Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
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이 작품은 과학 연구의 공군 사무실에 의해 지원됩니다 (AFOSR FA9550-18-1-0503).

윤리 기준을 준수하기 위해 설치류 심장에서 심근세포 를 분리하는 것과 관련된 모든 동물 절차는 시카고 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 의해 처음 승인되었습니다. 또한, 모든 동물 실험은 시카고 IACUC 대학의 지침에 따라 완전히 수행되었습니다.
1. 셀-SiNWs 하이브리드의 준비
<ol><li>제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 1차 심근세포(CM)를 분리합니다.</l...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

우리는 여기에서 세포의 세포내 전기 자극을 수행하는 간단한 방법을 시연했습니다. 이 데모에서는 SiNWs와 사전 혼성화된 MF를 사용한 다음 CM과 공동 배양했습니다. 일반적으로, 대부분의 증식 세포는 SiNWs를 내면화하는 경향이 있습니다, 이는 많은 다른 세포 모형을 가진 이 방법론의 사용을 허용합니다. 더욱이, 우리는 세포의 세포 내 자극을 입증하는 동안, 동일한 원리는 세포의 세포 외 자극을...

모든 생물학적 유기체는 이온의 형태로 전기를 사용하여 세포 행동을 조절합니다. 세포막에는 이온의 수동적이고 능동적인 운반을 허용하는 다양한 유형의 특정 이온 채널을 함유하고 있습니다. 이 이온은 흥분하는 세포의 기능을 지배, 신경 활동 및 골격 및 심장 근육 수축 등. 그러나, 바이오전기는 또한 세포증식1,신경면역2,3,4,줄기세포 분화5와같은 많은 세포 기능을 지배하는 비흥분성 세포에서 중요한 역할을 한다.
최근 수십 년 동안 바이오 전기 분야는 점점 더 높은 관심을 불러 왔으며, 이는 바이오 전자 인터페이스를 위한 수많은 기술 개발에 기여했습니다. 마이크로 전극 패치 파이펫은 세포 내 기록 및 자극6의금 본위제이다. 이 방법론에서는 특정 조건에서 유리 파이펫을 당겨 공공 크기가 거의 없는 날카로운 모서리를 형성합니다. 이 파이펫은 버퍼로 채워지며 파이펫을 사용하면 세포 내 부피와 버퍼의 직접 접촉할 수 있습니다. 이로 인해 매우 높은 신호대 잡음 비, 셀룰러 전기 활동을 정밀하게 제어하며 매우 높은 시간적 분해능을 생성하는 바이오 전기 인터페이스가 생성됩니다. 이 방법론은 최근 나노 파이펫 구성7로축소 된 매우 강력한 도구이지만 몇 가지 중요한 기술적 한계와 관련이 있습니다. 사이토솔 희석 효과8,기계적 진동뿐만 아니라, 단기 심문에 유틸리티를 제한하고, 고가의 전문 장비와 높은 수준의 기술 기술이 필요합니다. 더욱이, 그것의 부피가 기록되거나 동시에 자극될 수 있는 세포의 수를 제한하고, 그것의 침략으로 인해, 실험을 통해 재구성될 수 없습니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 마이크로 전극 어레이가 개발되었지만 전극의 크기는 세포 내 액세스뿐만 아니라 공간 해상도를 제한합니다. 나노 전극 어레이는 세포 내 기록 및 자극을 허용하지만 사이토솔9,10에액세스하기 위해 연마 전기 포기가 필요합니다. 또한, 이러한 모든 방법론은 기판에 결합되어 따라서 체외 세포 배양, 또는 외부 피상 세포로 제한되며, 3차원(3D) 조직 내부에 있는 세포에 접근할 수 없다.
광유전학(11)은 이러한 3D 및 생체 제한 문제를 해결하기 위해 널리 사용된다. 그러나, 광유전학적 방법은 혈장 막에 분포되는 광 활성화 플라즈마 멤브레인 이온 채널의 동요를 기반으로 하며, 3D 공간해상도(12)와 세포내 기능을 제한한다.
우리는 최근에 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)가 다른 비 흥분 세포, 즉 심장 근섬유 세포 및 올리고덴드로키테(13)와하위 micron 공간 해상도와 세포 내 생물 전적 심문을 수행하는 데 사용할 수 있음을 보여 주었다. 더욱이, 우리는 3D 심장 조직 내에서 전 생체 세포 특정 심문을 수행하기 위해 이러한 SiNWs를 사용하여 심장 세포가 생체14에서전기적으로 결합하는 방법을 조사하였다. 이 방법론의 주요 장점은 단순함입니다. 그것은 어떤 유전 적 변형 또는 부피가 큰 계측을 필요로하지 않습니다. 많은 세포가 초음파 처리 또는 전기화15에대한 필요없이 자발적으로 사진 반응 SiNWs를 내면화합니다. 또한, 그들은 자발적으로 내피 캡슐화를 탈출하고 사이토솔 및 세포 내세포세포(13,15)와원활한 통합을 형성한다. 셀-실리콘 하이브리드라고 불리는 이 셀-SiNWs 복합체는 SiNWs의 연동적이고 부드럽고 다재다능한 특성뿐만 아니라 SiNWs의 광전 기능을 가지고 있습니다. 혼성화 후, 세포-SiNW 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확하고 세포내 바이오전 자극과 같은 다양한 용도에 사용될 수 있다; 체외에서 세포 간 바이오 전기 커플링을 공부; 그리고 생체 내 세포 특정 심문. 효과적인 자극은 높은 광학 전력 밀도와 SiNWs의 공동 국소화가 필요하므로 2D 및 3D 모두에서 높은 공간 해상도를 달성할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 방법론뿐만 아니라 결과를 분석할 수 있는 방법을 자세히 설명합니다. 초점은 체외에서 세포 내 및 세포 간 조사에 배치됩니다, 그러나 이 방법론의 생체 내 구현은 많은 그밖 생물학 시나리오에 직접 이용될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Myofibroblasts는 자발적으로 실리콘 나노 와이어 (SiNWs)를 내면화 할 수 있습니다, 그들에게 바이오 전자 응용 프로그램에 대한 매력적인 대상이 될 수 있습니다. 이러한 셀-실리콘 하이브리드는 정상적인 세포 거동에 최소한의 교란을 통해 납없는 광학 변조 기능을 제공합니다. 광학 기능은 SiNWs의 광열 및 광전 특성에 의해 얻어진다. 이러한 하이브리드는 표준 조직 배양 기술을 사용하여 수확한 다음 다른 생물학적 시나리오에 적용할 수 있습니다. 우리는 이 혼성이 어떻게 심장 세포의 전기 결합을 연구하고 근섬유 세포가 서로 또는 심근세포에 어떻게 결합되는지 비교하기 위하여 어떻게 이용될 수 있는지 여기에서 보여줍니다. 이 과정은 결합 된 레이저 라인과 형광 현미경을 넘어 특별한 장비없이 달성 할 수 있습니다. 또한 배양시 다른 세포 들 사이 칼슘 전파의 정량화를 허용하는 맞춤형 MATLAB 루틴의 사용이 도시되어 있습니다. 근섬유 세포는 심근 세포보다 느린 전기 반응을 보이는 것으로 나타났습니다. 더욱이, 근섬유세포 세포 간 전파는 약간 느리게 보여줍니다, 비록 그들의 세포 내 속도에 비교 속도, 갭 접합 또는 나노 튜브를 통해 수동 전파를 제안. 이 기술은 매우 적응력이 뛰어나며 생체 외뿐만 아니라 생체 내 또는 전 생체 내 조사를 위해 다른 셀룰러 경기장에 쉽게 적용 할 수 있습니다.

세포 내 사이토솔에 직접 접근할 수 있도록 하는 이 방법론의 능력은 세포로 SiNW의 자발적인 내산화에 달려 있습니다. SiNWs는 많은 세포 유형으로 자발적인 내면화를 겪을 것이지만15,심근세포 및 뉴런과 같은 일부 세포는 내산화를 허용하기 위해 SiNWs를 치료해야합니다19. 이 프로토콜에서 우리는 200-300 nm 직경및 심장 MFs로 길이 ~1-3 μmp의 내화 과정을 <strong class=...

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Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

이 프로토콜은 간단하고 수행하기 쉬운 방법으로 세포의 세포 내 광학 바이오 변조를위한 실리콘 나노 와이어의 사용을 설명합니다. 이 기술은 다양한 세포 유형에 매우 적응력이 뛰어나며 생체 내뿐만 아니라 생체 내 응용 분야에도 사용할 수 있습니다.

실리콘 나노 와이어 및 세포 간 전기 커플링의 조사를위한 광학 자극

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

이 기술은 표준 광학 현미경 검사법만을 사용하여 매우 높은 공간 해상도 및 세포 특이성을 가진 세포 내 생체 전기 적 심문을 허용합니다. 이 방법은 세포 내의 세포 및 특정 위치의 자극 및 전기 적 심문을 용이하게하고 3D 전 생체 조직 제제뿐만 아니라 시험관 내에서 수행 될 수있다. 이 기술은 심장 또는 뇌 세포와 같은 많은 세포 분야의 생체 전자 조사뿐만 아니라 우리의 모든 비 흥분 세포 사이의 전기 통신을 가능하게합니다.근섬유아세포 심근세포 현탁액으로부터 근섬유아세포를 분리하기 위해 심근세포가 1시간 동안 100mm 조직 배양 접시에 분리된 세포를 미리 플레이트화하여 심근세포가 섬유목과 처리된 표면을 부착해야 하므로 부착한다. 인큐베이션의 끝에서, 다운스트림 공동 배양에 대한 상퍼를 포함하는 농축 된 심근세포이를 수집합니다. DMEM으로 심섬유 아세포를 헹구면 남은 심근세포를 제거하고 2~4일 의 추가 배양 전에 신선한 배양 배지로 세포를 공급합니다.세포가 80%에 도달하면 다이아몬드 스크라이브를 사용하여 웨이퍼에서 3mm 칩을 화학 증기 증착 성 실리콘 나노와이어로 잘라냅니다. 그리고 70 %에탄올에 칩을 헹구기 위해 날카로운 집게를 사용합니다. 헹구고 바이오 안전 라미나르 플로우 후드에서 자외선 아래에서 30분 동안 칩을 공기 건조한 후 칩을 멸균 마이크로 원심분리기로 옮겨냅니다.완전한 세포 배양 배지 헹구기를 사용하여 남은 에탄올을 제거한 후 초음파 욕조에서 신선한 배양 배지의 1 밀리리터로 칩을 초음파 처리합니다. 나노 와이어가 방출될 때 상체는 흐려져야 합니다. 실리콘 나노 와이어 서스펜션을 신선한 배양 배지의 5 밀리리터에 혼합하고 나노 와이어 용액을 심섬유 아세포의 접시에 시드하십시오.세포 배양 인큐베이터에서 4시간 후, 신선한 배양 배지로 접시를 5회 헹구어 어떤 비내화 나노와이어를 제거하고 일부 내재된 나노와이어가 완전히 통합될 수 있도록 세포를 또 다른 시간 동안 배양한다. 다음으로 갓 준비된 콜라겐 코팅 용액 500마이크로리터를 35mm 유리 바닥 접시에 넣습니다. 섭씨 37도에서 1시간 동안 잠복한 후 멸균 PBS로 접시를 헹구고 실리콘 나노와이어 근섬유아세포 하이브리드를 수확하여 트립신 3밀리리터를 섭씨 37도에서 2분간 수확합니다.세포가 분리되면 배양 배지의 10 밀리리터로 반응을 멈추고, 파이펫팅에 의해 적극적으로 헹구고 세포를 손상시키지 않도록 200G 이상 원심 분리하지 마십시오. 그런 다음 하이브리드 세포 펠릿을 신선한 배지의 1 밀리리터로 다시 중단하고 콜라겐 코팅 유리 바닥 접시에 세포를 시드합니다. 나노 와이어 내산화를 확인하려면 표준 프로토콜에 따라 형광 시토솔 및 멤브레인 염료로 세포를 라벨링하고 공초점 현미경을 사용하여 세포를 이미지화합니다.실리콘 나노 와이어는 매우 반사, 반사 광 대신 그들의 시각화에 대 한 형광 을 사용할 수 있습니다. 심오섬유블라스트 실리콘 나노와이어 하이브리드 심근세포 공동배양을 설정하려면 각 세포 유형의 적절한 수를 콜라겐 코팅 유리 바닥 접시에 시드한다. 그리고 세포가 세포 간 간격 접합을 형성할 수 있도록 48 시간 동안 섭씨 37도에서 세포를 배양합니다.실험 당일, 문화상수체를 갓 준비한 칼슘 에민감한 염료로 보충한 1밀리리터의 배양 배지로 대체하여 섭씨 37도에서 20~30분 동안 배양합니다. 인큐베이션의 끝에서, 미리 따뜻하게 페놀 레드 프리 DMEM의 1 밀리리터로 세포를 치료하기 전에, 멸균 PBS로 접시를 두 번 세척. 그런 다음 세포 내 칼슘 염료가 기준선 이미지를 획득하기 전에 섭씨 37도에서 30 분 동안 탈 에스테르화를 겪을 수 있도록하십시오.광학 이미징 및 자극 전에, 컬리컬 레이저 라인과 현미경에 가습 된 마이크로 인큐베이터를 예열하여 광 경로에 결합되어 칼슘 이미징 및 광학 자극을 섭씨 37도및 5 % 버블 시대 이산화탄소 혼합물로 예열하십시오. 현미경이 준비되면, 심섬유 블라스트 하이브리드 심근 세포공동 배양을 마이크로 인큐베이터에 넣고 밝은 필드 현미경 검사법에 의해 나노 와이어를 시각화하여 적절한 자극 부위를 찾습니다. 사이트가 확인되면, 나노 와이어의 미리 정의된 위치에서 자극 점을 유지하면서 형광 모드로 광 경로를 재구성하고, 각 실리콘 나노 와이어 크기와 셀 유형에 대해 최적의 자극 전력 및 펄스 길이를 검증한다.기준선 세포내 칼슘 활성의 2-10초 기록을 획득하고, 1-10의 레이저 펄스와 1-10밀리초의 지속 시간으로 나노 와이어를 자극하여 생성된 칼슘 파를 2~10초 동안 기록한다. 실험이 끝나면 광학 자극의 녹화된 영화를 적절한 소프트웨어 프로그램으로 전송하여 추가 분석을 한다. 표준 상 대비 광학을 사용하여, 합류 세포는 빛 현미경 검사법에 의해 쉽게 볼 수 있습니다.그러나 실리콘 나노와이어는 거의 보이지 않게 되어 이 방법으로 위치를 정의할 수 없습니다. 그러나 빛과 어두운 필드 이미지의 슈퍼 부과는 빛 반사 실리콘 나노 와이어의 페리 핵 배열의 시각화를 허용합니다. 공초점 현미경 검사는 형광 마커 염색 된 사이토솔 및 혈장 막을 시각화하는 데 사용할 수 있으며 실리콘 나노 와이어의 세포 내 위치를 보다 분명하게 만듭니다.표준 현미경 검사를 사용하여 자극되는 실리콘 나노 와이어의 위치를 식별하기 위해 밝은 필드 이미지를 얻을 수 있습니다. 자발적으로 구타 심근 세포와 휴식 심근 세포의 짧은 기준 선 비디오는 다음 취득 할 수 있습니다. 자극 후, 공동 배양 내의 칼슘 전파를 기록할 수 있다.다른 세포가 흥분되는 시간은 평균 광학 흐름의 변화가 최대치에 도달하는 지점에 의해 결정될 수 있습니다. 그런 다음 광학 흐름을 계산하여 각 세포 영역 내에서 활성화 시간을 식별하는 데 도움이 됩니다. 세포 내 속도는 카이마 그래프를 사용하여 각 세포에 대해 결정될 수 있으며, 세포 내 전파 속도의 반전을 나타내는 선의 경사와 함께 결정될 수 있다.예를 들어, 여기서, 단일 공동 배양 내의 세포 상호 작용을 위해 측정된 상이한 세포 내 및 세포 내 속도에 대한 요약을 관찰할 수 있다. 이러한 방법은 세포 실리콘 하이브리드를 조직에 직접 주입하고 3D 전 생체 내 제제를 사용하여 생체 내 전기 회사를 연구함으로써 생체 내 연구를 위해 활용할 수 있다.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

소프트 리소그래피 작용화 및 Patterning 산화물없는 실리콘과 게르마늄

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

연구

생체공학

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

실란 커플링 에이전트를 사용하여 실리카 광 Biosensors에 생물 학적 프로브를 부착

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

전기 자극의 손쥐 Myoblast의 전구 세포 및 응용에서 공학 골격근 조직도

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

기본, 섬유 긴 간격 및 Segmental 긴 간격 콜라겐의 체외 합성에

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

의 광학 검출<em&gt; E. 대장균</em메조 포러스 실리콘 바이오 센서에 의해&gt; 박테리아

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

siRNA를 치료제의 전달을위한 다공성 실리콘 미세 입자

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

컴퓨터 단층 촬영 및 골 형성 - 혈관 신생 커플 링의 광학 이미징 두개골 뼈자가 이식과 동종 이식 통합을 평가하기 위해

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

공액 고분자에 의해 세포를 전기적 활동을 생활의 광 제어

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

화학 및 바이오 센싱 애플리케이션을위한 실리콘 나노 와이어 전계 효과 트랜지스터의 제조

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

파면 정형을 이용하여 광섬유를 통해 다중 신호 전송

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...