Name: enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes
Uploaded: 2020-09-01T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Vi erkänner forskningsfinansiering från National Institute of General Medical Sciences bevilja R43GM125420-01att stödja kommersiell utveckling av en bänkskiva FPOP enhet och R01GM127267 för utveckling av standardisering och dosimetri protokoll för hög energi FPOP.

1. Förbered Den optiska bänken och kapillären för FPOP
FÖRSIKTIGHET: KrF-excimerlasrar är extrema ögonrisker, och direkt eller reflekterat ljus kan orsaka permanenta ögonskador. Bär alltid lämpligt ögonskydd, undvik närvaron av eventuella reflekterande föremål nära strålbanan när det är möjligt och använd tekniska kontroller för att förhindra obehörig åtkomst till en aktiv laser och för att begränsa eventuella förlupna reflektioner.
<ol><li>Förbered den optiska b?...

Masspektrometribaserade strukturella tekniker, inklusive väte-deuteriumutbyte, kemisk tvärbindning, kovalent märkning och infödda spraymasspektrometri och jonrörlighet har snabbt ökat i popularitet på grund av deras flexibilitet, känslighet och förmåga att hantera komplexa blandningar. FPOP ståtar med flera fördelar som har ökat sin popularitet inom området masspektrometri-baserade strukturella tekniker. Liksom de flesta kovalenta märkning strategier, ger det en stabil kemisk ögonblicksbild av protein top...

Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en framväxande teknik för bestämning av proteintopografiska förändringar genom ultrasnabb kovalent modifiering av den lösningsmedelsexponerade ytan av proteiner följt av detektion av LC-MS1. FPOP genererar en hög koncentration av hydroxylradikaler in situ genom UV-laserblixt fotolys av väteperoxid. Dessa hydroxylradikaler är mycket reaktiva och kortlivade, konsumeras på ungefär en mikrosekund tidsskala under FPOP villkor2. Dessa hydroxylradikaler sprider sig genom vatten och oxiderar olika organiska komponenter i lösning vid kinetiska satser som generellt sett sträcker sig från snabb (~106 M-1 s-1) till diffusionsstyrd3. När hydroxylradikala möter en proteinyta kommer radikalen att oxidera aminosyrans sidokedjor på proteinytan, vilket resulterar i en massförskjutning av den aminosyran (oftast den nettotillsats av en syreatom)4. Oxidationsreaktionens hastighet vid någon aminosyra beror på två faktorer: den inneboende reaktiviteten av den aminosyran (som beror på sidokedjan och sekvenssammanhang)4,5 ochden sidokedjans tillgänglighet till den spridande hydroxylradikala, som nära korrelerar till den genomsnittliga lösningsmedels åtkomliga ytan6,7. Alla av de standarda aminosyrorna utom glycin har observerats som märkta av dessa mycket reaktiva hydroxylradikaler i FPOP-experiment, om än vid vitt skilda avkastningar; i praktiken, Ser, Thr, Asn, och Ala ses sällan som oxideras i de flesta prover utom under höga radikala doser och identifieras genom noggrann och känslig riktade ETD fragmentering8,9. Efter oxidation släcks proverna för att avlägsna väteperoxid och sekundära oxidanter (superoxid, singlet oxygen, peptidylhydroxider etc.) De släckta proverna är sedan proteolytiskt rötade för att generera blandningar av oxiderade peptider, där den strukturella informationen fryses som en kemisk "ögonblicksbild" i mönstren för oxidationsprodukter av de olika peptiderna (Figur 1). Vätskekromatografi som kopplas till masspektrometri (LC-MS) används för att mäta mängden oxidation av aminosyror i en given proteolytisk peptid baserat på de relativa intensiteterna hos de oxiderade och ooxiderade versionerna av den peptiden. Genom att jämföra detta oxidativa fotavtryck av samma protein som erhållits under olika konformationsförhållanden (t.ex. ligandbundet kontra ligandfritt) kan skillnader i mängden oxidation av en viss region av proteinet korreleras direkt med skillnader i den lösningsmedelstillgängliga ytan i denregionen 6,7. Förmågan att tillhandahålla protein topografisk information gör FPOP till en attraktiv teknik för högre ordningens strukturbestämning av proteiner, bland annat vid proteinterapeutisk upptäckt och utveckling10,11.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig01.jpg"> Bild 1: Översikt av FPOP. Proteinens yta kovalent modifieras av mycket reaktiva hydroxylradikaler. De hydroxylradikaler kommer att reagera med aminosyra sidokedjor av proteinet i en takt som starkt påverkas av lösningsmedel tillgänglighet av sidokedjan. Topografiska förändringar (till exempel på grund av bindningen av en ligand som visas ovan) kommer att skydda aminosyror i regionen av interaktion från att reagera med hydroxylradikaler, vilket resulterar i en minskning av intensiteten av modifierad peptid i LC-MS signalen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig01large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>
Olika beståndsdelar som finns i FPOP-lösningen (t.ex., ligander, hjälpämnen, buffertar) har olika rensningsaktivitet mot de hydroxylradikaler som genereras på laserfotolysen av väteperoxid3. På samma sätt kan en liten förändring i peroxidkoncentration, laserfluens och buffertkomposition ändra den effektiva radikaldosen, vilket gör reproduktionen av FPOP-data utmanande över proverna och mellan olika laboratorier. Därför är det viktigt att kunna jämföra den hydroxylradikala dos som finns att reagera med protein i varje prov med hjälp av en av flera tillgängliga hydroxylradikala dosimeter12,13,14,15,16. Hydroxylradikala dosimeters agera, genom att konkurrera med analyten (och med alla asätare i lösning) för slå samman av hydroxylradikaler; den effektiva dosen av hydroxylradikaler mäts genom mätning av mängden oxidation av dosimetern. Observera att "effektiv hydroxylradikala dos" är en funktion av både den initiala koncentrationen av hydroxylradikala genereras och halveringstiden för den radikala. Dessa två parametrar är delvis beroende av varandra, vilket gör den teoretiska kinetiska modelleringen något komplex (Figur 2). Två prover kunde ha vilt olika inledande radikala halveringstid samtidigt som samma effektiva radikal dos genom att ändra den ursprungliga koncentrationen av hydroxylradikala bildas; de kommer fortfarande att generera identiska fotavtryck17. Adenin13 och Tris12 är bekväma hydroxylradikala dosimeter eftersom deras oxidationsnivå kan mätas med UV-spektroskopi i realtid, vilket gör det möjligt för forskare att snabbt identifiera när det finns ett problem med effektiv hydroxylradikala dos och att felsöka deras problem. För att lösa detta problem, en inline dosimeter som ligger i flödessystemet direkt efter platsen för bestrålning som kan övervaka signalen från adenin absorbans förändringar i realtid är viktigt. Detta hjälper i utförandet av FPOP experiment i buffertar eller någon annan hjälpämne med vitt skilda nivåer av hydroxylradikala rensning kapacitet17. Denna radikala doseringskompensation kan utföras i realtid, ger statistiskt omöjlig att skilja resultat för samma conformer genom att justera den effektiva radikal dos.
I detta protokoll, Vi har detaljerade förfaranden för att utföra en typisk FPOP experiment med radikal dosering ersättning med hjälp av adenin som en intern optisk radikal dosimeter. Med den här metoden kan prövarna jämföra avtryck mellan FPOP-villkor som har olika rensningskapacitet genom att utföra kompensation i realtid.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61580/61580fig02.jpg"> Figur 2: Kinetisk simulering av dosimetribaserad ersättning. 1 mM adenin dosimeter svar mäts i 5 μM lysozym analyte med en 1 mM initial hydroxylradikala koncentrationen (▪OH t1/2=53 ns), och som ett mål dosimeter svar (svart). Vid tillsats av 1 mM av asätaren excipient histidin, dosimetern svaret (blå) minskar tillsammans med mängden protein oxidation på ett proportionellt sätt (cyan). Halveringstiden för hydroxylradikala minskar också (▪ H.1/2=39 ns). När mängden hydroxylradikala genereras ökas för att ge en motsvarande avkastning av oxiderad dosimeter i provet med 1 mM histidin asopvenger som uppnås med 1 mM hydroxylradikala i frånvaro av sca med en mängd proteinoxidation som uppträder på liknande sätt blir identiskt (magenta), medan den hydroxylradikala halveringstiden minskar ännu mer (▪OH t1/2=29 ns). Anpassad med tillstånd från Sharp J.S., Am Pharmaceut Rev 22, 50-55, 2019. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61580/61580fig02large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att visa en större version av denna figur.</a>

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Adenine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>147440250</td>
			<td>Soluble in water upto 3.5 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>39-905</td>
			<td>1000 &#956;m Aperture Diameter, Gold-Plated Copper Aperture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>53-287</td>
			<td>25.8mm Outer Diameter, Precision Pinhole Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Catalse</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>C-40</td>
			<td>Catalase from bovine liver, lyophilized powder, &#8805;10,000 units/mg protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>COMPex Pro laser</td>
			<td>Coherent</td>
			<td>1113836</td>
			<td>COMPexPRO 102, F-Vversion, KrF laser, No XeCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dithiotheitol (DTT)</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V3151</td>
			<td>DTT, Molecular Grade (DL-Dithiothreitol)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fraction collector</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Automated fraction collector</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fused silica capillay</td>
			<td>Molex</td>
			<td>1068150023</td>
			<td>Polymicro Flexible Fused Silica Capillary Tubing, Inner Diameter 100 &#181;m, Outer Diameter 375 &#181;m, TSP100375</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glutamine</td>
			<td>Acros Organics</td>
			<td>119951000</td>
			<td>L(+)-Glutamine, 99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holder for lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>03-668</td>
			<td>53 mm Outer Diameter, Three-Screw Adjustable Ring Mount</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hydrogen peroxide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>H325-100</td>
			<td>Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS), Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LC-MS/MS system</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>IQLAAEGAAPFADBMBCX</td>
			<td>Dionex Ultimate 3000 coupled to Orbitap Fusion Tribrid mass spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mas spec grade Acetonitrile</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A955-1</td>
			<td>Acetonitrile, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade formic acid</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>A117-50</td>
			<td>Formic Acid, 99.0+%, Optima&#8482; LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mass spec grade water</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>W6-4</td>
			<td>Water, Optima LC/MS Grade, Fisher Chemical</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MES buffer</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>M0164</td>
			<td>MES hemisodium salt</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methionine amide</td>
			<td>Bachem</td>
			<td>4000594.0005</td>
			<td>H-met-NH2.HCl</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro V clamp</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>VK250</td>
			<td>Micro V-clamp with stainless steel blades</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Motorized stage</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>68-638</td>
			<td>50mm Travel Motorized Stage System with Manual Control</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nano C18 colum</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>164534</td>
			<td>Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical bench</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>56-935</td>
			<td>18&#34; x 18&#34; breadboard</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pioneer FPOP Module System</td>
			<td>GenNext Technologies, Inc.</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Inline FPOP Radical Dosimetry System</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Post holder</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>58-979</td>
			<td>3&#34; Length, &#188;-20 Thread, Post Holder</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate dibasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP331-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Dibasic Heptahydrate (Colorless-to-White Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium phosphate monobasic</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>BP330-500</td>
			<td>Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (Colorless-to-white Crystals), Fisher BioReagents</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>81065</td>
			<td>100 &#181;L, Model 1710 RN SYR, Small Removable NDL, 22s ga, 2 in, point style 3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>KD Scientific</td>
			<td>788101</td>
			<td>Legato&#160;101 syringe pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trap C18 column</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>160454</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>252859</td>
			<td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin</td>
			<td>Promega</td>
			<td>V5111</td>
			<td>Sequencing Grade Modified Trypsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>UV plano convex lens</td>
			<td>Edmund Optics</td>
			<td>84-285</td>
			<td>30 mm Dia. x 120 mm FL Uncoated, UV Plano-Convex Lens</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enabling real-time compensation in fast photochemical oxidations of proteins for the determination of protein topography changes

Snabb fotokemisk oxidation av proteiner (FPOP) är en masspektrometribaserad strukturbiologiteknik som undersöker proteiners lösningstillgängliga yta. Denna teknik bygger på reaktionen av aminosyran sidokedjor med hydroxylradikaler fritt sprida i lösning. FPOP genererar dessa radikaler på plats genom laser fotolys av väteperoxid, skapa en explosion av hydroxylradikaler som är uttömda på order av en mikrosekund. När dessa hydroxylradikaler reagerar med en lösningsmedelsåtkomlig aminosyras sidokedja uppvisar reaktionsprodukterna en massförskjutning som kan mätas och kvantifieras genom masspektrometri. Eftersom reaktionshastigheten för en aminosyra delvis beror på den aminosyrans genomsnittliga tillgängliga yta för lösningsmedel, kan uppmätta förändringar i mängden oxidation av en viss region av ett protein korreleras direkt till förändringar i lösningstillgängligheten i den regionen mellan olika konformationer (t.ex. ligandbunden ligand-fri, monomer kontra aggregera, etc.) FPOP har tillämpats i ett antal problem inom biologi, inklusive protein-protein interaktioner, protein konformationella förändringar, och protein-ligand bindning. Eftersom den tillgängliga koncentrationen av hydroxylradikaler varierar utifrån många experimentella tillstånd i FPOP-experimentet, är det viktigt att övervaka den effektiva radikaldos som proteinalyten exponeras för. Denna övervakning uppnås effektivt genom att man införlivar en inline-dosimeter för att mäta signalen från FPOP-reaktionen, med laserfluens justerad i realtid för att uppnå önskad mängd oxidation. Med denna kompensation kan förändringar i proteintopografi som reflekterar konformationsförändringar, ligandbindande ytor och/eller protein-proteininteraktionsgränssnitt bestämmas i heterogena prover med hjälp av relativt låga provmängder.

Jämförelse av den tunga kedjan peptid fotavtryck av adalimumab biosimilar i fosfat buffert och vid uppvärmning vid 55 °C för 1 h visar intressanta resultat. Studentens t-test används för identifiering av peptider som väsentligt ändras i dessa två tillstånd (p ≤ 0,05). Peptiderna 20-38, 99-125, 215-222, 223-252, 260-278, 376-413, och 414-420 uppvisar ett betydande skydd mot lösningsmedel när proteinet upphettas till formaggregat (figur 5)30. Detta experi...

Watch this Scientific Journal Video about Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes at JoVE.com

Enabling Real-Time Compensation in Fast Photochemical Oxidations of Proteins for the Determination of Protein Topography Changes

Snabb fotokemisk oxidation av proteiner är en framväxande teknik för den strukturella karakteriseringen av proteiner. Olika lösningsmedelstillsatser och ligander har varierade hydroxylradikala rensningsegenskaper. För att jämföra proteinstrukturen i olika förhållanden krävs realtidskompensation av hydroxylradikaler som genereras i reaktionen för att normalisera reaktionsförhållandena.

Aktivera Realtidskompensation i Snabb Fotokemiska oxidationer av proteiner för bestämning av Protein Topografi Förändringar

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a mass spectrometry-based structural biology technique that probes the solvent-accessible surface area ...

Metoden underlättar mätning av proteinbekräftelse och proteininteraktioner. Buffertsammansättningen, provrenhet och protein koncentrationskrav är flexibla gör att metoden för att ta itu med utmanande strukturella problem. Denna teknik möjliggör en komprimering av prover i en stor mängd olika buffertsystem.Med hjälp av vår dosimetrimetod kan forskare övervaka hur väl deras märkningsreaktioner fungerar i realtid. En tillämpning av denna teknik är i läkemedelsutveckling eftersom det tillåter forskare att testa vitt skilda läkemedelsformuleringar och hur de påverkar proteinstruktur. För att förbereda den optiska FPOP-bänken.Först slå på lasern och ställ in lasern till yttre utlösare, konstant energi och ingen gas ersättning. När lasern har värmts in sätter laserenergin per puls på mellan 80 till 120 milligram per puls och använd en butanbrännare för att försiktigt bränna polyimidkodningen av kapillären på den plats där inline-dosimetern kommer att avläsa den absorberande signalen vid 265 nanometer efter laserexponering. Använd en luddfri torka och metanol för att försiktigt torka skräp från kapillären och placera den rengjorda kapillären genom laserns strålväg och in i inlinesdsimetern.Tryck på spaken på ovansidan av inline dosimetern för att öppna gångjärnet och avlägsna de magnetiska hållarna. Placera kapillären i maskinspåret på inline-dosimetern med hjälp av magnethållarna för att hålla kapillären på plats och stäng dosimeterns gångjärn över kapillärpressningen av gångjärnet tills spaken låses på plats. Klicka på startblixtknappen i dosimetriprogramvaran för att börja avfyra excimerlasern och ställ in den förinställda repetitionshastigheten mellan 10 till 20 Hertz i dosimetriprogramvaran med laserblåsningsflytta den motoriserade scenen genom sitt rörelseomfång, vilket säkerställer att strålen håller sig centrerad på bländaren och att kesilhuetten av kapillären kan observeras under hela tiden.Spola sedan kapillären med vatten vid 20 mikroliter per minut i minst en minut och klicka på startdata plus auto zero i dosimeterns programvara för att nolla dosimetern till vattnet innan datainsamlingen påbörjas. För att utföra ett FPOP-experiment tillsätt två mikroliter av väteperoxid till 18 mikroliter av FPOP-lösning och använd en pipetter för att försiktigt blanda lösningen snabbt samla lösningen i botten av röret genom centrifugering och omedelbart använda en gastät spruta för att ladda lösningen i en spruta pump. Klicka på Startpump och starta data i dosimeterns programvara för att starta flödet på sprutpumpen med lämplig flödeshastighet och använd inline-dosimetern för att övervaka adeninavläsningen i realtid tills den absorberande signalen vid 265 nanometer stabiliserar insamlingen av provet i en avfallsbehållare.För att börja avfyra lasern vid den förinställda repetitionshastigheten slutenergi klicka på knappen startblixt i dosimeterns programvara och använd inline-dosimetern för att övervaka adeninavläsningen i realtid. Skillnaden i absorbans vid 265 nanometer med lasern av och lasern på kommer att deltaabsorbenter vid 265 nanometer läsning. För att säkerställa att jämförbara hydroxylradikaler finns tillgängliga för att reagera med proteiner över olika prover.Jämför deltaabsorbenterna vid 265 nanometersavläsning som erhålls med inline-dosimetern med lustdeltaabsorbenterna vid 265 nanometersavläsning som erhållits från tidigare experiment eller kontroller. Om avläsningen är på önskad nivå samla provet omedelbart efter laser eller strålning i släcka bufferten. För att kompensera den effektiva radikala dosen för att utjämna absorbansavläsningarna ändrar väteperoxidkoncentrationen, ändra laserenergin per puls eller ändra fokuseringslinsens fokalplan för att öka laserfluensen.För att göra en större än 10 milli absorbans enhet förändring i delta absorbenter behandlingen remake provet med mer eller mindre väteperoxid och köra provet som visat. För att göra en liten förändring i absorbansavläsningen i realtid, använd 50 millimeters motoriserade scenen för att justera placeringen av fokuseringslinsen för att justera infallande strålens fokalplan. För att mäta den effektiva mängden hydroxylradikala som finns i provet efter laserstrålning övervaka adenin deltaabsorbenter vid 265 nanometer i realtid med en inline UV kapillär detektor med hjälp av motoriserade scenen för att justera linsen position tills deltaabsorbenter vid 265 nanometer avläsning är lika med önskad avläsning.Jämförelse av den tunga kedjan peptid fotavtryck av adilumumab biosimilar i fosfat buffert och efter uppvärmning vid 55 grader Celsius i en timme visar att de angivna peptidregionerna visar betydande skydd mot lösningsmedel när proteinet värms upp för att bilda aggregat. Att använda en inline dosimeter i realtid för att övervaka skillnaden i adeninabsorbenter före och efter laser eller strålning indikerar att en jämförbar förändring av adeninabsorbentsnivån observeras i MES-buffert jämfört med fosfatbuffert. Medan den genomsnittliga oxidationen av peptiderna är lägre i närvaro av MES buffert jämfört med fosfatbuffert.Men som lasern fluence ökas för att ha en lika adenin dosimetri svar den genomsnittliga peptid oxidation värden är nästan samma efter FPOP och MES buffert och fosfat buffert. Som dosimetri behandlingen påverkas av lasern fluence peroxid koncentration samt den radikala asätaren. Var försiktig att dosimetrisvaret mellan urvalsundersökningen nära varandra.Site riktad mutagenesis används ofta för att sondera platser som skyddas i FPOP. Detta gör det möjligt för forskare att avgöra om förändringar beror på Alistair. Denna teknik underlättar jämförelsen av proteiner i olika buffertar eller formuleringar som gör det möjligt för forskare att bestämma effekten av olika tillsatser på protein bekräftelse.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Time-resolved ElectroSpray Ionization Hydrogen-deuterium Exchange Mass Spectrometry for Studying Protein Structure and Dynamics

Tidsupplöst elektrosprayjonisering Väte-deuterium Exchange-masspektrometri för att studera Protein Structure and Dynamics

Intrinsically disordered proteins (IDPs) have long been a challenge to structural biologists due to their lack of stable secondary structure elements. ...

Real-time Tracking of DNA Fragment Separation by Smartphone

Spårning i realtid av DNA-fragment separering av smartphone

Slab gel electrophoresis (SGE) is the most common method for the separation of DNA fragments; thus, it is broadly applied to the field of biology and ...

Determination of the Glycogen Content in Cyanobacteria

Bestämning av glykogeninnehållet i cyanobakterier

Cyanobacteria accumulate glycogen as a major intracellular carbon and energy storage&#160;during photosynthesis. Recent developments in research have ...

Regeneration of Arrayed Gold Microelectrodes Equipped for a Real-Time Cell Analyzer

Regenerering av klädd guld mikroelektroder utrustade för en realtid Cell Analyzer

The label-free cell-based assay is advantageous for biochemical study because of it does not require the use of experimental animals. Due to its ability ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Bestämning av proteashämmare specificitet i mus vävnad extrakt av MALDI-TOF-masspektrometri: manipulera PH för att orsaka specificitet förändringar

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Covalent Immobilization of Proteins for the Single Molecule Force Spectroscopy

Kovalent immobilisering av proteiner för den enda molekyl kraft spektroskopin

In recent years, atomic force microscopy (AFM) based single molecule force spectroscopy (SMFS) extended our understanding of molecular properties and ...

Real-time Observation of the DNA Strand Exchange Reaction Mediated by Rad51

Realtid Observation av DNA Strand Exchange reaktionen medieras av Rad51

The DNA strand exchange reaction mediated by Rad51 is a critical step of homologous recombination. In this reaction, Rad51 forms a nucleoprotein filament ...

Real-Time, Semi-Automated Fluorescent Measurement of the Airway Surface Liquid pH of Primary Human Airway Epithelial Cells

Real-Time, semi-automatiserad fluorescerande mätning av luftvägarna yta flytande pH i primära humana luftvägs epitelceller

In recent years, the importance of mucosal surface pH in the airways has been highlighted by its ability to regulate airway surface liquid (ASL) ...

Characterizing Cellular Proteins with In-cell Fast Photochemical Oxidation of Proteins

Karakterisera cellulära proteiner med In-cell Snabb fotokemisk oxidation av proteiner

Fast photochemical oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting method used to characterize protein structure and interactions. ...

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Assay for Quantitative Determination of Palmitoylation of Brain Membrane Proteins

Acyl-PEGyl Exchange Gel Shift Analys för kvantitativ bestämning av palmitolerisering av hjärnans membranproteiner

Activity-dependent alterations in the levels of synaptic AMPA receptors (AMPARs) within the postsynaptic density (PSD) is thought to represent a cellular ...