Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
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Diese Arbeit wird vom Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503) unterstützt.

Um die Einhaltung ethischer Standards zu gewährleisten, wurden alle tiertierischen Verfahren im Zusammenhang mit der Isolierung von Kardiomyozyten aus Nagetierherzen zuerst vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) der University of Chicago genehmigt. Darüber hinaus wurden alle Tierversuche in vollständiger Übereinstimmung mit Anleitung der University of Chicago IACUC durchgeführt.
1. Herstellung von Zell-SiNWs-Hybriden
<ol><li>Isolieren Sie primäre Kardiomyozyten (CMs) mit e...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

Wir haben hier eine einfache Möglichkeit zur intrazellulären elektrischen Stimulation von Zellen demonstriert. In dieser Demo haben wir MFs verwendet, die mit SiNWs vorhybridisiert und dann mit CMs kokultiviert wurden. Im Allgemeinen haben die meisten sich vermehrenden Zellen die Tendenz, SiNWs zu internalisieren, was die Verwendung dieser Methode mit vielen anderen Zelltypen ermöglicht. Darüber hinaus haben wir zwar die intrazelluläre Stimulation von Zellen demonstriert, aber die gleichen Prinzipien können verwend...

Alle biologischen Organismen nutzen Elektrizität in Form von Ionen, um das zelluläre Verhalten zu regulieren. Zellmembranen enthalten verschiedene Arten spezifischer Ionenkanäle, die den passiven und aktiven Transport von Ionen ermöglichen. Diese Ionen steuern die Funktionen von erregbaren Zellen, wie neuronale Aktivität und Skelett und Herzmuskelkontraktilität. Jedoch, Bioelektrizität spielt auch eine wichtige Rolle in nicht-erregbaren Zellen, die viele zelluläre Funktionen wie Zellproliferation1,Neuroimmunität2,3,4und Stammzelldifferenzierung5.
In den letzten Jahrzehnten hat der Bereich der Bioelektrizität ein wachsendes Interesse geweckt, was zur Entwicklung zahlreicher Technologien für bioelektronische Schnittstellen beigetragen hat. Mikroelektroden-Patchpipetten sind der Goldstandard der intrazellulären Aufzeichnung und Stimulation6. Bei dieser Methode wird eine Glaspipette unter bestimmten Bedingungen gezogen, um eine scharfe Kante mit einer Porengröße von wenigen Mikrometern zu bilden. Diese Pipette ist mit einem Puffer gefüllt und die Pipette ermöglicht den direkten Kontakt des Puffers mit dem intrazellulären Volumen. Daraus ergibt sich eine bioelektrische Schnittstelle, die extrem hohe Signal-Rausch-Verhältnisse, eine präzise Steuerung der zellulären elektrischen Aktivität und eine extrem hohe zeitliche Auflösung liefert. Obwohl diese Methode ein extrem leistungsfähiges Werkzeug ist, das vor kurzem auf eine Nanopipettenkonfiguration7herunterskaliert wurde, ist es mit mehreren wichtigen technischen Einschränkungen verbunden. Der Zytosolverdünnungseffekt8sowie mechanische Vibrationen beschränkt seinen Nutzen auf kurzfristige Verhöre und erfordert teure Spezialausrüstung und ein hohes Maß an technischem Geschick. Darüber hinaus begrenzt seine Sperrigkeit die Anzahl der Zellen, die gleichzeitig aufgezeichnet oder stimuliert werden können, und aufgrund seiner Invasivität kann es während eines Experiments nicht neu konfiguriert werden. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden Mikroelektroden-Arrays entwickelt, aber die Größe der Elektroden begrenzt die räumliche Auflösung sowie den intrazellulären Zugang. Nanoelektroden-Arrays ermöglichen intrazelluläre Aufzeichnung und Stimulation, erfordern aber eine abrasive Elektroporation, um auf das Zytosol9,10zugreifen zu können. Darüber hinaus sind alle diese Methoden substratgebunden und daher auf In-vitro-Zellkulturen oder auf externe oberflächliche Zellen beschränkt, ohne Zugang zu Zellen, die sich in einem dreidimensionalen (3D) Gewebe befinden.
Optogenetik11 ist weit verbreitet, um diese 3D- und In-vivo-Beschränkungen zu beheben. Optogenetische Methoden basieren jedoch auf den Störungen von lichtaktivierten Plasmamembran-Ionenkanälen, die an der Plasmamembran verteilt werden, wodurch die räumliche 3D-Auflösung12 und intrazelluläre Fähigkeiten begrenzt werden.
Wir haben vor kurzem gezeigt, dass Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verwendet werden können, um intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit submikronräumlicher Auflösung mit verschiedenen nicht erregbaren Zellen durchzuführen, nämlich Herzmyofibroblasten und Oligodendrozyten13. Darüber hinaus verwendeten wir diese SiNWs, um ex-vivo zellspezifische Verhöre innerhalb eines 3D-Herzgewebes durchzuführen, um zu untersuchen, wie Herzzellen in vivo14elektrisch koppeln. Ein großer Vorteil dieser Methode ist ihre Einfachheit; es erfordert keine genetische Veränderung oder sperrige Instrumentierung. Viele Zellen verinnerlichen spontan fotoresponsive SiNWs ohne Beschallung oder Elektroporation15. Darüber hinaus entfliehen sie spontan der endosomalen Verkapselung und bilden eine nahtlose Integration mit den Zytosolen und intrazellulären Organellen13,15. Diese Zell-SiNWs-Verbundwerkstoffe, sogenannte Zell-Silizium-Hybride, besitzen die dynamische, weiche und vielseitige Natur der ursprünglichen Zelle sowie die optoelektrischen Fähigkeiten der SiNWs. Nach der Hybridisierung kann der Zell-SiNW-Hybrid mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und für verschiedene Anwendungen wie intrazelluläre bioelektrische Stimulation verwendet werden; Untersuchung der interzellulären bioelektrischen Kopplung in vitro; und für in vivo zellspezifische Verhöre. Da eine effektive Stimulation eine Kolokalisierung von hohen optischen Leistungsdichten und SiNWs erfordert, kann man sowohl in 2D als auch in 3D eine hohe räumliche Auflösung erzielen. In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert die Methodik sowie wie die Ergebnisse analysiert werden können. Der Schwerpunkt liegt auf der intra- und interzellulären Untersuchung in vitro, aber die in vivo Umsetzung dieser Methode kann direkt für viele andere biologische Szenarien genutzt werden.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Myofibroblasten können spontan Silizium-Nanodrähte (SiNWs) verinnerlichen und sind damit ein attraktives Ziel für bioelektronische Anwendungen. Diese Zell-Silizium-Hybride bieten bleifreie optische Modulationsfunktionen mit minimaler Störung des normalen Zellverhaltens. Die optischen Fähigkeiten werden durch die photothermischen und photoelektrischen Eigenschaften von SiNWs ermittelt. Diese Hybriden können mit Standard-Gewebekulturtechniken geerntet und dann auf verschiedene biologische Szenarien angewendet werden. Wir zeigen hier, wie diese Hybriden verwendet werden können, um die elektrische Kopplung von Herzzellen zu untersuchen und zu vergleichen, wie Myofibroblasten miteinander oder mit Kardiomyozyten verzahnt werden. Dieser Prozess kann ohne spezielle Ausrüstung jenseits eines Fluoreszenzmikroskops mit gekoppelter Laserlinie durchgeführt werden. Gezeigt wird auch die Verwendung einer maßgeschneiderten MATLAB-Routine, die die Quantifizierung der Kalziumvermehrung innerhalb und zwischen den verschiedenen Zellen in der Kultur ermöglicht. Myofibroblasten haben nachweislich eine langsamere elektrische Reaktion als Kardiomyozyten. Darüber hinaus zeigt die myofibroblast-interzelluläre Ausbreitung etwas langsamere, wenn auch vergleichbare Geschwindigkeiten mit ihren intrazellulären Geschwindigkeiten, was auf eine passive Ausbreitung durch Spaltknoten oder Nanoröhren hindeutet. Diese Technik ist sehr anpassungsfähig und kann leicht auf andere zelluläre Arenen angewendet werden, sowohl für In-vitro-, als auch in vivo- oder ex vivo-Untersuchungen.

Die Fähigkeit dieser Methode, einen direkten Zugang zum intrazellulären Zytosol zu ermöglichen, hängt von der spontanen Internalisierung des SiNW in die Zellen ab. Obwohl SiNWs einer spontanen Internalisierung in viele Zelltypen15unterzogen werden, werden einige Zellen, wie Kardiomyozyten und Neuronen, die SiNWs benötigen, um ihre Internalisierung zu ermöglichen19. In diesem Protokoll beschreiben wir den Internalisierungsprozess von p-i-n SiNWs mit 200-300 nm Durchmes...

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Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Dieses Protokoll beschreibt die Verwendung von Silizium-Nanodrähten für die intrazelluläre optische Biomodulation von Zellen in einer einfachen und einfach durchzuführenden Methode. Die Technik ist sehr anpassungsfähig an verschiedene Zelltypen und kann sowohl für In-vitro- als auch für In-vivo-Anwendungen eingesetzt werden.

Silizium-Nanodrähte und optische Stimulation für Untersuchungen der intra- und interzellulären elektrischen Kopplung

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Diese Technik ermöglicht intrazelluläre bioelektrische Verhöre mit extrem hoher räumlicher Auflösung und Zellspezifität nur mit standardoptischer Mikroskopie. Diese Methode erleichtert die Stimulation und elektrische Abfrage von Zellen und bestimmten Positionen innerhalb der Zellen und kann sowohl in vitro als auch in 3D-Ex-vivo-Gewebepräparaten durchgeführt werden. Diese Technik ermöglicht die bioelektronische Untersuchung vieler zellulärer Arenen wie Herz- oder Gehirnzellen sowie die elektrische Kommunikation zwischen all unseren nicht erregbaren Zellen.Um Myofibroblasten von einer Myofibroblasten-Kardiomyozytensuspension zu isolieren, verfestigen Sie die isolierten Zellen für eine Stunde auf eine 100-Millimeter-Gewebekulturschale, da Kardiomyozyten eine fasergebundene und behandelte Oberfläche benötigen, um haften zu können. Am Ende der Inkubation, sammeln Sie die angereicherte Kardiomyozyten mit Überstand für nachgeschaltete Co-Kultur. Spülen Sie die Myofibroblasten mit DMEM, um alle verbleibenden Kardiomyozyten zu beseitigen und die Zellen mit frischem Kulturmedium zu füttern, bevor weitere zwei bis vier Tage inkubiert werden.Wenn die Zellen 80 % Konfluenz erreichen, verwenden Sie einen Diamantschreiber, um einen drei mal drei Millimeter großen Chip aus einem Wafer mit chemischen Dampfabscheidungs-Silizium-Nanodrähten zu schneiden. Und verwenden Sie scharfe Zangen, um die Chips in 70% Ethanol zu spülen. Nach dem Spülen die Chips 30 Minuten unter ultraviolettem Licht in einer biosicherheitslaminiaren Durchflusshaube lufttrocknen, bevor die Chips in ein steriles Mikrozentrifugenrohr übertragen werden.Verwenden Sie ein komplettes Zellkulturmedium Spülen, um alle verbleibenden Ethanol zu entfernen, bevor Sie die Chips in einem Milliliter frischem Kulturmedium in einem Beschallungsbad für ein bis 10 Minuten beschallen. Der Überstand sollte trüb werden, wenn die Nanodrähte freigesetzt werden. Mischen Sie die Silizium-Nanodrahtsuspension in fünf Milliliter frisches Kulturmedium und säen Sie die Nanodrahtlösung auf die Schale von Myofibroblasten.Nach vier Stunden im Zellkultur-Inkubator spülen Sie das Gericht fünfmal mit frischem Kulturmedium ab, um nicht internalisierte Nanodrähte zu entfernen und die Zellen für eine weitere Stunde zu bebrüten, damit alle teilweise verinnerlichten Nanodrähte vollständig integriert werden können. Als nächstes 500 Mikroliter frisch zubereitete Kollagenbeschichtungslösung zu einer 35 Millimeter Glasbodenschale hinzufügen. Nach einer einstündigen Inkubation bei 37 Grad Celsius spülen Sie die Schale mit sterilem PBS ab und ernten sie die Silizium-Nanodraht-Myofibroblast-Hybriden mit drei Milliliter Trypsin zwei Minuten bei 37 Grad Celsius.Wenn sich die Zellen gelöst haben, stoppen Sie die Reaktion mit 10 Milliliter Kulturmedium, spülen Sie kräftig durch Pipettieren und zentrieren Sie nicht über 200 G, um eine Beschädigung der Zellen zu vermeiden. Dann die Hybridzellpellets in einem Milliliter frischem Medium wieder aufhängen und die Zellen auf der kollagenbeschichteten Glasbodenschale säen. Um die Verinnerlichung des Nanodrahtes zu überprüfen, beschriften Sie die Zellen gemäß den Standardprotokollen mit fluoreszierendem Zytosol und Membranfarbstoffen, und verwenden Sie ein konfokales Mikroskop, um die Zellen abzubilden.Da Silizium-Nanodrähte stark reflektierend sind, kann reflektiertes Licht anstelle von Fluoreszenz für ihre Visualisierung verwendet werden. Um eine Myofibroblast-Silizium-Nanodraht-Hybrid-Kardiomyozyten-Kokultur einzurichten, säen Sie die entsprechende Anzahl jedes Zelltyps auf eine kollagenbeschichtete Glasbodenschale. Und kulturieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für 48 Stunden, damit die Zellen interzelluläre Spaltverbindungen bilden können.Ersetzen Sie am Tag des Experiments den Kulturüberstand durch einen Milliliter Kulturmedium, ergänzt durch frisch zubereiteten kalziumempfindlichen Farbstoff, für eine 20-30-minütige Inkubation bei 37 Grad Celsius. Am Ende der Inkubation die Platte zweimal mit sterilem PBS waschen, bevor Sie die Zellen mit einem Milliliter vorgewärmtem phenolrot-freiem DMEM behandeln. Dann lassen Sie den intrazellulären Kalziumfarbstoff 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius entestert werden, bevor sie Grundbilder aufnehmen.Vor der optischen Bildgebung und Stimulation einen befeuchteten Mikro-Inkubator auf einem Mikroskop mit einer kollimierten Laserlinie, die in den Lichtpfad gekoppelt ist, für die Kalzium-Bildgebung und optische Stimulation auf 37 Grad Celsius und ein 5%Blasen-Ära-Kohlendioxidgemisch vorheizen. Wenn das Mikroskop bereit ist, legen Sie die Myofibroblast-Hybrid-Kardiomyozyten-Kokultur in den Mikro-Inkubator und visualisieren Sie die Nanodrähte durch Hellfeldmikroskopie, um eine geeignete Stimulationsstelle zu lokalisieren. Wenn ein Standort identifiziert wurde, konfigurieren Sie den Lichtpfad in den Fluoreszenzmodus um, wobei Sie den Stimulationspunkt an der vordefinierten Position des Nanodrahtes beibehalten und die optimale Stimulationsleistung und Pulslänge für jede Silizium-Nanodrahtgröße und jeden Zelltyp validieren.Erwerben Sie eine zwei- bis zehnsekunden lange Aufzeichnung der intrazellulären Ausgangsaktivität, bevor Sie den Nanodraht mit einem einzigen Laserpuls von einem bis zehn Melowatt Leistung und einer Dauer von ein bis zehn Millisekunden stimulieren und die resultierende Kalziumwelle für weitere zwei bis zehn Sekunden aufzeichnen. Übertragen Sie am Ende des Experiments die aufgenommenen Filme der optischen Stimulation zur zusätzlichen Analyse an das entsprechende Softwareprogramm. Mit Standardphasenkontrastoptiken lassen sich Konfluenzzellen durch Lichtmikroskopie leicht betrachten.Silizium-Nanodrähte sind jedoch kaum sichtbar, so dass ihre Standorte mit dieser Methode nicht definiert werden können. Die Überlagerung von Licht- und Dunkelfeldbildern ermöglicht jedoch die Visualisierung der Kernanordnung der lichtreflektierenden Silizium-Nanodrähte. Die konfokale Mikroskopie kann verwendet werden, um fluoreszierende Marker-gefärbte Zytosol- und Plasmamembranen zu visualisieren, wodurch die intrazelluläre Position der Silizium-Nanodrähte deutlicher wird.Mit Hilfe der Standardmikroskopie kann ein helles Feldbild erhalten werden, um die Position des zu stimulierenden Silizium-Nanodrahtes zu identifizieren. Ein kurzes Basisvideo der spontan schlagenden Kardiomyozyten und der ruhenden Myofibroblasten kann dann erworben werden. Nach der Stimulation kann die Kalziumausbreitung innerhalb der Kokultur aufgezeichnet werden.Die Zeit, zu der die verschiedenen Zellen angeregt werden, kann durch den Punkt bestimmt werden, an dem die Veränderung des durchschnittlichen optischen Flusses ihr Maximum erreicht. Der optische Fluss kann dann berechnet werden, um bei der Identifizierung des Zeitpunkts der Aktivierung innerhalb jeder Zellregion zu helfen. Die intrazellulären Geschwindigkeiten können für jede Zelle mit Khaimah-Graphen bestimmt werden, wobei die Steigung der Linie die Umkehrung der intrazellulären Ausbreitungsgeschwindigkeit darstellt.Hier kann beispielsweise eine Zusammenfassung der verschiedenen inter- und intrazellulären Geschwindigkeiten beobachtet werden, die für die Zellinteraktionen innerhalb einer einzelnen Kokultur gemessen wurden. Diese Methode kann für In-vivo-Studien verwendet werden, indem die Zell-Silizium-Hybride direkt in das Gewebe injiziert werden und 3D-Ex-vivo-Präparate verwendet werden, um das in vivo elektrische Unternehmen zu untersuchen.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Soft-Lithographie Funktionalisierung und Strukturierung Oxydfreie Silizium und Germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Forschung

Biotechnik

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Anbringen biologischen Sonden zur Silica Optische Biosensoren Mit Silane Coupling Agents

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering Skeletal Muscle Gewebe von Murine Myoblast Progenitor Cells und Anwendung von Elektrostimulation

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

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In vitro Synthese von Native, Fibröse Lange Abstände und Segmentberichterstattung Lange Spacing Collagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

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Optische Detektion von<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterien durch Mesoporous Silicon Biosensoren

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

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Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

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A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optische Kontrolle von lebenden Zellen elektrische Aktivität von konjugierten Polymeren

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

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Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Die Übertragung von mehreren Signalen über eine optische Faser Mit Wavefront-Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...