Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Dette arbejde støttes af Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).

For at sikre overholdelse af etiske standarder blev alle dyreprocedurer i forbindelse med isolering af kardiomyocytter fra gnavere først godkendt af University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Derudover blev alle dyreforsøg udført i fuld overensstemmelse med vejledning fra University of Chicago IACUC.
1. Fremstilling af hybrider af cellen-SiNWs
<ol><li>Isoler primære kardiomyocytter (CMs) ved hjælp af et kommercielt kit i overensstemmelse med producentens retn...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

Vi har vist her en enkel måde at udføre intracellulær elektrisk stimulation af celler. I denne demonstration brugte vi MFs, der blev prehybridized med SiNWs, derefter co-kulturperler med CMs. Generelt har de fleste prolifererende celler tendens til at internalisere SiNWs, som tillader brug af denne metode med mange andre celletyper. Desuden, mens vi demonstrerede den intracellulære stimulation af celler, de samme principper kan bruges til at udføre ekstracellulær stimulation af celler. Dette kan gøres ved at bloke...

Alle biologiske organismer bruger elektricitet, i form af ioner, til at regulere den cellulære adfærd. Cellemembraner indeholder forskellige typer af specifikke ionkanaler, der muliggør passiv og aktiv transport af ioner. Disse ioner regulerer funktionerne af excitable celler, såsom neuronal aktivitet og skelet-og hjertemusklen kontraktilitet. Men bioelektricitet spiller også en vigtig rolle i ikke-excitable celler, der regulerer mange cellulære funktioner såsom celleproliferation1, neuroimmunity2,3,4, og stamceller differentiering5.
I de seneste årtier har bioelektriciteten vakt stigende interesse, hvilket har bidraget til udviklingen af en lang række teknologier til bioelektroniske grænseflader. Mikroelektrode patch pipetter er guldstandarden for intracellulær optagelse og stimulering6. I denne metode trækkes en glaspipette under særlige forhold for at danne en skarp kant med en porestørrelse på få mikron. Denne pipette er fyldt med en buffer, og pipetten giver mulighed for direkte kontakt med bufferen med den intracellulære diskenhed. Dette resulterer i en bioelektrisk grænseflade, der giver ekstremt høje signal til støj forhold, præcis kontrol over cellulære elektriske aktivitet, og ekstremt høj tidsmæssig opløsning. Selv om denne metode er et ekstremt kraftfuldt værktøj, som for nylig blev nedskaleret til en nano-pipettekonfiguration 7, er det forbundet med flere vigtige tekniske begrænsninger. Cytosolfortyndingseffekten8, samt mekaniske vibrationer, begrænser dens nytte til kortsigtede forhør, og det kræver dyrt specialiseret udstyr og et højt niveau af tekniske færdigheder. Desuden begrænser dens bulkiness antallet af celler, der kan registreres eller stimuleres samtidigt, og på grund af dens invasive, det kan ikke omkonfigureres i hele et eksperiment. For at overvinde disse begrænsninger blev der udviklet mikroelektrodearrays, men elektrodernes størrelse begrænser den rumlige opløsning samt intracellulær adgang. Nanoelektrodearrayer gør det muligt for intracellulær optagelse og stimulering , men kræver slibende elektroporation for at få adgang til cytosol9,10. Desuden er alle disse metoder substratbundet og er derfor begrænset til in vitro-cellekulturer eller til eksterne overfladiske celler uden adgang til celler, der er inde i et 3-dimensionelt (3D) væv.
Optogenetik11 er almindeligt anvendt til at løse disse 3D og in vivo begrænsninger. Men optogenetiske metoder er baseret på urolige af lysaktiverede plasmamembranionkanaler, der distribueres ved plasmamembranen, hvilket begrænser 3D-rumlige opløsning12 og intracellulære kapaciteter.
Vi har for nylig vist, at silicium nanowires (SiNWs) kan bruges til at udføre intracellulære bioelektriske forhør med submicron rumlig opløsning med forskellige ikke-excitable celler, nemlig hjerte myofibroblaster og oligodendrocytes13. Desuden brugte vi disse SiNWs til at udføre ex-vivo celle specifik forhør i en 3D hjertevæv, at undersøge, hvordan hjerteceller elektrisk par in vivo14. En stor fordel ved denne metode er dens enkelhed; det kræver ingen genetisk modifikation eller voluminøse instrumentering. Mange celler vil spontant internalisere foto-responsive SiNWs uden behov for sonikering eller elektroporation15. Desuden vil de spontant undslippe endosomal indkapsling og danne en problemfri integration med cytosol og intracellulære organeller13,15. Disse celle-SiNWs kompositter, betegnes celle-silicium hybrider, besidder den dynamiske, bløde og alsidige karakter af den oprindelige celle, samt de optoelektriske kapaciteter af SiNWs. Efter hybridisering, cellen-SiNW hybrid kan høstes ved hjælp af standard væv kultur teknikker og anvendes til forskellige anvendelser såsom intracellulære bioelektriske stimulation; undersøgelse af intercellulær bioelektrisk kobling in vitro og for in vivo celle specifik forhør. Som en effektiv stimulering kræver co-lokalisering af høj optisk effekt tætheder og SiNWs, kan man opnå høj rumlig opløsning både i 2D og 3D. I denne protokol beskriver vi i detaljer metoden, samt hvordan resultaterne kan analyseres. Fokus er lagt på den intra- og intercellulære undersøgelse in vitro, men in vivo gennemførelsen af denne metode kan udnyttes direkte til mange andre biologiske scenarier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Myofibroblasts kan spontant internalisere silicium nanowires (SiNWs), hvilket gør dem til et attraktivt mål for bioelektroniske applikationer. Disse celle-silicium hybrider tilbyder blyfri optisk modulering kapaciteter med minimal tivitet til normal celle adfærd. De optiske kapaciteter opnås ved de fototermiske og fotoelektriske egenskaber af SiNWs. Disse hybrider kan høstes ved hjælp af standard væv kultur teknikker og derefter anvendes til forskellige biologiske scenarier. Vi demonstrerer her, hvordan disse hybrider kan bruges til at studere den elektriske kobling af hjerteceller og sammenligne, hvordan myofibroblaster par til hinanden eller til kardiomyocytter. Denne proces kan udføres uden særligt udstyr ud over et fluorescerende mikroskop med koblet laserlinje. Også vist er brugen af en specialbygget MATLAB rutine, der gør det muligt kvantificering af calcium formering inden for og mellem de forskellige celler i kulturen. Myofibroblaster er vist sig at have en langsommere elektrisk respons end kardiomyocytter. Desuden myofibroblast intercellulær formering viser lidt langsommere, men sammenlignelige hastigheder til deres intracellulære hastigheder, hvilket tyder passiv formering gennem hul kryds eller nanorør. Denne teknik er meget fleksibel og kan nemt anvendes til andre cellulære arenaer, for in vitro samt in vivo eller ex vivo undersøgelser.

Denne metodes evne til at give direkte adgang til den intracellulære cytosol afhænger af siNW's spontane internalisering i cellerne. Selv om SiNWs vil gennemgå spontan internalisering i mange celletyper15, nogle celler, såsom kardiomyocytter og neuroner, skal sinws at blive behandlet for at give deres internalisering19. I denne protokol beskriver vi internaliseringsprocessen for p-i-n SiNWs med en diameter på 200-300 nm og ~1-3 μm langt ind i hjerte-Fs. <strong class=...

Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Denne protokol beskriver brugen af silicium nanowires til intracellulær optisk bio-modulering af celle i en enkel og nem at udføre metode. Teknikken er meget tilpasningsdyg til forskellige celletyper og kan bruges til in vitro såvel som in vivo applikationer.

Silicium nanowires og optisk stimulation til undersøgelser af intra- og intercellulær elektrisk kobling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Denne teknik tillader intracellulær bioelektrisk forhør med ekstremt høj rumlig opløsning og celle specificitet ved hjælp af kun standard optisk mikroskopi. Denne metode letter stimulering og elektrisk forhør af celler og specifikke steder i cellerne og kan udføres in vitro samt i 3D ex vivo væv præparater. Denne teknik muliggør bio-elektronisk undersøgelse af mange cellulære arenaer såsom hjerte-eller hjerneceller, samt den elektriske kommunikation mellem alle vores ikke-excitable celler.At isolere myofibroblaster fra en myofibroblast cardiomyocyte suspension, pre-plade de isolerede celler på en 100 millimeter væv kultur parabol i en time, som kardiomyocytter har brug for en fiber hals og behandlet overflade til at overholde. Ved slutningen af inkubationen indsamles den berigede kardiomyocyte, der indeholder supernatant, til downstream-co-kultur. Skyl myofibroblasterne med DMEM for at eliminere eventuelle resterende kardiomyocytter og fodre cellerne med frisk kulturmedium før yderligere to til fire dages inkubation.Når cellerne når 80% sammenløb, skal du bruge en diamant skriver til at skære en tre med tre millimeter chip fra en wafer med kemisk damp deposition-dyrket silicium nanowires. Og brug skarpe kraftfrål til at skylle spånerne i 70%ethanol. Efter skylning, lufttørrer spånerne i 30 minutter under ultraviolet lys i en bio-sikkerhed laminar flow hætte, før du overfører chips til en steril mikro centrifuge rør.Brug en komplet celle kultur medium skylning for at fjerne eventuelle resterende ethanol, før sonikering chips i en milliliter frisk kultur medium i en sonikering bad i en til 10 minutter. Supernatanten skal blive uklar, når nanoledningerne frigives. Bland Silicium nanowire suspension i fem milliliter frisk kultur medium og frø nano wire opløsning på fadet af myofibroblasts.Efter fire timer i cellekulturinkubatoren skylles skålen fem gange med frisk dyrkningsmedium for at fjerne eventuelle uinternale nanoledninger, og cellerne inkuberes i yderligere en time for at tillade, at eventuelle delvist internaliserede nanoledninger inkorporeres fuldstændigt. Næste tilføje 500 mikroliter frisklavet kollagen belægning løsning til en 35 millimeter glas bund skål. Efter en times inkubation ved 37 grader Celsius skylles skålen med steril PBS og høst Silicium nanowire myofibroblast hybrider, med tre milliliter trypsin, i to minutter ved 37 grader Celsius.Når cellerne er taget af, skal reaktionen stoppes med 10 milliliter kulturmedium, skylles kraftigt ved pipettering, og cellerne ikke centrifugeres over 200 G for at undgå at beskadige cellerne. Derefter re-suspendere hybrid celle pellets i en milliliter frisk medium, og frø cellerne på kollagen belagt glas bund skål. For at kontrollere nanotråd internalisering, mærke cellerne med fluorescerende cytosol og membran farvestoffer, i henhold til standard protokoller, og bruge en konfokal mikroskop til at billedet cellerne.Da siliciumnanowirer er meget reflekterende, kan reflekteret lys bruges i stedet for fluorescens til deres visualisering. For at oprette en myofibroblast silicium nanowire hybrid cardiomyocyte co-kultur, frø det passende antal af hver celletype på en kollagen belagt glas bund skål. Og kultur cellerne ved 37 grader Celsius i 48 timer, for at gøre det muligt for cellerne at danne intercellulære mellemrum kryds.På dagen for eksperimentet, erstatte kultur supernatant med en milliliter kultur medium suppleret med frisklavet calcium følsom farvestof, for en 20 til 30 minutters inkubation ved 37 grader Celsius. Ved inkubationens afslutning vaskes pladen to gange med steril PBS, før cellerne behandles med en milliliter forstesteg phenolrød DMEM. Lad derefter det intracellulære calciumfarvestof gennemgå de-esterificering i 30 minutter ved 37 grader Celsius, før du erhverver baseline billeder.Før optisk billeddannelse og stimulation, forvarme en befugtet mikro-inkubator på et mikroskop med en collimated laser linje koblet ind i lysvejen, for calcium billeddannelse og optisk stimulation til 37 grader Celsius og en 5% boble æra kuldioxid blanding. Når mikroskopet er klar, skal du placere myofibroblast hybrid cardiomyocyt co-kultur i mikroinkubatoren og visualisere nanoledningerne ved hjælp af lys feltmikroskopi for at finde et passende stimuleringssted. Når et sted er blevet identificeret, skal lysvejen omkonfigureres til fluorescenstilstand, samtidig med at stimuleringspunktet på nanotrådens foruddefinerede placering bevares, og den optimale stimuleringseffekt og pulslængde valideres for hver siliciumnanilwirestørrelse og celletype.Opnå en to til ti sekunders registrering af baseline intracellulære calcium aktivitet, før stimulere nano wire med en enkelt laser puls på en til 10 melowatts af magt og en en til 10 millisekund varighed, registrering af den resulterende calcium bølge for yderligere to til 10 sekunder. I slutningen af eksperimentet overføre de optagede film af den optiske stimulation til det relevante softwareprogram, for yderligere analyse. Ved hjælp af standardfase kontrastoptik, sammenløb celler er let ses af lys mikroskopi.Silicium nanowires, dog, er næppe synlige, hvilket gør deres steder umuligt at definere ved denne metode. Super indførelse af lys og mørke felt billeder, dog giver visualisering af Perry nukleare arrangement af lys reflekterende silicium nanowires. Konfokal mikroskopi kan bruges til at visualisere fluorescerende markør farves cytosol og plasmamembraner, hvilket gør den intracellulære placering af silicium nanowires mere indlysende.Ved hjælp af standardmikroskopi kan der opnås et lyst feltbillede for at identificere placeringen af den siliciumnanowire, der skal stimuleres. En kort baseline video af spontant slå kardiomyocytter og hvilende myofibroblaster kan derefter erhverves. Efter stimulering kan calciumudbringning i samkulturen registreres.Det tidspunkt, hvor de forskellige celler bliver ophidset, kan bestemmes af det punkt, hvor ændringen i den gennemsnitlige optiske strøm når sit maksimum. Det optiske flow kan derefter beregnes for at hjælpe med at identificere aktiveringstidspunktet i hvert celleområde. De intracellulære hastigheder kan bestemmes for hver celle ved hjælp af Khaimah grafer, med hældningen af linjen repræsenterer det modsatte af den intracellulære formeringshastighed.Her kan der f.eks. Denne metode kan anvendes til in vivo undersøgelser ved at injicere cellen Silicium hybrider direkte ind i vævet og ved hjælp af 3D ex vivo præparater til at studere in vivo elektriske selskab.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Blød Litografiske funktionalisering og mønster oxydfri silicium og germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Fastgørelse Biologiske Prober til silica Optiske biosensorer Anvendelse silankoblingsmidler

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering skeletmuskel Væv fra murine myoblast progenitorceller og anvendelse af elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Syntese af Native, Fibrøst Long Mellemrum og Segmental Long Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optisk påvisning af<em&gt; E. coli</em&gt; bakterier ved Mesoporøse Silicon biosensorer

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porøst silicium mikropartikler til levering af siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Computed Tomography og optisk billeddannelse af Osteogenesis-angiogenese Kobling at Vurdere Integration af kranieknogler autografter og Allografter

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontrol af levende celler Elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Udarbejdelse af Silicon nanotrådene Field-effekt Transistor for Kemiske og biosensorer Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Indberetning af flere signaler gennem en optisk fiber Brug Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...