Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Dit werk wordt ondersteund door het Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Om ervoor te zorgen dat de ethische normen worden nageleefd, werden alle dierprocedures met betrekking tot het isoleren van cardiomyocyten uit knaagdierenharten voor het eerst goedgekeurd door de University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Bovendien werden alle dierproeven uitgevoerd in volledige overeenstemming met de richtlijnen van de Universiteit van Chicago IACUC.
1. Bereiding van cel-SiNWs hybriden
<ol><li>Isoleer primaire cardiomyocyten (CMs) met behulp van ...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

We hebben hier een eenvoudige manier aangetoond om intracellulaire elektrische stimulatie van cellen uit te voeren. In deze demonstratie gebruikten we MF's die werden gefhybridiseerd met SiNWs, vervolgens co-gekweekt met CMs. In het algemeen hebben de meeste zich vermenigvuldigende cellen de neiging om SiNWs te internaliseren, waardoor het gebruik van deze methode met vele andere celtypen mogelijk is. Bovendien, terwijl we de intracellulaire stimulatie van cellen hebben aangetoond, kunnen dezelfde principes worden gebrui...

Alle biologische organismen gebruiken elektriciteit, in de vorm van ionen, om het cellulaire gedrag te reguleren. Celmembranen bevatten verschillende soorten specifieke ionenkanalen waardoor het passieve en actieve transport van ionen mogelijk is. Deze ionen regelen de functies van prikkelbare cellen, zoals neuronale activiteit en skelet- en hartspiercontractiliteit. Bio-elektriciteit speelt echter ook een belangrijke rol in niet-prikkelbare cellen, waarbij veel cellulaire functies worden geregeld, zoals celproliferatie1, neuro-immuniteit2,3,4en stamceldifferentiatie5.
In de afgelopen decennia heeft het gebied van de bio-elektrische sector een toenemende belangstelling getrokken, wat heeft bijgedragen aan de ontwikkeling van tal van technologieën voor bio-elektronische interfaces. Microelectrode patchpipets zijn de gouden standaard van intracellulaire opname en stimulatie6. In deze methode wordt een glazen pipet getrokken onder specifieke omstandigheden om een scherpe rand te vormen met een poriegrootte van enkele micron. Deze pipet is gevuld met een buffer en de pipet maakt direct contact van de buffer met het intracellulaire volume mogelijk. Dit resulteert in een bio-elektrische interface die extreem hoge signaal-ruisverhoudingen, nauwkeurige controle over cellulaire elektrische activiteit en extreem hoge temporele resolutie oplevert. Hoewel deze methode is een zeer krachtig instrument, die onlangs werd opgeschaald naar een nano-pipet configuratie7, het wordt geassocieerd met een aantal belangrijke technische beperkingen. Het cytosol verdunningseffect 8 ,evenalsmechanische trillingen, beperkt zijn nut tot korte termijn ondervragingen, en het vereist dure gespecialiseerde apparatuur en een hoog niveau van technische vaardigheid. Bovendien beperkt de omvangrijkheid het aantal cellen dat tegelijkertijd kan worden geregistreerd of gestimuleerd, en vanwege de invasieve werking ervan kan het niet opnieuw worden geconfigureerd tijdens een experiment. Om deze beperkingen te overwinnen, werden micro-elektroden arrays ontwikkeld, maar de grootte van de elektroden beperkt de ruimtelijke resolutie en intracellulaire toegang. Nanoelectrode arrays maken intracellulaire opname en stimulatie mogelijk, maar vereisen schurende elektrovissing om toegang te krijgen tot de cytosol9,10. Bovendien zijn al deze methoden substraatgebonden en zijn dus beperkt tot in vitro celculturen, of tot externe oppervlakkige cellen, zonder toegang tot cellen die zich in een 3-dimensionaal (3D) weefsel bevinden.
Optogenetica11 wordt veel gebruikt om deze 3D- en in vivo-beperkingen aan te pakken. Optogenetische methoden zijn echter gebaseerd op de verstoringen van lichtgeactiveerde plasmamembraanionkanalen die op het plasmamembraan worden verdeeld, waardoor de 3D ruimtelijke resolutie12 en intracellulaire vermogens worden beperkt.
We hebben onlangs aangetoond dat silicium nanodraden (SiNWs) kan worden gebruikt om intracellulaire bio-elektrische ondervraging uit te voeren met submicron ruimtelijke resolutie met verschillende niet-excitable cellen, namelijk cardiale myofibroblasten en oligodendrocyten13. Bovendien gebruikten we deze SiNW's om ex-vivo celspecifieke ondervragingen uit te voeren binnen een 3D-hartweefsel, om te onderzoeken hoe hartcellen elektrisch in vivo14koppelen. Een groot voordeel van deze methodologie is de eenvoud; het vereist geen genetische modificatie of omvangrijke instrumentatie. Veel cellen zullen spontaan fotoresponsieve SiNWs internaliseren zonder dat er sonicatie of elektroporatienodig is 15. Bovendien zullen ze spontaan ontsnappen aan de endosomale inkapseling en een naadloze integratie vormen met de cytosol en intracellulaire organellen13,15. Deze cel-SiNWs composieten, genoemd cel-silicium hybriden, bezitten de dynamische, zachte en veelzijdige aard van de oorspronkelijke cel, evenals de optoelectric mogelijkheden van de SiNWs. Na hybridisatie kan de cel-SiNW hybride worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en worden gebruikt voor verschillende toepassingen zoals intracellulaire bio-elektrische stimulatie; het bestuderen van intercellulaire bio-elektrische koppeling in vitro; en voor in vivo celspecifieke ondervraging. Aangezien een effectieve stimulatie co-lokalisatie van hoge optische vermogensdichtheden en SiNWs vereist, kan men een hoge ruimtelijke resolutie bereiken, zowel in 2D als in 3D. In dit protocol beschrijven we in detail de methodologie, evenals hoe de resultaten kunnen worden geanalyseerd. De focus ligt op het intra- en intercellulair onderzoek in vitro, maar de in vivo implementatie van deze methodologie kan direct worden gebruikt voor vele andere biologische scenario's.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Myofibroblasts kunnen siliciumnanodraden (SiNWs) spontaan internaliseren, waardoor ze een aantrekkelijk doelwit zijn voor bio-elektronische toepassingen. Deze cel-silicium hybriden bieden loodloze optische modulatie mogelijkheden met minimale verstoring van normaal celgedrag. De optische mogelijkheden worden verkregen door de fotothermale en foto-elektrische eigenschappen van SiNWs. Deze hybriden kunnen worden geoogst met behulp van standaard weefselkweektechnieken en vervolgens worden toegepast op verschillende biologische scenario's. We laten hier zien hoe deze hybriden kunnen worden gebruikt om de elektrische koppeling van hartcellen te bestuderen en te vergelijken hoe myofibroblasts met elkaar koppelen of met cardiomyocyten. Dit proces kan worden bereikt zonder speciale apparatuur buiten een fluorescerende microscoop met gekoppelde laserlijn. Ook getoond is het gebruik van een op maat gemaakte MATLAB routine die het mogelijk maakt de kwantificering van calcium voortplanting binnen en tussen de verschillende cellen in de cultuur. Myofibroblasts blijken een tragere elektrische respons te hebben dan die van cardiomyocyten. Bovendien vertoont de myofibroblast intercellulaire voortplanting iets langzamer, hoewel vergelijkbare snelheden als hun intracellulaire snelheden, wat wijst op passieve voortplanting door gapverbindingen of nanobuisjes. Deze techniek is zeer aanpasbaar en kan gemakkelijk worden toegepast op andere cellulaire arena's, voor zowel in vitro als in vivo of ex vivo onderzoeken.

Het vermogen van deze methode om directe toegang tot de intracellulaire cytosol mogelijk te maken, hangt af van de spontane internalisering van de SiNW in de cellen. Hoewel SiNWs spontane internalisatie zal ondergaan in vele celtypen15, zullen sommige cellen, zoals cardiomyocyten en neuronen, de SiNWs moeten worden behandeld om hun internalisatie19mogelijk te maken. In dit protocol beschrijven we het internalisatieproces van p-i-n SiNWs met een diameter van 200-300 nm en ~1...

Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Dit protocol beschrijft het gebruik van silicium nanodraden voor intracellulaire optische bio-modulatie van cellen in een eenvoudige en eenvoudig uit te voeren methode. De techniek is zeer aanpasbaar aan diverse celtypes en kan zowel in vitro als in vivo toepassingen worden gebruikt.

Silicium nanodraden en optische stimulatie voor onderzoeken van intra- en intercellulaire elektrische koppeling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Deze techniek maakt intracellulaire bio-elektrische ondervraging met extreem hoge ruimtelijke resolutie en celspecificiteit met alleen standaard optische microscopie. Deze methode vergemakkelijkt stimulatie en elektrische ondervraging van cellen en specifieke locaties in de cellen en kan zowel in vitro als in 3D ex vivo weefselpreparaten worden uitgevoerd. Deze techniek maakt het mogelijk om veel cellulaire arena's zoals hart- of hersencellen te onderzoeken, evenals de elektrische communicatie tussen al onze niet-prikkelbare cellen.Om myofibroblasten te isoleren van een myofibroblast cardiomyocyte suspensie, pre-plate de geïsoleerde cellen op een 100 millimeter weefsel cultuur schotel voor een uur, als cardiomyocyten behoefte aan een vezel nek en behandeld oppervlak te hechten. Verzamel aan het einde van de incubatie de verrijkte cardiomyocyte met supernatant voor downstream co-cultuur. Spoel de myofibroblasten met DMEM om eventuele resterende cardiomyocyten te elimineren en voer de cellen met vers kweekmedium voor een extra twee tot vier dagen incubatie.Wanneer de cellen bereiken 80%-samenvloeiing, gebruik dan een diamant schrijver om een drie bij drie millimeter chip gesneden uit een wafer met chemische damp depositie gekweekte silicium nanodraden. En gebruik scherpe tangen om de chips in 70% ethanol te spoelen. Na het spoelen drogen, droog de chips gedurende 30 minuten onder ultraviolet licht in een bio-safety laminaire stroomkap, alvorens de chips over te brengen naar een steriele microcentrifuge buis.Gebruik een complete cel cultuur medium spoeling om de resterende ethanol te verwijderen, voordat sonicating de chips in een milliliter van verse cultuur medium in een sonicatie bad voor een tot 10 minuten. De supernatant moet troebel worden als de nanodraden worden vrijgegeven. Meng de Silicon nanowire suspensie in vijf milliliter vers kweekmedium en zaad de nanodraadoplossing op de schotel van myofibroblasten.Na vier uur in de celkweek incubator, spoel de schotel vijf keer met verse cultuur medium om alle ongeinternaliseerde nanodraden te verwijderen en blijven de cellen uitbroeden voor nog een uur om een gedeeltelijk geïnternaliseerde nanodraden volledig worden opgenomen. Voeg vervolgens 500 microliters vers bereide collageen coating oplossing aan een 35 millimeter glazen bodem schotel. Na een incubatie van een uur bij 37 graden Celsius spoel je de schotel af met steriele PBS en oogst je de Silicon nanowire myofibroblast hybriden, met drie milliliter trypsine, gedurende twee minuten bij 37 graden Celsius.Wanneer de cellen zijn losgemaakt, stop de reactie met 10 milliliter cultuurmedium, spoel krachtig door pipetteren en centrifugeer niet meer dan 200 G om beschadiging van de cellen te voorkomen. Dan opnieuw opschorten de hybride cel pellets in een milliliter van vers medium, en zaad van de cellen op de collageen gecoate glazen bodem schotel. Om de interneisatie van de nanodraad te verifiëren, labelt u de cellen met fluorescerende cytosol- en membraankleurstoffen, volgens standaardprotocollen, en gebruikt u een confocale microscoop om de cellen in beeld te brengen.Aangezien siliciumnanodraden zeer reflecterend zijn, kan gereflecteerd licht worden gebruikt in plaats van fluorescentie voor hun visualisatie. Voor het opzetten van een myofibroblast silicium nanowire hybride cardiomyocyte co-cultuur, zaad het juiste aantal van elk celtype op een collageen gecoate glazen bodem schotel. En kweek de cellen op 37 graden Celsius gedurende 48 uur, zodat de cellen intercellulaire kloofknooppunten kunnen vormen.Op de dag van het experiment, vervang de cultuur supernatant met een milliliter van cultuur medium aangevuld met vers bereide calcium gevoelige kleurstof, voor een 20 tot 30 minuten incubatie bij 37 graden Celsius. Aan het einde van de incubatie, was de plaat twee keer met steriele PBS, voordat u de cellen behandelt met een milliliter voorverwarmde fenolrode vrije DMEM. Laat vervolgens de intracellulaire calciumkleurstof gedurende 30 minuten ontsterificeren bij 37 graden Celsius, voordat u basislijnafbeeldingen verwerft.Voor optische beeldvorming en stimulatie verwarmt u een bevochtigde micro-incubator op een microscoop met een collimated laserlijn gekoppeld aan het lichtpad, voor calciumbeeldvorming en optische stimulatie tot 37 graden Celsius en een koolstofdioxidemengsel van 5% per bel. Wanneer de microscoop klaar is, plaats de myofibroblast hybride cardiomyocyte co-cultuur in de micro-incubator en visualiseer de nanodraden door heldere veldmicroscopie om een geschikte stimulatieplaats te lokaliseren. Wanneer een site is geïdentificeerd, herconfigureert u het lichtpad naar de fluorescentiemodus, met behoud van het stimulatiepunt op de vooraf gedefinieerde locatie van de nanodraad, en valideert u de optimale stimulatiekracht en pulslengte voor elk silicium nanodraadformaat en celtype.Verkrijg een opname van twee tot tien seconden van de intracellulaire calciumactiviteit bij aanvang, voordat u de nanodraad stimuleert met een enkele laserpuls van één tot 10 melowatts vermogen en een duur van één tot tien milliseconden, waarbij de resulterende calciumgolf nog twee tot 10 seconden wordt opgenomen. Aan het einde van het experiment brengen de opgenomen films van de optische stimulatie naar het juiste softwareprogramma, voor extra analyse. Met behulp van standaard fase contrast optica, samenvloeiing cellen zijn gemakkelijk te bekijken door licht microscopie.Silicium nanodraden, echter, zijn nauwelijks zichtbaar, waardoor hun locaties onmogelijk te definiëren door deze methode. Super opleggen van licht en donkere veld beelden, echter, maakt visualisatie van de Perry nucleaire regeling van het licht reflecterende silicium nanodraden. Confocale microscopie kan worden gebruikt om fluorescerende marker gekleurd cytosol en plasmamembranen te visualiseren, waardoor de intracellulaire locatie van de siliciumnanodraden duidelijker wordt.Met behulp van standaard microscopie kan een helder veldbeeld worden verkregen om de locatie van de te stimuleren siliciumnanodraad te identificeren. Een korte baseline video van de spontaan kloppende cardiomyocyten en de resten myofibroblasten kan dan worden verworven. Na stimulatie kan de calciumvermeerdering binnen de co-cultuur worden geregistreerd.Het tijdstip waarop de verschillende cellen opgewonden raken, kan worden bepaald door het punt waarop de verandering in de gemiddelde optische stroom zijn maximum bereikt. De optische stroom kan vervolgens worden berekend om te helpen bij de identificatie van het tijdstip van activering binnen elk celgebied. De intracellulaire snelheden kunnen voor elke cel worden bepaald met behulp van Khaimah-grafieken, waarbij de helling van de lijn de omgekeerde van de intracellulaire voortplantingssnelheid weergeeft.Hier kan bijvoorbeeld een samenvatting worden waargenomen van de verschillende inter- en intracellulaire snelheden gemeten voor de celinteracties binnen één co-cultuur. Deze methode kan worden gebruikt voor in vivo studies door het injecteren van de cel Silicium hybriden rechtstreeks in het weefsel en met behulp van 3D ex vivo preparaten om de in vivo elektrische bedrijf te bestuderen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Zacht Lithografische functionalisering en patroonvorming Oxide-vrij silicium en germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Bevestiging van biologische Probes aan Silica optische biosensoren gebruik van silaan agenten

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Techniek skeletspier weefsel van muizen myoblast progenitorcellen en toepassing van elektrische stimulatie

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro synthese van Native, Stapel Lange Afstand en Segmentale Lange Afstand Collageen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optische detectie van<em&gt; E. coli</em&gt; Bacteriën door Mesoporous Silicon biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Poreuze Silicon Micropartikels voor Levering van siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Computed Tomography en optische beeldvorming van Osteogenesis-angiogenese Koppeling te beoordelen Integratie van schedelbot Autografts en Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optische controle van levende cellen elektrische activiteit van geconjugeerde polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Bereiding van silicium Nanowire veldeffecttransistor voor chemische en biosensoren toepassingen

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Transmissie van meerdere signalen door middel van een optische vezel met behulp van Golffront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...