Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
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Este trabajo es apoyado por la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (AFOSR FA9550-18-1-0503).

Para garantizar el cumplimiento de las normas éticas, todos los procedimientos animales relacionados con el aislamiento de cardiomiocitos de corazones de roedores fueron aprobados por primera vez por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Chicago (IACUC). Además, todos los experimentos con animales se llevaron a cabo de acuerdo con la orientación de la IACUC de la Universidad de Chicago.
1. Preparación de híbridos cell-SiNWs
<ol><li>Aísle los cardiomioci...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

Hemos demostrado aquí una forma sencilla de realizar la estimulación eléctrica intracelular de las células. En esta demostración, usamos MFs que estaban prehibridizados con SINW, luego co-cultivados con CM. En general, la mayoría de las células proliferantes tienen la tendencia a internalizar los SINW, lo que permite el uso de esta metodología con muchos otros tipos de células. Además, si bien demostramos la estimulación intracelular de las células, los mismos principios se pueden utilizar para realizar la es...

Todos los organismos biológicos utilizan electricidad, en forma de iones, para regular el comportamiento celular. Las membranas celulares contienen varios tipos de canales iónicos específicos que permiten el transporte pasivo y activo de iones. Estos iones gobiernan las funciones de las células excitables, como la actividad neuronal y la contractilidad muscular esquelética y cardíaca. Sin embargo, la bioelectricidad también desempeña un papel importante en las células no excitables, gobernando muchas funciones celulares como la proliferación celular1, neuroinmunidad2,3,4, y la diferenciación de células madre5.
En las últimas décadas, el campo de la bioelectricidad ha generado un creciente nivel de interés, lo que ha contribuido al desarrollo de numerosas tecnologías para interfaces bioelectrónicas. Las pipetas de parches de microelectrodo son el estándar de oro de la grabación y estimulación intracelular6. En esta metodología, una pipeta de vidrio se tira en condiciones específicas para formar un borde afilado con un tamaño de poro de pocos micras. Esta pipeta se rellena con un tampón y la pipeta permite el contacto directo del tampón con el volumen intracelular. Esto da como resultado una interfaz bioeléctrica que produce relaciones de señal a ruido extremadamente altas, control preciso sobre la actividad eléctrica celular y una resolución temporal extremadamente alta. Aunque esta metodología es una herramienta extremadamente potente, que recientemente se redujo a una configuración de nano-pipeta7,se asocia con varias limitaciones técnicas importantes. El efecto de dilución delcitosol 8,así como las vibraciones mecánicas, limita su utilidad a los interrogatorios a corto plazo, y requiere costosos equipos especializados y un alto nivel de habilidad técnica. Además, su voluminosidad limita el número de células que se pueden registrar o estimular simultáneamente, y debido a su invasividad, no puede ser reconfigurada a lo largo de un experimento. Para superar estas limitaciones, se desarrollaron matrices de microelectrodos, pero el tamaño de los electrodos limita la resolución espacial, así como el acceso intracelular. Las matrices de nanoelectrodos permiten el registro y la estimulación intracelulares, pero requieren electroporación abrasiva para acceder alcitosol 9,10. Además, todas estas metodologías están unidas al sustrato y, por lo tanto, se limitan a cultivos celulares in vitro, o a células superficiales externas, sin acceso a células que están dentro de un tejido tridimensional (3D).
Optogenetics11 se utiliza ampliamente para abordar estas limitaciones 3D e in vivo. Sin embargo, los métodos optogenéticos se basan en las perturbaciones de los canales iónicos de membrana plasmática activados por la luz que se distribuyen en la membrana plasmática, limitando la resolución espacial 3D12 y las capacidades intracelulares.
Recientemente hemos demostrado que los nanohilos de silicio (SiNW) se pueden utilizar para realizar interrogaciones bioeléctricas intracelulares con resolución espacial submicrónico con diferentes células no excitables, a saber, miofibroblastos cardíacos y oligodendrocitos13. Por otra parte, utilizamos estos SINW para realizar interrogatorios específicos de células ex-vivo dentro de un tejido cardíaco 3D, para investigar cómo las células cardíacas se acoplan eléctricamente in vivo14. Una de las principales ventajas de esta metodología es su simplicidad; no requiere ninguna modificación genética o instrumentación voluminosa. Muchas células internalizarán espontáneamente siNWs foto-sensibles sin necesidad de sonicación o electroporación15. Además, escaparán espontáneamente de la encapsulación endosomal y formarán una integración perfecta con el citosol y los orgánulos intracelulares13,15. Estos compuestos cell-SiNWs, llamados híbridos de silicio celular, poseen la naturaleza dinámica, suave y versátil de la célula original, así como las capacidades optoeléctricas de los SiNW. Después de la hibridación, el híbrido cell-SiNW se puede cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y se utiliza para diversas aplicaciones como la estimulación bioeléctrica intracelular; estudio del acoplamiento bioeléctrico intercelular in vitro; y para el interrogatorio específico de la célula in vivo. Como una estimulación eficaz requiere la co-localización de altas densidades de potencia óptica y SiNWs, se puede lograr una alta resolución espacial tanto en 2D como en 3D. En este protocolo describimos en detalle la metodología, así como cómo se pueden analizar los resultados. El enfoque se centra en la investigación intra e intercelular in vitro, pero la implementación in vivo de esta metodología puede ser utilizada directamente para muchos otros escenarios biológicos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Los miofibroblastos pueden internalizar espontáneamente nanohilos de silicio (SiNW), lo que los convierte en un objetivo atractivo para aplicaciones bioelectrónicas. Estos híbridos de silicio celular ofrecen capacidades de modulación óptica sin plomo con una perturbación mínima para el comportamiento normal de las células. Las capacidades ópticas se obtienen por las propiedades fototérmicas y fotoeléctricas de los SINW. Estos híbridos se pueden cosechar utilizando técnicas estándar de cultivo de tejidos y luego aplicarse a diferentes escenarios biológicos. Aquí demostramos cómo estos híbridos se pueden utilizar para estudiar el acoplamiento eléctrico de las células cardíacas y comparar cómo los miofibroblastos se unen entre sí o para cardiomiocitos. Este proceso se puede realizar sin equipo especial más allá de un microscopio fluorescente con línea láser acoplada. También se muestra el uso de una rutina MATLAB personalizada que permite la cuantificación de la propagación del calcio dentro y entre las diferentes células en el cultivo. Se ha demostrado que los miofibroblastos tienen una respuesta eléctrica más lenta que la de los cardiomiocitos. Además, la propagación intercelular miofibroblasto muestra velocidades ligeramente más lentas, aunque comparables a sus velocidades intracelulares, lo que sugiere la propagación pasiva a través de uniones de separación o nanotubos. Esta técnica es altamente adaptable y se puede aplicar fácilmente a otras arenas celulares, tanto para investigaciones in vitro como in vivo o ex vivo.

La capacidad de esta metodología para permitir el acceso directo al citosol intracelular depende de la internalización espontánea del SiNW en las células. Aunque los SINW se someterán a una internalización espontánea en muchos tipos celulares15,algunas células, como los cardiomiocitos y las neuronas, necesitarán que los SINW sean tratados para permitir su internalización19. En este protocolo describimos el proceso de internalización de los SiNW p-i-n con un diám...

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Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Este protocolo describe el uso de nanohilos de silicio para la biomodulación óptica intracelular de la célula en un método simple y fácil de realizar. La técnica es altamente adaptable a diversos tipos de células y se puede utilizar para aplicaciones in vitro e in vivo.

Nanohilos de silicio y estimulación óptica para investigaciones de acoplamiento eléctrico intra e intercelular

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Esta técnica permite el interrogatorio bioeléctrico intracelular con una resolución espacial extremadamente alta y especificidad celular utilizando sólo microscopía óptica estándar. Este método facilita la estimulación y el interrogatorio eléctrico de las células y ubicaciones específicas dentro de las células y se puede realizar in vitro, así como en preparaciones de tejido ex vivo 3D. Esta técnica permite la investigación biotécnica de muchas arenas celulares como células cardíacas o cerebrales, así como la comunicación eléctrica entre todas nuestras células no excitables.Para aislar los miofibroblastos de una suspensión cardiomiocitos de miofibroblasto, pre-placa las células aisladas en una placa de cultivo de tejido de 100 milímetros durante una hora, ya que los cardiomiocitos necesitan una superficie de fibra cubierta y tratada para adherirse. Al final de la incubación, recoger el cardiomiocito enriquecido que contiene sobrenadante para el co-cultivo aguas abajo. Enjuague los miofibroblastos con DMEM para eliminar los cardiomiocitos restantes y alimentar las células con un medio de cultivo fresco antes de dos a cuatro días adicionales de incubación.Cuando las células alcancen el 80% de confluencia, utilice un escriba de diamante para cortar un chip de tres por tres milímetros de una oblea con nanohilos de silicio cultivados por deposición de vapor químico. Y usa fórceps afilados para enjuagar las virutas en 70%etanol. Después del enjuague, seque al aire las virutas durante 30 minutos bajo la luz ultravioleta en una campana de flujo laminar de biosegura, antes de transferir las virutas a un tubo de micro centrífuga estéril.Utilice un enjuague completo del medio de cultivo celular para eliminar cualquier etanol restante, antes de sonicar las virutas en un mililitro de medio de cultivo fresco en un baño de sonicación durante uno a 10 minutos. El sobrenadante debe nublarse a medida que se liberan los nanohilos. Mezcle la suspensión de nanohilos de silicio en cinco mililitros de medio de cultivo fresco y sembrar la solución de nanoalimbramiento en el plato de los miofibroblastos.Después de cuatro horas en la incubadora de cultivo celular, enjuague el plato cinco veces con un medio de cultivo fresco para eliminar los nanohilos noenterizados y continúe incubando las células durante otra hora para permitir que los nanohilos parcialmente internalizados se incorporen completamente. A continuación, agregue 500 microlitros de solución de recubrimiento de colágeno recién preparada a un plato inferior de vidrio de 35 milímetros. Después de una hora de incubación a 37 grados centígrados, enjuague el plato con PBS estéril y cosecha los híbridos de miofibroblast de nanocólica de silicio, con tres mililitros de trippsina, durante dos minutos a 37 grados centígrados.Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con 10 mililitros de medio de cultivo, enjuague vigorosamente por pipeteo y no centrifugar más de 200 G para evitar dañar las células. Luego vuelva a suspender los pellets de células híbridas en un mililitro de medio fresco, y sembrar las células en el plato inferior de vidrio recubierto de colágeno. Para verificar la internalización del nanofondo, etiquete las células con citosol fluorescente y tintes de membrana, de acuerdo con los protocolos estándar, y utilice un microscopio confocal para tomar imágenes de las células.Como los nanohilos de silicio son altamente reflectantes, se puede utilizar luz reflejada en lugar de fluorescencia para su visualización. Para establecer un co-cultivo de cardiomiocitos híbrido de nanohilo de silicio miofibroblasto, sembrar el número adecuado de cada tipo de célula en un plato inferior de vidrio recubierto de colágeno. Y cultivo de las células a 37 grados Celsius durante 48 horas, para permitir que las células formen uniones de brecha intercelular.El día del experimento, reemplace el sobrenadante de cultivo por un mililitro de medio de cultivo complementado con un tinte sensible al calcio recién preparado, para una incubación de 20 a 30 minutos a 37 grados centígrados. Al final de la incubación, lave la placa dos veces con PBS estéril, antes de tratar las células con un mililitro de DMEM libre de rojo fenol precalentó. Luego permita que el tinte de calcio intracelular se someta a des-esterificación durante 30 minutos a 37 grados Celsius, antes de adquirir imágenes basales.Antes de la toma de imágenes ópticas y la estimulación, precalentar una micro-incubadora humidificada en un microscopio con una línea láser colimada acoplada en la trayectoria de la luz, para la toma de imágenes de calcio y la estimulación óptica a 37 grados Celsius y una mezcla de dióxido de carbono de la era de la burbuja del 5%. Cuando el microscopio esté listo, coloque el co-cultivo híbrido de miofibroblastos en la micro incubadora y visualice los nanohilos mediante microscopía de campo brillante para localizar un sitio de estimulación adecuado. Cuando se haya identificado un sitio, vuelva a configurar la trayectoria de la luz en el modo de fluorescencia, manteniendo el punto de estimulación en la ubicación predefinida del nanoeléducido, y valide la potencia de estimulación óptima y la longitud del pulso, para cada tamaño de nanohilo de silicio y tipo de célula.Adquiera un registro de dos a diez segundos de la actividad basal de calcio intracelular, antes de estimular el nanoamátro con un solo pulso láser de uno a 10 melowatts de potencia y una duración de uno a 10 milisegundos, registrando la onda de calcio resultante durante otros dos a 10 segundos. Al final del experimento transfiera las películas grabadas de la estimulación óptica al programa de software adecuado, para un análisis adicional. Utilizando la óptica de contraste de fase estándar, las células de confluencia se ven fácilmente mediante microscopía de luz.Los nanohilos de silicio, sin embargo, apenas son visibles, haciendo que sus ubicaciones sean imposibles de definir por este método. La super imposición de imágenes de campo claro y oscuro, sin embargo, permite la visualización de la disposición nuclear Perry de los nanohilos de silicio reflectante de luz. La microscopía confocal se puede utilizar para visualizar membranas de citosol y plasma manchadas por marcadores fluorescentes, haciendo que la ubicación intracelular de los nanohilos de silicio sea más evidente.Usando la microscopía estándar, se puede obtener una imagen de campo brillante para identificar la ubicación del nanohilo de silicio que se va a estimular. A continuación, se puede obtener un breve vídeo de referencia de los cardiomiocitos que golpean espontáneamente y los miofibroblastos en reposo. Después de la estimulación, se puede registrar la propagación del calcio dentro del co-cultivo.El tiempo en el que las diferentes células se excitan puede ser determinado por el punto en el que el cambio en el flujo óptico promedio alcanza su máximo. El flujo óptico se puede calcular para ayudar en la identificación del tiempo de activación dentro de cada región de celda. Las velocidades intracelulares se pueden determinar para cada célula utilizando gráficos de Khaimah, con la pendiente de la línea que representa la inversa de la velocidad de propagación intracelular.Por ejemplo, aquí, se puede observar un resumen de las diferentes velocidades inter e intracelulares medidas para las interacciones celulares dentro de un único co-cultivo. Este método se puede utilizar para estudios in vivo inyectando la célula híbridos de silicio directamente en el tejido y utilizando preparaciones ex vivo 3D para estudiar la compañía eléctrica in vivo.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Funcionalización suaves litográfica y Patrones libre de óxido de silicio y el germanio

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Investigación

Bioingeniería

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Colocación de sondas biológicas de biosensores ópticos de silicio mediante agentes de acoplamiento de silano

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Los tejidos de ingeniería músculo esquelético de células mioblastos murinos progenitoras y aplicación de estimulación eléctrica

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