Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Dette arbeidet støttes av Air Force Office of Scientific Research (AFOSR FA9550-18-1-0503).

For å sikre overholdelse av etiske standarder ble alle dyreprosedyrer knyttet til å isolere kardiomyocytter fra gnagerhjerter først godkjent av University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). I tillegg ble alle dyreforsøk utført i fullstendig samsvar med veiledning fra University of Chicago IACUC.
1. Utarbeidelse av celle-SiNWs hybrider
<ol><li>Isoler primære kardiomyocytter (CMs) ved hjelp av et kommersielt sett etter produsentens retningslinjer.</li>
	<li>Forbe...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

Vi har vist her en enkel måte å utføre intracellulær elektrisk stimulering av celler. I denne demonstrasjonen brukte vi MFs som var prehybridized med SiNWs, deretter co-kultivert med CMs. Generelt har de fleste voksende celler tendensen til å internalisere SiNWs, noe som gjør det mulig å bruke denne metodikken med mange andre celletyper. Videre, mens vi demonstrerte intracellulær stimulering av celler, kan de samme prinsippene brukes til å utføre ekstracellulær stimulering av celler. Dette kan gjøres ved å b...

Alle biologiske organismer bruker elektrisitet, i form av ioner, for å regulere cellulær oppførsel. Cellemembraner inneholder ulike typer spesifikke iionkanaler som tillater passiv og aktiv transport av ioner. Disse ionene styrer funksjonene til spennende celler, som nevronal aktivitet og skjelett- og hjertemuskelkontraktilitet. Bioelektrisitet spiller imidlertid også en viktig rolle i ikke-spennende celler, som styrer mange cellulære funksjoner som cellespredning1,nevroimmunitet2,3,4og stamcelledilatering5.
I de siste tiårene har bioelektrisitetsfeltet trukket et økende interessenivå, noe som har bidratt til utviklingen av en rekke teknologier for bioelektroniske grensesnitt. Mikroelektrod patch pipetter er gullstandarden for intracellulær opptak og stimulering6. I denne metodikken trekkes en glasspipette under spesifikke forhold for å danne en skarp kant med en porestørrelse på få mikrometer. Denne pipetten er fylt med en buffer og pipetten tillater direkte kontakt med bufferen med det intracellulære volumet. Dette resulterer i et bioelektrisk grensesnitt som gir ekstremt høye signal-til-støyforhold, presis kontroll over mobilnettets elektriske aktivitet og ekstremt høy temporal oppløsning. Selv om denne metoden er et ekstremt kraftig verktøy, som nylig ble nedskalert til en nanopipettekonfigurasjon7,er den forbundet med flere viktige tekniske begrensninger. Cytosol fortynning effekt8, samt mekaniske vibrasjoner, begrenser verktøyet til kortsiktige avhør, og det krever dyrt spesialisert utstyr og et høyt nivå av tekniske ferdigheter. Videre begrenser dens bulkiness antall celler som kan registreres eller stimuleres samtidig, og på grunn av invasiviteten kan den ikke konfigureres på nytt gjennom et eksperiment. For å overvinne disse begrensningene ble mikroelektrodarrayer utviklet, men størrelsen på elektrodene begrenser romlig oppløsning samt intracellulær tilgang. Nanoelektrodarrayer tillater intracellulær opptak og stimulering, men krever slipende elektroporasjon for å få tilgang til cytosol9,10. I tillegg er alle disse metodene substrat bundet og er dermed begrenset til in vitro cellekulturer, eller til eksterne overfladiske celler, uten tilgang til celler som er inne i et 3-dimensjonalt (3D) vev.
Optogenetics11 er mye brukt til å løse disse 3D og in vivo begrensninger. Imidlertid er optogenetiske metoder basert på perturbasjonene av lysaktiverte plasmamembranionkanaler som distribueres ved plasmamembranen, og begrenser 3D-romligoppløsning 12 og intracellulære evner.
Vi har nylig vist at silisium nanowires (SiNWs) kan brukes til å utføre intracellulær bioelektrisk avhør med submicron romlig oppløsning med forskjellige ikke-spennende celler, nemlig hjerte myofibroblaster og oligodendrocytes13. Videre brukte vi disse SiNWs til å utføre ex-vivo cellespesifikt avhør i et 3D-hjertevev, for å undersøke hvordan hjerteceller elektrisk par i vivo14. En stor fordel med denne metodikken er dens enkelhet; det krever ingen genetisk modifikasjon eller klumpete instrumentering. Mange celler vil spontant internalisere fotoresponsive SiNWs uten behov for sonikering eller elektroporasjon15. I tillegg vil de spontant unnslippe den enoforale innkapslingen og danne en sømløs integrasjon med cytosol og intracellulære organeller13,15. Disse celle-SiNWs kompositter, be begrepcelle-silisium hybrider, har den dynamiske, myke og allsidige natur den opprinnelige cellen, samt optoelektriske evner av SiNWs. Etter hybridisering, celle-SiNW hybrid kan høstes ved hjelp av standard vev kultur teknikker og brukes for ulike applikasjoner som intracellulær bioelektrisk stimulering; studere intercellulær bioelektrisk kobling in vitro; og for in vivo cellespesifikke avhør. Som en effektiv stimulering krever sam-lokalisering av høy optisk effekt tettheter og SiNWs, kan man oppnå høy romlig oppløsning både i 2D og 3D. I denne protokollen beskriver vi i detalj metodikken, samt hvordan resultatene kan analyseres. Fokuset er plassert på intra- og intercellulær undersøkelse in vitro, men in vivo implementeringen av denne metodikken kan brukes direkte for mange andre biologiske scenarier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Myofibroblaster kan spontant internalisere silisium nanowires (SiNWs), noe som gjør dem til et attraktivt mål for bioelektroniske applikasjoner. Disse celle-silisium hybrider tilbyr blyfri optisk modulasjon evner med minimal perturbasjon til normal celle atferd. De optiske egenskapene oppnås av de fototermiske og fotoelektriske egenskapene til SiNWs. Disse hybridene kan høstes ved hjelp av standard vev kultur teknikker og deretter brukes på ulike biologiske scenarier. Vi demonstrerer her hvordan disse hybridene kan brukes til å studere elektrisk kobling av hjerteceller og sammenligne hvordan myofibroblaster par til hverandre eller til kardiomyocytter. Denne prosessen kan oppnås uten spesialutstyr utover et fluorescerende mikroskop med koplet laserlinje. Også vist er bruken av en spesialbygd MATLAB rutine som tillater kvantifisering av kalsium forplantning i og mellom de forskjellige cellene i kulturen. Myofibroblaster er vist å ha en langsommere elektrisk respons enn kardiomyocytter. Videre viser myofibroblast intercellulær forplantning litt langsommere, selv om sammenlignbare hastigheter til deres intracellulære hastigheter, noe som tyder på passiv forplantning gjennom gapkryss eller nanorør. Denne teknikken er svært tilpasningsdyktig og kan enkelt brukes på andre cellulære arenaer, for in vitro samt in vivo eller ex vivo undersøkelser.

Denne metodikkens evne til å gi direkte tilgang til intracellulær cytosol avhenger av den spontane internaliseringen av SiNW i cellene. Selv om SiNWs vil gjennomgå spontan internalisering i mange celletyper15,vil noen celler, som kardiomyocytter og nevroner, trenge SiNWs som skal behandles for å tillate deres internalisering19. I denne protokollen beskriver vi internaliseringsprosessen av p-i-n SiNWs med 200-300 nm diameter og ~ 1-3 μm lang inn i hjerte MFs. <strong cl...

Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Denne protokollen beskriver bruken av silisium nanowires for intracellulær optisk bio-modulasjon av celle i en enkel og enkel å utføre metode. Teknikken er svært tilpasningsdyktig til ulike celletyper og kan brukes til in vitro samt in vivo applikasjoner.

Silisium nanoledninger og optisk stimulering for undersøkelser av intra- og intercellulær elektrisk kobling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Denne teknikken tillater intracellulær bioelektrisk avhør med ekstremt høy romlig oppløsning og cellespesifisitet ved hjelp av bare standard optisk mikroskopi. Denne metoden forenkler stimulering og elektrisk avhør av celler og bestemte steder i cellene og kan utføres in vitro samt i 3D ex vivo vevpreparater. Denne teknikken muliggjør bio-elektronisk undersøkelse av mange cellulære arenaer som hjerte- eller hjerneceller, samt den elektriske kommunikasjonen mellom alle våre ikke-spennende celler.For å isolere myofibroblaster fra en myofibroblast kardiomyocyttsuspensjon, pre-plate de isolerte cellene på en 100 millimeter vev kulturrett i en time, da kardiomyocytter trenger en fiberhalset og behandlet overflate for å holde seg. På slutten av inkubasjonen samler du den berikede kardiomyocytten som inneholder supernatant for nedstrøms co-kultur. Skyll myofibroblastene med DMEM for å eliminere eventuelle gjenværende kardiomyocytter og mate cellene med frisk kulturmedium før ytterligere to til fire dager med inkubasjon.Når cellene når 80% samløpet, bruk en diamantskriver til å kutte en tre og tre millimeter chip fra en wafer med kjemiske dampdeponeringsdyrkede silisiumnanowires. Og bruk skarpe tang for å skylle chips i 70% etanol. Etter skylling, lufttørk chips i 30 minutter under ultrafiolett lys i en bio-sikkerhet laminær strømningshette, før du overfører chips til en steril mikro sentrifuge rør.Bruk en komplett cellekultur medium skyll for å fjerne eventuelle gjenværende etanol, før sonikering chips i en milliliter frisk kultur medium i et sonikering bad i ett til 10 minutter. Det overnaturlige bør bli overskyet når nanoledningene frigjøres. Bland Silicon nanowire suspensjon i fem milliliter av frisk kultur medium og frø nano wire løsning på parabolen av myofibroblaster.Etter fire timer i cellekulturinkubatoren, skyll parabolen fem ganger med friskt kulturmedium for å fjerne uinternaliserte nanoledninger og fortsett å inkubere cellene i en time for å tillate at eventuelle delvis internaliserte nanoledninger kan innlemmes helt. Deretter legger du til 500 mikroliter nylaget kollagenbeleggoppløsning til en 35 millimeter glassbunnsrett. Etter en time inkubasjon ved 37 grader Celsius, skyll parabolen med steril PBS og høst Silisium nanowire myofibroblast hybrider, med tre milliliter trypsin, i to minutter ved 37 grader Celsius.Når cellene har løsnet, stopp reaksjonen med 10 milliliter kulturmedium, skyll kraftig ved pipettering og ikke sentrifuger over 200 G for å unngå å skade cellene. Deretter re-suspendere hybrid celle pellets i en milliliter av friskt medium, og frø cellene på kollagen belagt glass bunnrett. For å verifisere nanolednings internaliseringen, merk cellene med fluorescerende cytosol og membranfargestoffer, i henhold til standardprotokoller, og bruk et konfokalt mikroskop for å bilde cellene.Siden silisium nanowires er svært reflekterende, kan reflektert lys brukes i stedet for fluorescens for visualisering. For å sette opp en myofibroblast silisium nanowire hybrid kardiomyocyte co-kultur, frø riktig antall av hver celletype på en kollagenbelagt glass bunnrett. Og kultur cellene på 37 grader Celsius i 48 timer, slik at cellene kan danne intercellulære gapkryss.På dagen for eksperimentet, erstatte kulturen supernatant med en milliliter kultur medium supplert med nylaget kalsiumfølsom fargestoff, for en 20 til 30 minutters inkubasjon ved 37 grader Celsius. På slutten av inkubasjonen, vask platen to ganger med steril PBS, før du behandler cellene med en milliliter forhåndsvarmet fenol rød fri DMEM. La deretter det intracellulære kalsiumfargestoffet gjennomgå de-esterifisering i 30 minutter ved 37 grader Celsius, før du anskaffer baselinebilder.Før optisk avbildning og stimulering forvarm en fuktet mikroinkubator på et mikroskop med en kollidert laserlinje sammenlignet med lysbanen, for kalsiumavbildning og optisk stimulering til 37 grader Celsius og en 5% boble era karbondioksidblanding. Når mikroskopet er klart, plasser myofibroblast hybrid kardiomyocyttkokulturen i mikroinkubatoren og visualiser nanoledningene ved lysfeltmikroskopi for å finne et passende stimuleringssted. Når et område er identifisert, konfigurerer du lysbanen til fluorescensmodus på nytt, samtidig som stimuleringspunktet opprettholdes på den forhåndsdefinerte plasseringen av nanoledningen, og validerer den optimale stimuleringskraften og pulslengden, for hver silisiumnanowirestørrelse og celletype.Få en to til ti sekunders registrering av baseline intracellulær kalsiumaktivitet, før du stimulerer nanoledningen med en enkelt laserpuls på en til 10 melowatts av kraft og en til 10 millisekund varighet, registrere den resulterende kalsiumbølgen i ytterligere to til 10 sekunder. På slutten av eksperimentet overføre de innspilte filmene av optisk stimulering til riktig program, for ytterligere analyse. Ved hjelp av standard fasekontrastoptikk blir sammenføyningsceller lett sett av lysmikroskopi.Silisium nanowires er imidlertid knapt synlige, noe som gjør deres steder umulige å definere ved denne metoden. Super ileggelse av lyse og mørke feltbilder tillater imidlertid visualisering av Perry kjernefysisk arrangement av lysreflekterende silisium nanowires. Konfokal mikroskopi kan brukes til å visualisere fluorescerende markør farget cytosol og plasmamembraner, noe som gjør den intracellulære plasseringen av silisium nanowires mer tydelig.Ved hjelp av standard mikroskopi kan du få et lyst feltbilde for å identifisere plasseringen av silisiumnanowiren som skal stimuleres. En kort baseline video av spontant slå cardiomyocytes og de hvilende myofibroblastene kan deretter kjøpes. Etter stimulering kan kalsiumforplantningen i samkulturen registreres.Tiden da de forskjellige cellene blir begeistret, kan bestemmes av det punktet hvor endringen i gjennomsnittlig optisk flyt når sitt maksimale. Den optiske flyten kan deretter beregnes for å hjelpe til med identifisering av aktiveringstidspunktet i hvert celleområde. De intracellulære hastighetene kan bestemmes for hver celle ved hjelp av Khaimah-grafer, med skråningen av linjen som representerer den inverse av den intracellulære forplantningshastigheten.For eksempel, her kan et sammendrag av de forskjellige inter- og intracellulære hastigheter målt for celleinteraksjonene i en enkelt samkultur observeres. Denne metoden kan benyttes for in vivo studier ved å injisere cellen Silicon hybrider direkte inn i vevet og bruke 3D ex vivo preparater for å studere in vivo elektrisk selskap.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Soft litografi funksjonalisering og Mønster Oxide-free Silisium og Germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Feste Biologiske Sonder til Silica Optiske Biosensorer Bruke silane kopling agenter

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering skjelettmuskulatur vev fra Murine Myoblast stamceller og anvendelse av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Syntese av Native, Fibrous Long Mellomrom og Segmental Long avstand Kollagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optisk deteksjon av<em&gt; E. coli</em&gt; bakterier ved Mesoporous Silicon biosensorer

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porøs Silicon Mikropartikler for levering av siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Computertomografi og optisk avbildning av Osteogenesis-angiogenese Kobling til Vurdere Integrering av kraniet autografts og allografter

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk Kontroll av levende celler elektrisk aktivitet ved Conjugated Polymers

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Utarbeidelse av Silicon nanowire felteffekttransistor for kjemi og biosensing applikasjoner

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Overføring av flere signaler gjennom en optisk fiber ved hjelp av Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...