollo10,,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> Figura 1: Visión general de FPOP. La superficie de la proteína es modificada covalentemente por radicales hidroxilo altamente reactivos. Los radicales hidroxilo reaccionarán con las cadenas laterales de aminoácidos de la proteína a una velocidad fuertemente influenciada por la accesibilidad del disolvente de la cadena lateral. Los cambios topográficos (por ejemplo, debido a la unión de un ligando como se muestra arriba) protegerán los aminoácidos en la región de interacción de reaccionar con radicales hidroxilo, lo que resulta en una disminución en la intensidad del péptido modificado en la señal LC-MS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Diferentes componentes presentes en la solución FPOP (por ejemplo, ligandos, excipientes, tampones) tienen diferente actividad de barrido hacia los radicales hidroxilo generados sobre la fotólisis láser de peróxido de hidrógeno3. Del mismo modo, un pequeño cambio en la concentración de peróxido, la fluencia láser y la composición del tampón puede cambiar la dosis radical efectiva, haciendo que la reproducción de datos FPOP sea un reto entre las muestras y entre diferentes laboratorios. Por lo tanto, es importante poder comparar la dosis radical hidroxilo disponible para reaccionar con la proteína en cada muestra utilizando uno de los varios dosímetros radicales hidroxilo disponibles12,13,14,15,16. Los dosímetros radicales hidroxilo actúan compitiendo con el analito (y con todos los carroñeros en solución) para la piscina de radicales hidroxilo; la dosis efectiva de los radicales hidroxilo se mide midiendo la cantidad de oxidación del dosímetro. Tenga en cuenta que "dosis radical hidroxilo eficaz" es una función tanto de la concentración inicial de hidroxilo radical generado y la vida media del radical. Estos dos parámetros dependen parcialmente entre sí, haciendo que el modelado cinético teórico sea algo complejo(Figura 2). Dos muestras podrían tener vida media radical inicial muy diferente mientras se mantiene la misma dosis radical efectiva cambiando la concentración inicial de hidroxilo radical formado; seguirán generando huellas idénticas17. Adenina13 y Tris12 son convenientes dosímetros radicales hidroxilo porque su nivel de oxidación se puede medir por espectroscopia UV en tiempo real, lo que permite a los investigadores identificar rápidamente cuando hay un problema con la dosis efectiva de radical hidroxilo y para solucionar su problema. Para resolver este problema, es importante un dosímetro en línea ubicado en el sistema de flujo directamente después del sitio de irradiación que puede monitorear la señal de los cambios de absorbancia de la adenina en tiempo real. Esto ayuda a llevar a cabo experimentos FPOP en amortiguadores o cualquier otro excipiente con niveles ampliamente diferentes de capacidad de barrido radical hidroxilo17. Esta compensación de dosis radical se puede realizar en tiempo real, dando resultados estadísticamente indistinguibles para el mismo conformerlo mediante el ajuste de la dosis radical efectiva.
En este protocolo, tenemos procedimientos detallados para realizar un experimento típico de FPOP con compensación de dosificación radical utilizando adenina como un dosímetro radical óptico interno. Este método permite a los investigadores comparar huellas entre condiciones FPOP que tienen diferente capacidad de barrido mediante la realización de compensación en tiempo real.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> Figura 2: Simulación cinética de la compensación basada en la dosimetría. La respuesta del dosímetro de adenina de 1 mM se mide en un analito de cilima de 5 mM con una concentración inicial de 1 mM de «1 mM" en un sensor radical hidroxilo inicial (▪OH t1/2a53 ns) y se establece como respuesta del dosímetro objetivo (negro). Tras la adición de 1 mM de la histidina excipiente carroñera, la respuesta del dosímetro (azul) disminuye junto con la cantidad de oxidación de proteínas de manera proporcional (cian). La vida media del radical hidroxilo también disminuye (▪OH t1/2a39 ns). Cuando la cantidad de radical hidroxilo generado se incrementa para dar un rendimiento equivalente de dosímetro oxidado en la muestra con 1 mM histidina carroñero como se logra con 1 mM de radical hidroxilo en ausencia de carroñero (rojo), la cantidad de oxidación de proteína que se produce de forma similar se convierte en idéntica (magenta), mientras que la vida media radical hidroxilo disminuye aún más (▪OH t1/2=ns). Adaptado con permiso de Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas (FPOP) es una técnica de biología estructural basada en espectrometría de masas que sondea la superficie accesible al solvente de las proteínas. Esta técnica se basa en la reacción de las cadenas laterales de aminoácidos con radicales hidroxilo que se difunden libremente en solución. FPOP genera estos radicales in situ por fotólisis láser de peróxido de hidrógeno, creando una ráfaga de radicales hidroxilo que se agota en el orden de un microsegundo. Cuando estos radicales hidroxilo reaccionan con una cadena lateral de aminoácidos accesibles al disolvente, los productos de reacción presentan un cambio de masa que se puede medir y cuantificar mediante espectrometría de masas. Dado que la tasa de reacción de un aminoácido depende en parte de la superficie accesible del disolvente promedio de ese aminoácido, los cambios medidos en la cantidad de oxidación de una región determinada de una proteína pueden correlacionarse directamente con los cambios en la accesibilidad del disolvente de esa región entre diferentes conformaciones (por ejemplo, ligando-unido versus ligando-libre, monómero vs. agregado, etc.) FPOP se ha aplicado en una serie de problemas en la biología, incluyendo interacciones proteína-proteína, cambios en la conformación de proteínas, y unión proteína-ligand. Dado que la concentración disponible de radicales hidroxilo varía en función de muchas condiciones experimentales en el experimento FPOP, es importante controlar la dosis radical efectiva a la que está expuesto el analito proteico. Este monitoreo se logra eficientemente mediante la incorporación de un dosímetro en línea para medir la señal de la reacción FPOP, con fluencia láser ajustada en tiempo real para lograr la cantidad deseada de oxidación. Con esta compensación, los cambios en la topografía proteica que reflejan cambios en la conformación, superficies de unión de ligandos y/o interfaces de interacción proteína-proteína se pueden determinar en muestras heterogéneas utilizando cantidades de muestra relativamente bajas.

La comparación de la huella de péptido de cadena pesada del adalimumab biosimilar en tampón de fosfato y cuando se calienta a 55 oC durante 1 h muestra resultados interesantes. La prueba t del estudiante se utiliza para la identificación de péptidos que se cambian significativamente en estas dos condiciones (p ≤ 0,05). Los péptidos 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413 y 414-420 muestran una protección significativa contra el disolvente cuando la proteína se calienta para formar agregados (<strong c...

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Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

La oxidación fotoquímica rápida de proteínas es una técnica emergente para la caracterización estructural de proteínas. Diferentes aditivos solventes y ligandos tienen variadas propiedades de barrido hidroxilo radical. Para comparar la estructura proteica en diferentes condiciones, se requiere una compensación en tiempo real de los radicales hidroxilo generados en la reacción para normalizar las condiciones de reacción.

Habilitación de la compensación en tiempo real en oxidaciones fotoquímicas rápidas de proteínas para la determinación de los cambios en la topografía proteica

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

El método facilita la medición de la confirmación de proteínas y las interacciones proteicas. La composición del tampón, la pureza de la muestra y los requisitos de concentración de proteínas son flexibles, lo que permite que el método aborde problemas estructurales desafiantes. Esta técnica permite una compresión de muestras en una amplia variedad de diferentes sistemas de búfer.Usando nuestro método de dosimetría, los investigadores pueden monitorear qué tan bien están funcionando sus reacciones de etiquetado en tiempo real. Una aplicación de esta tecnología es en el desarrollo de fármacos porque permite a los investigadores probar formulaciones de fármacos muy diferentes y cómo afectan la estructura de proteínas. Para preparar el banco óptico FPOP.Primero encienda el láser y ajuste el láser al gatillo externo, energía constante y sin reemplazo de gas. Cuando el láser se ha calentado, ajuste la energía láser por pulso a entre 80 y 120 miligramos por pulso y utilice una antorcha de butano para quemar suavemente la codificación de poliimida del capilar en el punto en el que el dosímetro en línea leerá la señal absorbente a 265 nanómetros después de la exposición al láser. Utilice una toallita sin pelusas y metanol para limpiar suavemente los desechos del capilar y coloque el capilar limpio a través de la trayectoria del haz del láser y en el dosímetro en línea.Presione la palanca en la parte superior del dosímetro en línea para abrir la bisagra y retirar los soportes magnéticos. Coloque el capilar en la ranura de la máquina del dosímetro en línea utilizando los soportes magnéticos para mantener el capilar en su lugar y cierre la bisagra del dosímetro sobre el capilar presionando la bisagra hasta que la palanca encaje en su lugar. Haga clic en el botón de flash de inicio en el software de dosimetría para comenzar a disparar el láser excimer y establecer la velocidad de repetición preestablecida entre 10 y 20 Hertz en el software de dosimetría con el disparo láser mover la etapa motorizada a través de su rango de movimiento, asegurando que el haz se mantenga centrado en la apertura y que la silueta del capilar se pueda observar a lo largo.A continuación, enjuague el capilar con agua a 20 microlitros por minuto durante al menos un minuto y haga clic en los datos de inicio más cero automático en el software del dosímetro para poner a cero el dosímetro al agua antes de comenzar la recopilación de datos. Para realizar un experimento FPOP añadir dos microlitros de peróxido de hidrógeno a 18 microlitros de solución FPOP y utilizar una pipeta para mezclar suavemente la solución recoger rápidamente la solución en la parte inferior del tubo por centrifugación e inmediatamente utilizar una jeringa hermética de gas para cargar la solución en una bomba de jeringa. Haga clic en la bomba de arranque e inicie los datos en el software del dosímetro para iniciar el flujo de la bomba de jeringa al caudal adecuado y utilice el dosímetro en línea para supervisar la lectura de adenina en tiempo real hasta que la señal absorbente a 265 nanómetros se estabilice la recogida de la muestra en un contenedor de residuos.Para comenzar a disparar el láser a la velocidad de repetición preestablecida, haga clic en el botón de flash de inicio en el software del dosímetro y utilice el dosímetro en línea para supervisar la lectura de adenina en tiempo real. La diferencia en la absorbancia a 265 nanómetros con el láser apagado y el láser encendido serán los absorbentes delta a 265 nanómetros de lectura. Asegurar que los radicales hidroxilo comparables estén disponibles para reaccionar con proteínas a través de diferentes muestras.Compare los absorbentes delta a 265 nanómetros de lectura obtenidos con el dosímetro en línea con los absorbentes delta deseados a 265 nanómetros de lectura obtenidos de experimentos o controles anteriores. Si la lectura está en el nivel deseado, recoja la muestra inmediatamente después del láser o la radiación en el búfer de enfriamiento. Para compensar la dosis radical efectiva para igualar las lecturas de absorbancia, cambie la concentración de peróxido de hidrógeno, cambie la energía láser por pulso o cambie el plano focal de la lente de enfoque para aumentar la fluidez láser.Para hacer un cambio de unidad de absorción de más de 10 mililia en la lectura de absorbentes delta rehace la muestra con más o menos peróxido de hidrógeno y vuelva a ejecutar la muestra como se ha demostrado. Para realizar un pequeño cambio en la lectura de absorbancia en tiempo real, utilice la etapa motorizada de 50 milímetros para ajustar la posición de la lente de enfoque para ajustar el plano focal del haz incidente. Medir la cantidad efectiva de radical hidroxilo presente en la muestra después de monitorizar la radiación láser, los absorbentes delta de adenina a 265 nanómetros en tiempo real con un detector capilar UV en línea utilizando la etapa motorizada para ajustar la posición de la lente hasta que los absorbentes delta a 265 nanómetros de lectura sea igual a la lectura deseada.La comparación de la huella de péptido de cadena pesada del adilumumab biosimilar en tampón de fosfato y después del calentamiento a 55 grados Celsius durante una hora revela que las regiones de péptidos indicadas demuestran una protección significativa contra los disolventes cuando la proteína se calienta para formar agregados. El uso de un dosímetro en línea en tiempo real para monitorear la diferencia en los absorbentes de adenina antes y después del láser o la radiación indica que se observa un cambio comparable en el nivel de absorbentes de adenina en el tampón MES en comparación con el tampón de fosfato. Mientras que la oxidación media de los péptidos es menor en presencia de tampón MES en comparación con el tampón de fosfato.Sin embargo, como la fluidez láser se incrementa para tener una respuesta de dosimetría de adenina igual, los valores medios de oxidación del péptido son casi los mismos después de FPOP y MES buffer y fosfato buffer. Como la lectura de la dosimetría se ve afectada por la concentración de peróxido de fluencia láser, así como por el carroñero radical. Tenga cuidado de que la respuesta de dosimetría entre la encuesta de muestra cerca una de la otra.La mutagénesis dirigida por el sitio se utiliza a menudo para sondear sitios protegidos en FPOP. Esto permite a los investigadores determinar si los cambios se deben a Alistair. Esta técnica facilita la comparación de proteínas en diferentes tampones o formulaciones permitiendo a los investigadores determinar el efecto de diferentes aditivos en la confirmación de proteínas.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Resuelta en el tiempo de ionización por electrospray de hidrógeno-deuterio Espectrometría de Masas de cambio para el estudio de la estructura proteica y Dinámica

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Investigación

Bioquímica

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Seguimiento en tiempo real de la separación de fragmentos de ADN por Smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Determinación del contenido de glucógeno en las cianobacterias

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regeneración de microelectrodos de oro vestidas para un analizador en tiempo real de la célula

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Los extractos de la determinación de la especificidad de la proteasa en el tejido de ratón por espectrometría de masas MALDI-TOF: manipulando PH para causar cambios de la especificidad

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Inmovilización covalente de las proteínas para la espectroscopia de fuerza sola molécula

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Observación en tiempo real de la reacción de intercambio de filamento de ADN mediada por Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

En tiempo real, semi-automatizado de medición fluorescente de la superficie de las vías respiratorias pH líquido de las células epiteliales de las vías respiratorias humanas primarias

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Caracterización de proteínas celulares con oxidación fotoquímica rápida en las células de proteínas

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Ensayo de cambio de gel de intercambio Acyl-PEGyl para la determinación cuantitativa de la palmitoylación de las proteínas de la membrana cerebral

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...