Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Detta arbete stöds av flygvapnets kontor för vetenskaplig forskning (AFOSR FA9550-18-1-0503).

För att säkerställa överensstämmelse med etiska normer godkändes först alla djurprocedurer relaterade till att isolera kardiomyocyter från gnagarehjärtan av University of Chicago Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Dessutom genomfördes alla djurförsök i fullständig enlighet med vägledning från University of Chicago IACUC.
1. Beredning av cell-SiNWs hybrider
<ol><li>Isolera primära kardiomyocyter (CMs) med hjälp av en kommersiell kit efter tillverkarens riktlinje...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

Vi har här visat ett enkelt sätt att utföra intracellulär elektrisk stimulering av celler. I denna demonstration använde vi MFs som prehybridized med SiNWs, sedan samkulturerade med CMs. I allmänhet har de flesta prolifereringsceller tendensen att internalisera SiNWs, vilket möjliggör användning av denna metodik med många andra celltyper. Dessutom, medan vi visat den intracellulära stimulering av celler, kan samma principer användas för att utföra extracellulära stimulering av celler. Detta kan göras geno...

Alla biologiska organismer använder elektricitet, i form av joner, för att reglera det cellulära beteendet. Cellmembran innehåller olika typer av specifika jonkanaler som möjliggör passiv och aktiv transport av joner. Dessa joner styr funktionerna i retbara celler, såsom neuronal aktivitet och skelett och hjärt muskel kontraktilitet. Bioelektricitet spelar dock också en viktig roll i icke-retbara celler, som styr många cellulära funktioner såsom cellproliferation1, neuroimmunity2,3,4, och stamcellsdifferentiering5.
Under de senaste decennierna har området bioelektricitet dragit ett ökande intresse, vilket har bidragit till utvecklingen av ett flertal tekniker för bioelektroniska gränssnitt. Mikroelektrod patch pipetter är guldmyntfoten för intracellulär inspelning och stimulering6. I denna metodik dras en glaspipett under särskilda förhållanden för att bilda en skarp kant med en porstorlek på få mikrometer. Denna pipetten är fylld med en buffert och pipetten möjliggör direktkontakt av bufferten med den intracellulära volymen. Detta resulterar i ett bioelektriskt gränssnitt som ger extremt hög signal till brusförhållanden, exakt kontroll över cellulär elektrisk aktivitet och extremt hög temporal upplösning. Även om denna metod är ett extremt kraftfullt verktyg, som nyligen var nedskalad till en nano-pipetkonfiguration7, är det förknippat med flera viktiga tekniska begränsningar. Cytosolspädningseffekten8, liksom mekaniska vibrationer, begränsar dess nytta till kortfristiga förhör, och det kräver dyr specialiserad utrustning och en hög nivå av teknisk skicklighet. Dessutom begränsar dess skrymmande antalet celler som kan registreras eller stimuleras samtidigt, och på grund av dess invasivitet, det kan inte konfigureras under ett experiment. För att övervinna dessa begränsningar utvecklades mikroelektroder, men storleken på elektroderna begränsar den rumsliga upplösningen samt intracellulär åtkomst. Nanoelektroderrayer tillåter intracellulär inspelning och stimulering men kräver slipande elektroporation för att komma åt cytosol9,10. Dessutom är alla dessa metoder substratbundna och är därmed begränsade till in vitro-cellkulturer, eller till externa ytliga celler, utan tillgång till celler som finns inuti en 3-dimensionell (3D) vävnad.
Optogenetics11 används ofta för att ta itu med dessa 3D och in vivo begränsningar. Optogenetiska metoder är dock baserade på de perturbations av ljusaktiverade plasmamembran jonkanaler som distribueras vid plasmamembranet, begränsa 3D spatial upplösning12 och intracellulära kapacitet.
Vi har nyligen visat att kisel nanotrådar (SiNWs) kan användas för att utföra intracellulära bioelektriska förhör med submicron rumslig upplösning med olika icke-retbara celler, nämligen hjärt myofibroblasts och oligodendrocytes13. Dessutom använde vi dessa SiNWs att utföra ex-vivo cell specifika förhör inom en 3D-hjärt vävnad, att undersöka hur hjärtceller elektriskt par in vivo14. En stor fördel med denna metodik är dess enkelhet; det inte kräver någon genetisk modifiering eller skrymmande instrumentering. Många celler kommer spontant internalisera foto-lyhörda SiNWs med inget behov av ultraljudsbehandling eller elektroporation15. Dessutom kommer de att spontant fly den endosomala inkapsling och bilda en sömlös integration med cytosol och intracellulära organeller13,15. Dessa cell-SiNWs kompositer, kallas cell-kisel hybrider, besitter den dynamiska, mjuka och mångsidiga karaktär ursprungliga cellen, liksom optoelektriska kapacitet SiNWs. Efter hybridisering kan cell-SiNW hybrid skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och används för olika tillämpningar såsom intracellulära bioelektrisk stimulering; studera intercellulär bioelektrisk koppling in vitro; och för in vivo cell specifika förhör. Som en effektiv stimulering kräver samlokalisering av hög optisk effekt tätheter och SiNWs, kan man uppnå hög rumslig upplösning både i 2D och 3D. I detta protokoll beskriver vi i detalj metodiken, samt hur resultaten kan analyseras. Fokus läggs på den intra- och intercellulära undersökningen in vitro, men in vivo-implementeringen av denna metodik kan direkt utnyttjas för många andra biologiska scenarier.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Myofibroblasts kan spontant internalisera kisel nanotrådar (SiNWs), vilket gör dem till ett attraktivt mål för bioelektroniska applikationer. Dessa cell-kisel hybrider erbjuder blyfri optisk modulering kapacitet med minimala perturbation till normala cell beteende. De optiska funktionerna erhålls genom sinws fototermiska och fotoelektriska egenskaper. Dessa hybrider kan skördas med hjälp av standard vävnadskultur tekniker och sedan tillämpas på olika biologiska scenarier. Vi visar här hur dessa hybrider kan användas för att studera elektrisk koppling av hjärtceller och jämföra hur myofibroblasts par till varandra eller till kardiomyocyter. Denna process kan åstadkommas utan specialutrustning bortom ett fluorescerande mikroskop med kopplade laserlinjen. Också visas är användningen av en specialbyggd MATLAB rutin som gör att kvantifiering av kalcium förökning inom och mellan de olika cellerna i kulturen. Myofibroblasts visas ha en långsammare elektrisk respons än cardiomyocytes. Dessutom visar den myofibroblast intercellulära förökningen något långsammare, men jämförbara hastigheter till deras intracellulära hastigheter, vilket tyder på passiv förökning genom gap korsningar eller nanorör. Denna teknik är mycket anpassningsbar och kan enkelt tillämpas på andra cellulära arenor, för in vitro samt in vivo eller ex vivo undersökningar.

Förmågan hos denna metodik att tillåta direkt tillgång till den intracellulära cytosolen beror på den spontana internaliseringen av SiNW i cellerna. Även SiNWs kommer att genomgå spontan internalisering i många celltyper15, vissa celler, såsom kardiomyocyter och nervceller, kommer att behöva siNWs som skall behandlas för att deras internalisering19. I detta protokoll vi beskriva internalisering processen för p-i-n SiNWs med 200-300 nm diameter och ~ 1-3 μm lå...

Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Detta protokoll beskriver användningen av kisel nanotrådar för intracellulära optisk bio-modulering av cell i en enkel och lätt att utföra metod. Tekniken är mycket anpassningsbar till olika celltyper och kan användas för in vitro- såväl som in vivo-applikationer.

Kiselnanotrådar och optisk stimulering för undersökningar av intra- och intercellulär elektrisk koppling

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Denna teknik tillåter intracellulära bioelektriska förhör med extremt hög rumsliga upplösning och cell specificitet med endast standard optisk mikroskopi. Denna metod underlättar stimulering och elektriska förhör av celler och specifika platser inom cellerna och kan utföras in vitro samt i 3D ex vivo vävnadspreparat. Denna teknik möjliggör bio-elektronisk undersökning av många cellulära arenor såsom hjärt-eller hjärnceller, samt den elektriska kommunikationen mellan alla våra icke-retbara celler.För att isolera myofibroblasts från en myofibroblast kardiomyocyte suspension, pre-plate de isolerade cellerna på en 100 millimeter vävnad kultur skålen i en timme, som kardiomyocyter behöver en fiber hals och behandlade yta att hålla. Vid slutet av inkubationen, samla den berikade kardiomyocyte som innehåller supernatant för nedströms samkultur. Skölj myofibroblasts med DMEM för att eliminera eventuella återstående kardiomyocyter och mata cellerna med färskt odlingsmedium före ytterligare två till fyra dagars inkubation.När cellerna når 80%konfluency, använd en diamant skrivare för att skära en tre med tre millimeter chip från en wafer med kemisk ånga deposition-odlade kisel nanotrådar. Och använd skarpa tpåts för att skölja chipsen i 70%etanol. Efter sköljning lufttorka flisorna i 30 minuter under ultraviolett ljus i en bio-säkerhet laminär flöde huva, innan du överför flis till en steril mikro centrifug röret.Använd en komplett cellkultur medium skölj för att ta bort eventuella återstående etanol, innan sonicating chips i en milliliter av färsk kultur medium i en ultraljudsbehandling bad i en till 10 minuter. Supernatanten bör bli grumlig när nanotrådarna släpps ut. Blanda Silicon nanowire suspension i fem milliliter av färsk kultur medium och utsäde nano trådlösning på skålen av myofibroblasts.Efter fyra timmar i cellodlingen inkubator, skölj skålen fem gånger med färsk kultur medium för att ta bort alla ointernaliserade nanotrådar och fortsätta att inkubera cellerna i ytterligare en timme för att tillåta någon delvis internaliserade nanotrådar att helt införlivas. Nästa lägga 500 mikroliter av nyberedda kollagenbeläggning lösning till en 35 millimeters glas botten skålen. Efter en timmes inkubation vid 37 grader Celsius, skölj skålen med steril PBS och skörda Silicon nanowire myofibroblast hybrider, med tre milliliter trypsin, i två minuter vid 37 grader Celsius.När cellerna har lossnat, stoppa reaktionen med 10 milliliter odlingsmedium, skölj kraftigt genom pipettering och centrifuger inte över 200 G för att undvika att skada cellerna. Sedan åter upphäva hybrid cell pellets i en milliliter färskt medium, och utsäde cellerna på kollagen belagda glas botten skålen. För att verifiera nanotråd internalisering, märka cellerna med fluorescerande cytosol och membranfärgämnen, enligt standardprotokoll, och använda ett konfokalmikroskop för att avbilda cellerna.Som kisel nanotrådar är mycket reflekterande, reflekterat ljus kan användas i stället för fluorescens för deras visualisering. För att ställa in en myofibroblast kisel nanowire hybrid kardiomycyt kokultur, utsäde lämpligt antal av varje celltyp på en kollagen belagda glas botten skålen. Och odla cellerna på 37 grader Celsius i 48 timmar, så att cellerna att bilda intercellulära gap korsningar.På dagen för experimentet, ersätta kulturen supernatant med en milliliter av kultur medium kompletteras med nyberedda kalcium känslig färgämne, för en 20 till 30 minuters inkubation vid 37 grader Celsius. Vid slutet av inkubationen, tvätta plattan två gånger med steril PBS, innan du behandlar cellerna med en milliliter av förvörd fenolröd fri DMEM. Låt sedan det intracellulära kalciumfärgämnet genomgå de-esterifiering i 30 minuter vid 37 grader Celsius, innan du förvärvar baslinjebilder.Före optisk avbildning och stimulering, förvärma en fuktad mikroinkubator på ett mikroskop med en kollimerad laserlinje samman i ljusvägen, för kalciumavbildning och optisk stimulering till 37 grader Celsius och en 5%bubbel era koldioxidblandning. När mikroskopet är klart, placera myofibroblast hybrid kardiomycyt co-kultur i mikro inkubatorn och visualisera nanotrådar genom ljusa fältmikroskopi för att lokalisera en lämplig stimulering webbplats. När en plats har identifierats, konfigurera om ljusvägen till fluorescensläge, samtidigt som stimuleringspunkten vid nanotrådens fördefinierade plats bibehålls, och validera den optimala stimuleringseffekten och pulslängden, för varje kiselnanotrådsstorlek och celltyp.Förvärva en två till tio sekunders inspelning av baslinjen intracellulära kalcium aktivitet, innan stimulera nano tråd med en enda laser puls på en till 10 melowatts av makt och en en till 10 millisekunder varaktighet, inspelning den resulterande kalciumvågen i ytterligare två till 10 sekunder. I slutet av experimentet överföra inspelade filmer av den optiska stimulering till lämpligt program programvara, för ytterligare analys. Med hjälp av standardfaskontrastoptik ses sammanflödesceller lätt av ljusmikroskopi.Kisel nanotrådar är dock knappt synliga, vilket gör deras platser omöjliga att definiera med denna metod. Super införandet av ljusa och mörka bilder fält, dock tillåter visualisering av Perry nukleära arrangemang av ljusreflekterande kisel nanotrådar. Confocal mikroskopi kan användas för att visualisera fluorescerande markör färgade cytosol och plasma membran, vilket gör den intracellulära platsen för kisel nanotrådar mer uppenbart.Med hjälp av standardmikroskopi kan en ljus fältbild erhållas för att identifiera platsen för den kiselnanotråd som ska stimuleras. En kort baslinje video av spontant slå kardiomyocyter och vilande myofibroblasts kan sedan förvärvas. Efter stimulering kan kalciumförökningen inom samkulturen registreras.Den tidpunkt då de olika cellerna blir upphetsade kan bestämmas av den punkt där förändringen i genomsnittligt optiskt flöde når sitt maximum. Det optiska flödet kan sedan beräknas till stöd vid identifieringen av tidpunkten för aktiveringen inom varje cellregion. De intracellulära hastigheter kan bestämmas för varje cell med hjälp av Khaimah grafer, med lutningen på linjen som representerar inversen av den intracellulära förökningshastigheten.Till exempel, här, en sammanfattning av de olika inter och intracellulära hastigheter mätt för cellen interaktioner inom en enda samkultur kan observeras. Denna metod kan utnyttjas för in vivo studier genom att injicera cellen Silicon hybrider direkt i vävnaden och använda 3D ex vivo preparat för att studera in vivo elektriska företaget.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Mjuk Litografiska funktionalisering och mönstring oxid-fri Silicon och germanium

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Bifoga Biologiska sönder för att Silica optiska biosensorer med användning av silan Koppling ombud

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Engineering Skelettmuskulatur Vävnader från murinceller myoblast progenitorceller och tillämpning av elektrisk stimulering

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro-syntes av Native, Fibrös Lång avstånd och segment Lång avstånd Kollagen

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optisk detektering av<em&gt; E. coli</em&gt; Bakterier av Mesoporous Silicon Biosensors

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

Porös Silicon Mikropartiklar för leverans av siRNA Therapeutics

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Datortomografi och optisk avbildning av Osteogenesis-angiogenes koppling för att bedöma integration av skallbenet auto och Allografts

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Optisk kontroll av levande celler elektrisk aktivitet av konjugerade polymerer

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Framställning av Silicon Nanowire fälteffekttransistor för kemiska och biosensing applikationer

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Överföring av flera signaler via en optisk fiber Använda Wavefront Shaping

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...