Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

עבודה זו נתמכת על ידי משרד המחקר המדעי של חיל האוויר (AFOSR FA9550-18-1-0503).

כדי להבטיח עמידה בסטנדרטים אתיים, כל ההליכים בבעלי חיים הקשורים לבידוד קרדיומיוציטים מלבבות מכרסמים אושרו לראשונה על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים מוסדיים של אוניברסיטת שיקגו (IACUC). בנוסף, כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות מאוניברסיטת שיקגו IACUC.
1. הכנת תאים-SiNWs היברי?...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

הראינו כאן דרך פשוטה לבצע גירוי חשמלי תאי של תאים. בהדגמה זו, השתמשנו ב-MFs שהיו מותאמים מראש עם SiNWs, ואז שיתוף פעולה עם CMs. באופן כללי, רוב התאים המתרבים יש נטייה להפנים SiNWs, המאפשר את השימוש מתודולוגיה זו עם סוגי תאים רבים אחרים. יתר על כן, בעוד הראינו את הגירוי תאי של תאים, אותם עקרונות יכולים ל...

כל האורגניזמים הביולוגיים משתמשים בחשמל, בצורה של יונים, כדי לווסת את ההתנהגות התאית. קרום התא מכיל סוגים שונים של ערוצי יונים ספציפיים המאפשרים הובלה פסיבית ופעילה של יונים. יונים אלה שולטים בפונקציות של תאים מרגשים, כגון פעילות עצבית והתכווצות שריר השלד והלבי. עם זאת, ביו-אלקטריות ממלאת תפקיד חשוב גם בתאים שאינם מרגשים, השולטת בפונקציות תאיות רבותכגון התפשטותתאים 1 ,חסינות עצבית 2,3,4,ובידול תאי גזע5.
בעשורים האחרונים, תחום הביו-אלקטריות משך רמה הולכת וגוברת של עניין, אשר תרמה לפיתוח טכנולוגיות רבות עבור ממשקים ביו-אלקטרוניים. פיפטות תיקון Microelectrode הם תקן הזהב של הקלטה תאית וגירוי6. ב מתודולוגיה זו, פיפטה זכוכית נמשך בתנאים ספציפיים כדי ליצור קצה חד עם גודל נקבובית של מיקרון מעט. פיפטה זו מלאה במאגר והפיפטה מאפשרת מגע ישיר של המאגר עם אמצעי האחסון התוך תאי. התוצאה היא ממשק ביו-חשמלי המניב יחסי איתות גבוהים באופן קיצוני לרעש, שליטה מדויקת בפעילות החשמלית הסלולרית ורזולוציית זמן גבוהה באופן קיצוני. למרות מתודולוגיה זו היא כלי רב עוצמה מאוד, אשר לאחרונה הוקטן לתצורת ננו-pipette7, הוא משויך מספר מגבלות טכניות חשובות. אפקט דילול ציטוסול8, כמו גם תנודות מכניות, מגביל את השירות שלה לחקירות קצרות טווח, והוא דורש ציוד מיוחד יקר ורמת מיומנות טכנית גבוהה. יתר על כן, bulkiness שלה מגביל את מספר התאים שניתן להקליט או מגורה בו זמנית, ו בשל פולשניותו, זה לא ניתן להגדיר מחדש לאורך כל ניסוי. כדי להתגבר על מגבלות אלה פותחו מערכי מיקרו-אלקטרודה, אך גודל האלקטרודות מגביל את הרזולוציה המרחבית, כמו גם את הגישה התוך תאית. מערכי Nanoelectrode מאפשרים הקלטה וגירוי תאיים, אך דורשים אלקטרואידיות שוחקת כדי לגשת לציטוסול9,10. בנוסף, כל המתודולוגיות הללו מאוגדים בתחום המיצות ולכן מוגבלות לתרביות תאים במבחנה, או לתאים שטחיים חיצוניים, ללא גישה לתאים שבתוך רקמה תלת-ממדית (תלת-ממדית).
Optogenetics11 משמש נרחב כדי לטפל אלה 3D ובמגבלות vivo. עם זאת, שיטות optogenetic מבוססות על הסטיות של ערוצים יון פלזמה המופעלים באור המופצים על קרום פלזמה, הגבלת הרזולוציה המרחבית 3D12 ויכולות תאיות.
לאחרונה הראנו כי nanowires סיליקון (SiNWs) יכול לשמש לביצוע חקירה ביו-אלקטרית תאית עם רזולוציה מרחבית submicron עם תאים שונים שאינם מרגשים, כלים כלשהם מיופיברובלסטים לב ואוליגודנדרוציטים13. יתר על כן, השתמשנו אלה SiNWs לבצע לשעבר vivo תא חקירה ספציפית בתוך רקמת לב 3D, כדי לחקור כיצד תאי לב זוג חשמלי vivo14. יתרון מרכזי של מתודולוגיה זו הוא הפשטות שלה; זה לא דורש כל שינוי גנטי או מכשור מגושם. תאים רבים באופן ספונטני להפנים SiNWs צילום מגיב ללא צורך sonication או אלקטרואידציה15. בנוסף, הם ימלטו באופן ספונטני מהאנקוסום הא אנדו-אומלי ויתגבשו אינטגרציה חלקה עם האיברים התוךתאיים 13,15. אלה cell-SiNWs מרוכבים, בשם תאים-סיליקון היברידיים, בעל אופי דינמי, רך ורב-תכליתי של התא המקורי, כמו גם את היכולות האופטואלקטריות של SiNWs. לאחר הכלאה, ניתן לקצור את התא-SiNW היברידית באמצעות טכניקות סטנדרטיות של תרבות רקמות ולהשתמש בהן עבור יישומים שונים כגון גירוי ביו-חשמלי תאי; לימוד צימוד ביו-אלקטרי בין-תאי במבחנה; ועל חקירה ספציפית של תא Vivo. מכיוון שגירוי יעיל דורש התאמה אישית של צפיפויות הספק אופטי גבוהות ו-SiNWs, ניתן להשיג רזולוציה מרחבית גבוהה הן ב-2D והן בתלת-מיד. בפרוטוקול זה אנו מתארים בפירוט את המתודולוגיה, כמו גם את האופן שבו ניתן לנתח את התוצאות. ההתמקדות מונחת על החקירה הבין-תאית והבין-תאית במבחנה, אך ניתן לנצל את יישום vivo של מתודולוגיה זו באופן ישיר עבור תרחישים ביולוגיים רבים אחרים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Myofibroblasts יכול באופן ספונטני להפנים nanowires סיליקון (SiNWs), מה שהופך אותם יעד אטרקטיבי עבור יישומים ביו-אלקטרוניים. כלאיים אלה של תאים-סיליקון מציעים יכולות אפנון אופטי ללא עופרת עם סטיה מינימלית להתנהגות תאים רגילה. היכולות האופטיות מתקבלות על ידי המאפיינים הפוטותרמיים והפוטואלקטריים של SiNWs. בני כלאיים אלה ניתן לקצור באמצעות טכניקות תרבות רקמות סטנדרטיות ולאחר מכן להחיל על תרחישים ביולוגיים שונים. אנו מדגימים כאן כיצד בני-כלאיים אלה יכולים לשמש כדי ללמוד את הזיווג החשמלי של תאי לב ולהשוות כיצד myofibroblasts זוג אחד לשני או cardiomyocytes. תהליך זה יכול להתבצע ללא ציוד מיוחד מעבר למיקרוסקופ פלורסנט עם קו לייזר בשילוב. כמו כן מוצג השימוש של שגרת MATLAB בהתאמה אישית המאפשרת כימות של הפצת סידן בתוך ובין התאים השונים בתרבות. Myofibroblasts מוצגים יש תגובה חשמלית איטית יותר מזה של cardiomyocytes. יתר על כן, ההתפשטות הבין-תאית myofibroblast מראה מעט איטי יותר, אם כי מהירויות דומות למהירות תאית שלהם, מציע התפשטות פסיבית דרך צמתים פער או צינורות. טכניקה זו היא הסתגלות גבוהה, ניתן להחיל בקלות על זירות סלולריות אחרות, עבור במבחנה, כמו גם בחקירות vivo או לשעבר vivo.

היכולת של מתודולוגיה זו לאפשר גישה ישירה ציטוסול תאי תלוי ההפנימה הספונטנית של SiNW לתאים. למרות SiNWs יעבור ההפניה ספונטנית לסוגי תאיםרבים 15, תאים מסוימים, כגון cardiomyocytes ונוירונים, יצטרכו את SiNWs כדי לאפשר ההפנימהשלהם 19. בפרוטוקול זה אנו מתארים את תהליך ההפניה של p-i-n SiNW...

Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

פרוטוקול זה מתאר את השימוש nanowires סיליקון עבור ביו-אפנון אופטי תאי של תא בשיטה פשוטה וקלה לביצוע. הטכניקה ניתנת להתאמה גבוהה לסוגי תאים מגוונים ותוכל לשמש במבחנה, כמו גם ביישומים vivo.

ננו-חוטי סיליקון וגירוי אופטי לחקירות של צימוד חשמלי פנים-תאי

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

טכניקה זו מאפשרת חקירה ביו-אלקטרונית תאית עם רזולוציה מרחבית גבוהה מאוד וספציפיות תאים באמצעות מיקרוסקופיה אופטית סטנדרטית בלבד. שיטה זו מקלה על גירוי וחקירה חשמלית של תאים ומיקומים ספציפיים בתוך התאים והוא יכול להתבצע במבחנה, כמו גם בתכשירי רקמת 3D ex vivo. טכניקה זו מאפשרת חקירה ביו-אלקטרונית של זירות תאיות רבות כגון תאי לב או מוח, כמו גם את התקשורת החשמלית בין כל התאים הבלתי נרגשים שלנו.כדי לבודד myofibroblasts מן ההשעיה cardiomyocyte myofibroblast, מראש צלחת התאים המבודדים על צלחת 100 מילימטר רקמות תרבות במשך שעה אחת, כמו cardiomyocytes צריך משטח צוואר סיבים ומטופלים לדבוק. בסוף הדגירה, לאסוף את cardiomyocyte מועשר המכיל על טבעי עבור תרבות שותף במורד הזרם. לשטוף את myofibroblasts עם DMEM כדי לחסל את כל cardiomyocytes הנותרים להאכיל את התאים עם מדיום תרבות טרי לפני יומיים עד ארבעה ימים נוספים של דגירה.כאשר התאים מגיעים ל-80%, השתמשו בסופר יהלומים כדי לחתוך שבב של שלושה על שלושה מילימטרים מוופל עם ננו-חוטי סיליקון כימיים הגדלים על ידי אדי אדים. ולהשתמש במדפים חדים כדי לשטוף את השבבים באתנול 70%. לאחר שטיפה, מייבשים את השבבים למשך 30 דקות תחת אור אולטרה סגול במכסה המנוע של זרימה למינארית עם בטיחות ביולוגית, לפני העברת השבבים לצינור מיקרו צנטריפוגה סטרילי.השתמש שטיפת בינונית של תאים כדי להסיר כל אתנול שנותר, לפני sonicating את השבבים במיליליטר אחד של מדיום תרבות טרי באמבט sonication במשך 1 עד 10 דקות. העל-טבעי אמור להפוך מעונן כאשר חוטי הננו משוחררים. מערבבים את ההשעיה nanowire סיליקון לתוך חמישה מיליליטר של מדיום תרבות טריים זרעים פתרון חוט ננו על המנה של myofibroblasts.לאחר ארבע שעות באינקובטור תרבות התא, לשטוף את המנה חמש פעמים עם מדיום תרבות טריים כדי להסיר את כל nanowires uninternalized ולהמשיך להחגירה את התאים במשך שעה נוספת כדי לאפשר כל nanowires הפנימו חלקית להיות משולב לחלוטין. לאחר מכן הוסיפו 500 מיקרוליטר של תוסף קולגן טרי לצלחת תחתונה מזכוכית 35 מ"מ. לאחר דגירה של שעה אחת ב 37 מעלות צלזיוס, לשטוף את המנה עם PBS סטרילי לקצור את היברידיות myofibroblast nanowire סיליקון, עם שלושה מיליליטר של טריפסין, במשך שתי דקות ב 37 מעלות צלזיוס.כאשר התאים התנתקו, לעצור את התגובה עם 10 מיליליטר של מדיום תרבות, לשטוף במרץ על ידי צינורות ולא צנטריפוגה מעל 200 G, כדי למנוע פגיעה בתאים. לאחר מכן להשעות מחדש את כדורי התא ההיברידי במיליליטר אחד של מדיום טרי, ולזרע את התאים על צלחת תחתית זכוכית מצופה קולגן. כדי לאמת את הפנמת חוט הננו, סמן את התאים עם ציטוסול פלואורסצנטי וצבעי קרום, על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ולהשתמש במיקרוסקופ קונפוקל כדי לדמיין את התאים.כמו nanowires סיליקון הם רפלקטיביים מאוד, אור משתקף יכול לשמש במקום פלואורסצנטיות עבור הדמיה שלהם. כדי להקים סיליקון myofibroblast nanowire היברידית תרבות cardiomyocyte, זרע את המספר המתאים של כל סוג תא על צלחת זכוכית מצופה קולגן התחתון. ולתרבת את התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, כדי לאפשר לתאים ליצור צמתים פער בין תאיים.ביום הניסוי, החלף את התרבות supernatant עם מיליליטר אחד של תרבות בינוני בתוספת צבע טרי סידן רגיש, עבור דגירה 20 עד 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה, לשטוף את הצלחת פעמיים עם PBS סטרילי, לפני הטיפול בתאים עם מיליליטר אחד של פנול מחומם מראש אדום חינם DMEM. לאחר מכן אפשרו לצבע הסידן התאי לעבור דה-אסטריפיפיקציה למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס, לפני רכישת תמונות בסיסיות.לפני הדמיה אופטית וגירוי, מחממים מראש מיקרו אינקובטור לח על מיקרוסקופ עם קו לייזר נאסף יחד לתוך נתיב האור, עבור הדמיה סידן וגירוי אופטי ל 37 מעלות צלזיוס ו 5% עידן בועה פחמן דו חמצני תערובת. כאשר המיקרוסקופ מוכן, מניחים את תרבות הלב-ריאה ההיברידית myofibroblast לתוך החממה מיקרו לדמיין את nanowires על ידי מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לאתר אתר גירוי מתאים. כאשר אתר זוהה, להגדיר מחדש את נתיב האור למצב פלואורסצנטי, תוך שמירה על נקודת הגירוי במיקום מוגדר מראש של חוט ננו, ולאמת את כוח הגירוי האופטימלי ואת אורך הדופק, עבור כל גודל nanowire סיליקון וסוג התא.לרכוש הקלטה של שתיים עד עשר שניות של פעילות הסידן תאית הבסיסית, לפני גירוי חוט הננו עם פולס לייזר אחד של אחד עד 10 melowatts של כוח ומשך של 1 עד 10 אלפיות שנייה, הקלטת גל הסידן וכתוצאה מכך עוד שתיים עד 10 שניות. בסוף הניסוי להעביר את הסרטים המוקלטים של הגירוי האופטי לתוכנה המתאימה, לניתוח נוסף. באמצעות אופטיקת ניגודיות פאזה סטנדרטית, תאים confluence נצפו בקלות על ידי מיקרוסקופ אור.Nanowires סיליקון, לעומת זאת, הם בקושי גלויים, מה שהופך את מיקומם בלתי אפשרי להגדיר על ידי שיטה זו. הטלת סופר של תמונות שדה בהירות וכהות, לעומת זאת, מאפשרת הדמיה של הסידור הגרעיני של פרי של nanowires סיליקון מחזיר אור. מיקרוסקופ קונפוקלי יכול לשמש כדי לדמיין סמן פלואורסצנטי ציטוזול מוכתם קרום פלזמה, מה שהופך את המיקום תאי של nanowires סיליקון ברור יותר.באמצעות מיקרוסקופיה סטנדרטית, ניתן להשיג תמונת שדה בהיר כדי לזהות את המיקום של nanowire סיליקון להיות מגורה. לאחר מכן ניתן לרכוש סרטון בסיסי קצר של הקרדיומיוציטים המכים באופן ספונטני ואת מיופיברובלסטים המנוחים. לאחר הגירוי, ניתן לתעד את התפשטות הסידן בתוך התרבות הקובית.הזמן שבו התאים השונים מתרגשים יכול להיקבע על ידי הנקודה שבה השינוי בזרימה האופטית הממוצעת מגיע למקסימום. לאחר מכן ניתן לחשב את הזרימה האופטית כדי לסייע בזיהוי זמן ההפעלה בתוך כל אזור תא. ניתן לקבוע את המהירויות התאיות עבור כל תא באמצעות גרפי ח'ימה, כאשר שיפוע הקו מייצג את ההופכי של מהירות ההפצה התאית.לדוגמה, כאן, ניתן לראות סיכום של המהירויות הבין-תאיות והמעקביות השונות הנמדדות עבור אינטראקציות התאים בתוך תרבות-משנה אחת. שיטה זו יכולה להיות מנוצלת למחקרים in vivo על ידי הזרקת התא סיליקון היברידיות ישירות לתוך הרקמה באמצעות 3D אקס ויוו ההכנות ללמוד את חברת החשמל in vivo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Functionalization לליתוגרפיות רך אוקסיד ללא דפוסים סיליקון גרמניום

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

הוספת בדיקות ביולוגיות Biosensors סיליקה אופטי באמצעות סוכני צימוד silane

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

רקמות שריר שלד הנדסה מתאי Murine היצמדות מולידו ויישום של גירוי חשמלי

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

בסינתזת מבחנה של ריווח ילידים, סיבי קולגן וארך ריווח המגזרי

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

זיהוי אופטי של<em&gt; א coli</em&gt; חיידקים על ידי Biosensors הסיליקון Mesoporous

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

הנקבובי הסיליקון microparticles למשלוח Therapeutics siRNA

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

טומוגרפיה ממוחשבת והדמיה אופטית של צימוד Osteogenesis-אנגיוגנזה להערכת שילוב של Autografts עצם הגולגולת וAllografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

שליטה אופטית של תאי חיים פעילות חשמלית על ידי פולימרים מצומדות

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

הכנת טרנזיסטור הסיליקון Nanowire שדה ותוצאה עבור יישומים כימיים biosensing

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

העברת אותות מרובים דרך סיב אופטי באמצעות Wavefront לעיצוב

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...