Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Эта работа поддерживается Управлением научных исследований ВВС (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Для обеспечения соблюдения этических стандартов все процедуры для животных, связанные с изоляцией кардиомиоцитов от сердца грызунов, были впервые одобрены Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Чикагского университета (IACUC). Кроме того, все эксперименты на животных были ...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

Мы продемонстрировали здесь простой способ выполнения внутриклеточной электрической стимуляции клеток. В этой демонстрации, мы использовали MFs, которые были prehybridized с SiNWs, а затем совместно с CMs. В целом, большинство размножающихся клеток имеют тенденцию к интернализации SiNWs, что позвол?...

Все биологические организмы используют электричество в виде ионов для регулирования клеточного поведения. Клеточные мембраны содержат различные типы специфических ионных каналов, позволяющих пассивно и активно транспортировать ионы. Эти ионы регулируют функции возбудимых клеток, таких как нейронная активность и скелетная и сердечная соток. Тем не менее, биоэлектричность также играет важную роль в невозбудимых клетках, регулирующих многие клеточные функции,такие как пролиферацией клеток 1,нейроиммунностью 2,3,4и дифференциацией стволовыхклеток 5.
В последние десятилетия область биоэлектричества привлекла все более высокий уровень интереса, что способствовало развитию многочисленных технологий биоэлектронных интерфейсов. Microelectrode патч пипетки являются золотым стандартом внутриклеточной записи и стимуляции6. В этой методологии, стеклянная пипетка вытащил при определенных условиях, чтобы сформировать острый край с поры размером несколько микрон. Эта пипетка заполнена буфером, а пипетка позволяет напрямую контактировать буфера с внутриклеточным объемом. Это приводит к биоэлектрический интерфейс, который дает чрезвычайно высокий сигнал к шуму отношения, точный контроль над клеточной электрической активности, и чрезвычайно высокое временное разрешение. Хотя эта методология является чрезвычайно мощным инструментом, который недавно был сокращен до нано-пипеткиконфигурации 7, это связано с несколькими важными техническими ограничениями. Эффект разбавленияцитозолом 8,а также механические вибрации, ограничивает его полезность краткосрочными допросами, и требует дорогостоящего специализированного оборудования и высокого уровня технических навыков. Кроме того, его громоздкость ограничивает количество клеток, которые могут быть записаны или стимулированы одновременно, и из-за его инвазивности, он не может быть перенастроен на протяжении всего эксперимента. Для преодоления этих ограничений были разработаны массивы микроэлектродов, но размер электродов ограничивает пространственное разрешение, а также внутриклеточный доступ. Nanoelectrode массивы позволяют внутриклеточной записи и стимуляции, но требуют абразивного электропорации для доступа кцитозолу 9,10. Кроме того, все эти методологии связаны субстратами и, таким образом, ограничиваются культурами клеток в пробирке или внешними поверхностными клетками, не имеют доступа к клеткам, которые находятся внутри трехмерной (3D) ткани.
Optogenetics11 широко используется для решения этих 3D и in vivo ограничений. Однако оптогенетические методы основаны на возмущениях светоактивных плазменных мембранных ионных каналов, которые распространяются на плазменной мембране, ограничивая 3Dпространственное разрешение 12 и внутриклеточные возможности.
Недавно мы показали, что кремниевые нанопроводы (SiNWs) могут быть использованы для выполнения внутриклеточного биоэлектрического допроса с субмикроном пространственного разрешения с различными невозбудимыми клетками, а именно сердечными миофибробластами и олигодендроцитами13. Кроме того, мы использовали эти SiNWs для выполнения экс-vivo клеток конкретных допроса в 3D сердечной ткани, чтобы исследовать, как сердечные клетки электрически пара in vivo14. Основным преимуществом этой методологии является ее простота; он не требует каких-либо генетических изменений или громоздких приборов. Многие клетки спонтанно интернализировать фото-реакции SiNWs без необходимости звуковой или электропорации15. Кроме того, они спонтанно избежит эндосомной инкапсуляции и образуют бесшовную интеграцию с цитозолом и внутриклеточнымиорганеллами 13,15. Эти клеточные-SiNWs композиты, называются клеточно-силиконовыми гибридами, обладают динамичным, мягким и универсальным характером оригинальной клетки, а также оптометическими возможностями SiNWs. После гибридизации гибрид cell-SiNW может быть собран с использованием стандартных методов культуры тканей и использован для различных применений, таких как внутриклеточная биоэлектрическая стимуляция; изучение межклеточной биоэлектрической связи в пробирке; и для in vivo ячейки конкретных допросов. Поскольку эффективная стимуляция требует совместной локализации высокой плотности оптической мощности и SiNWs, можно достичь высокого пространственного разрешения как в 2D, так и в 3D. В этом протоколе мы подробно описываем методологию, а также то, как можно анализировать результаты. Основное внимание уделяется внутриклеточному и межклеточному исследованию in vitro, однако внедрение этой методологии может быть непосредственно использовано для многих других биологических сценариев.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Миофибробласты могут спонтанно интернализировать кремниевые нанопроводы (SiNWs), что делает их привлекательной мишенью для биоэлектронного применения. Эти клеточные кремниевые гибриды предлагают бесхитные оптические возможности модуляции с минимальным возмущением к нормальному поведению клеток. Оптические возможности получены по фототермальным и фотоэлектрическим свойствам SiNWs. Эти гибриды могут быть собраны с использованием стандартных методов культуры тканей, а затем применяются к различным биологическим сценариям. Мы демонстрируем здесь, как эти гибриды могут быть использованы для изучения электрической связи сердечных клеток и сравнить, как миофибробласты пара друг с другом или кардиомиоцитов. Этот процесс может быть выполнен без специального оборудования за флуоресцентный микроскоп с соединенной лазерной линии. Также показано использование специально построенной matLAB рутины, которая позволяет количественное распространение кальция внутри и между различными клетками в культуре. Миофибробласты, как показано, имеют более медленный электрический ответ, чем у кардиомиоцитов. Кроме того, межклеточное размножение миофиброласта показывает несколько более медленные, хотя и сопоставимые скорости с их внутриклеточными скоростями, что предполагает пассивное распространение через разрывные соединения или нанотрубки. Этот метод очень адаптируется и может быть легко применен к другим клеточным аренам, для in vitro, а также in vivo или ex vivo исследований.

Способность этой методологии обеспечить прямой доступ к внутриклеточному цитозолу зависит от спонтанной интернализации SiNW в клетки. Хотя SiNWs будет проходить спонтанную интернализации вомногих типах клеток 15, некоторые клетки, такие как кардиомиоциты и нейроны, потребует...

Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Этот протокол описывает использование кремниевых нанопроводов для внутриклеточной оптической биомодулации клетки простым и простым в работе методом. Техника очень адаптируется к различным типам клеток и может быть использована для in vitro, а также in vivo приложений.

Кремниевые нанопроводы и оптическая стимуляция для исследований внутриклеточного и межклеточного электрического соединения

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Этот метод позволяет внутриклеточный биоэлектрический допрос с чрезвычайно высоким пространственным разрешением и клеточной специфичностью, используя только стандартную оптическую микроскопию. Этот метод облегчает стимуляцию и электрический допрос клеток и конкретных мест в клетках и может быть выполнен в пробирке, а также в 3D ex vivo ткани препаратов. Этот метод позволяет биоэлектронной исследования многих клеточных аренах, таких как сердечные или клетки мозга, а также электрической связи между всеми нашими невозбудимых клеток.Чтобы изолировать миофибробласты от миофибробласта кардиомиоцитов подвески, предварительно пластины изолированных клеток на 100 миллиметров ткани культуры блюдо в течение одного часа, как кардиомиоциты нуждаются в волоконной шее и обработанной поверхности придерживаться. В конце инкубации соберите обогащенный кардиомиоцит, содержащий супернатант для совместной культуры ниже по течению. Промыть миофибробласты с DMEM для устранения любых оставшихся кардиомиоцитов и кормить клетки свежей среде культуры до дополнительных двух-четырех дней инкубации.Когда клетки достигают 80%-ного слияния, используйте алмазного писца, чтобы вырезать чип три на три миллиметра из пластины с химическими парами, выращенными кремниевыми нанопроводами. И использовать острые миппы для полоскания чипов в 70% этанола. После полоскания, воздух сухой чипов в течение 30 минут под ультрафиолетовым светом в био-безопасности ламинарного потока капот, прежде чем передать чипы в стерильной микро центрифуги трубки.Используйте полную клеточной культуры среднего полоскания, чтобы удалить все оставшиеся этанола, прежде чем sonicating чипов в один миллилитр свежей среды культуры в sonication ванной в течение одного до 10 минут. Супернатант должен стать облачным, как нано провода освобождены. Смешайте подвеску кремния nanowire в пять миллилитров свежей среды культуры и семян нано проволоки раствор на блюдо миофибробластов.После четырех часов в инкубаторе клеточной культуры, промойте блюдо пять раз со свежей средой культуры, чтобы удалить любые неинтернализованные нанопроводы и продолжать инкубировать клетки в течение еще одного часа, чтобы любые частично интернализированные нанопроводы были полностью включены. Затем добавьте 500 микролитров свежеприготовленного раствора коллагенового покрытия в 35-миллиметровую стеклянную нижнюю тарелку. После одного часа инкубации при 37 градусах по Цельсию, промыть блюдо стерильным PBS и урожай кремния nanowire миофибробласт гибридов, с тремя миллилитров трипсина, в течение двух минут при 37 градусов по Цельсию.Когда клетки отсоединились, остановить реакцию с 10 миллилитров культуры среды, промыть энергично трубопроводов и не центрифуги более 200 G, чтобы избежать повреждения клеток. Затем повторно приостановить гибридные гранулы клеток в один миллилитр свежей среды, и семена клеток на коллагена покрытием стекла нижней блюдо. Для проверки интернализации нанопровода, этикетка клеток с флуоресцентными цитозолами и мембранными красителями, в соответствии со стандартными протоколами, и использовать конфокальный микроскоп для изображения клеток.Поскольку кремниевые нанопроводы очень отражающие, отраженный свет может быть использован вместо флуоресценции для их визуализации. Чтобы создать миофибробласт кремния nanowire гибридных кардиомиоцитов совместно культуры, семена соответствующее количество каждого типа клеток на коллаген покрытием стекла нижней блюдо. И культуры клеток при 37 градусов по Цельсию в течение 48 часов, чтобы клетки образуют межклеточный разрыв соединений.В день эксперимента замените культурный супернатант одним миллилитром среды культуры, дополненным свежеприготовленным кальциевым чувствительным красителем, на инкубацию от 20 до 30 минут при 37 градусах Цельсия. В конце инкубации, мыть пластину два раза с стерильными PBS, прежде чем лечить клетки с одним миллилитр предварительно разогретого фенола красный свободный DMEM. Затем позвольте внутриклеточному красителю кальция пройти деэстерификацию в течение 30 минут при 37 градусах по Цельсию, прежде чем получить исходные изображения.Перед оптической визуализацией и стимуляцией разогрейте увлажненный микро-инкубатор на микроскопе с коллимированной лазерной линией, соединенной в световой путь, для визуализации кальция и оптической стимуляции до 37 градусов по Цельсию и смеси двуокиси углерода эпохи 5%bubble. Когда микроскоп будет готов, поместите миофибробласт гибридных кардиомиоцитов совместно культуры в микро-инкубатор и визуализировать нанопроводов с помощью яркой микроскопии поля, чтобы найти соответствующий сайт стимуляции. Когда сайт был идентифицирован, перенастроить путь света в режим флуоресценции, сохраняя при этом точку стимуляции в заранее определенном месте нано провода, и проверить оптимальную мощность стимуляции и длину импульса, для каждого кремния нанопровод размер и тип клетки.Приобрети двух-десятисекундную запись базовой внутриклеточной активности кальция, прежде чем стимулировать нанопровод одним лазерным импульсом от одного до 10 меловатт мощности и продолжительностью от одной до 10 миллисекунд, записывая полученную волну кальция в течение еще двух-десяти секунд. В конце эксперимента перенесите записанные фильмы оптической стимуляции в соответствующую программу, для дополнительного анализа. Используя стандартную фазовую контрастную оптику, ячейки слияния легко просматриваются с помощью световой микроскопии.Силиконовые нанопроводы, однако, едва заметны, что делает их расположение невозможно определить с помощью этого метода. Супер наложение световых и темных полевых изображений, однако, позволяет визуализировать перри ядерного расположения светоотражающих кремниевых нанопроводов. Конфокальную микроскопию можно использовать для визуализации флуоресцентного маркера окрашенных цитозоловых и плазменных мембран, что делает внутриклеточное расположение кремниевых нанопроводов более очевидным.Используя стандартную микроскопию, можно получить яркое полевое изображение для определения местоположения кремниевого нанопровода, который будет стимулироваться. Краткое базовое видео спонтанно избиения кардиомиоцитов и отдыха миофибробластов могут быть приобретены. После стимуляции можно фиксировали размножение кальция в рамках совместной культуры.Время возбуждения различных клеток может определяться точкой, в которой изменение среднего оптического потока достигает своего максимума. Оптический поток может быть рассчитан, чтобы помочь в идентификации времени активации в каждой области ячейки. Внутриклеточные скорости могут быть определены для каждой ячейки с помощью графиков Хаймы, при этом наклон линии представляет обратную скорость внутриклеточного распространения.Например, здесь можно наблюдать резюме различных межклеточных и внутриклеточных скоростей, измеренных для клеточных взаимодействий в рамках одной совместной культуры. Этот метод может быть использован для исследований in vivo путем введения гибридов кремния клеток непосредственно в ткани и с помощью 3D ex vivo препаратов для изучения in vivo электрической компании.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Мягкие Литографские Функционализация и структурирование оксида свободного кремния и германия

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Установка биологической зонды для кварцевых оптических биосенсоров использованием силана связующие вещества

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Инженерные скелетных мышечных тканей из мышиных миобластов клеток-предшественников и применения электрической стимуляции

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

В пробирке Синтез Родные, волокнистых длинные интервалы и Сегментные Длинные Коллаген Расстояние

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Оптический Обнаружение<em&gt; Е. палочка</em&gt; Бактерии по Мезопористые Silicon биосенсоров

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Пористого кремния Микрочастицы для доставки миРНК терапии

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Компьютерная томография и оптическая томография остеогенеза ангиогенеза муфта для оценки интеграция кости черепа аутотрансплантатов и аллотрансплантатов

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Оптический контроль живых клеток электрической активности по сопряженных полимеров

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Получение кремния Nanowire полевом транзисторе для химических и биодат- приложений

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Передача нескольких сигналов по оптическому волокну с использованием Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...