Name: silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling
Uploaded: 2021-01-28T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Bu çalışma Hava Kuvvetleri Bilimsel Araştırma Ofisi (AFOSR FA9550-18-1-0503) tarafından desteklenmiştir.

Etik standartlara uygunluğu sağlamak için, kemirgen kalplerden kardiyomiyositlerin izole edilmesini sağlayan tüm hayvan prosedürleri ilk olarak Chicago Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Ayrıca, tüm hayvan deneyleri Chicago IACUC Üniversitesi'nin rehberliğine uygun olarak yapılmıştır.
1. Hücre-SiNWs melez hazırlanması
<ol><li>Üreticinin yönergelerini izleyerek ticari bir kit kullanarak birincil kardiyomiyositleri (C...

<ol>
	<li>Blackiston, D. J., McLaughlin, K. A., Levin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioelectric+controls+of+cell+proliferation:+ion+channels,+membrane+voltage+and+the+cell+cycle.">Bioelectric controls of cell proliferation: ion channels, membrane voltage and the cell cycle.</a> Cell cycle. 8 (21), 3527-3536 (2009).</li><li>Dantzer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+interactions:+from+the+brain+to+the+immune+system+and+vice+versa.">Neuroimmune interactions: from the brain to the immune system and vice versa.</a> Physiological Reviews. 98 (1), 477-504 (2017).</li><li>Wohleb, E. S., Franklin, T., Iwata, M., Duman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integrating+neuroimmune+systems+in+the+neurobiology+of+depression.">Integrating neuroimmune systems in the neurobiology of depression.</a> Nature Reviews Neuroscience. 17 (8), 497 (2016).</li><li>Veiga-Fernandes, H., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroimmune+regulation+during+intestinal+development+and+homeostasis.">Neuroimmune regulation during intestinal development and homeostasis.</a> Nature Immunology. 18 (2), 116 (2017).</li><li>Sundelacruz, S., Levin, M., Kaplan, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+membrane+potential+in+the+regulation+of+cell+proliferation+and+differentiation.">Role of membrane potential in the regulation of cell proliferation and differentiation.</a> Stem Cell Reviews and Reports. 5 (3), 231-246 (2009).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Reviews Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Jayant, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+intracellular+voltage+recordings+from+dendritic+spines+using+quantum-dot-coated+nanopipettes.">Targeted intracellular voltage recordings from dendritic spines using quantum-dot-coated nanopipettes.</a> Nature Nanotechnology. 12 (4), 335-342 (2017).</li><li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Patch+clamp+techniques+for+studying+ionic+channels+in+excitable+membranes.">Patch clamp techniques for studying ionic channels in excitable membranes.</a> Annual Review of Physiology. 46 (1), 455-472 (1984).</li><li>Xie, C., Lin, Z., Hanson, L., Cui, Y., Cui, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intracellular+recording+of+action+potentials+by+nanopillar+electroporation.">Intracellular recording of action potentials by nanopillar electroporation.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 185-190 (2012).</li><li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertical+nanowire+electrode+arrays+as+a+scalable+platform+for+intracellular+interfacing+to+neuronal+circuits.">Vertical nanowire electrode arrays as a scalable platform for intracellular interfacing to neuronal circuits.</a> Nature Nanotechnology. 7 (3), 180-184 (2012).</li><li>Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+and+application+of+optogenetics.">The development and application of optogenetics.</a> Annual Review of Neuroscience. 34, 389-412 (2011).</li><li>Packer, A. M., Russell, L. E., Dalgleish, H. W., Hausser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+all-optical+manipulation+and+recording+of+neural+circuit+activity+with+cellular+resolution+in+vivo.">Simultaneous all-optical manipulation and recording of neural circuit activity with cellular resolution in vivo.</a> Nature Methods. 12 (2), 140-146 (2015).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silicon+Nanowires+for+Intracellular+Optical+Interrogation+with+Sub-Cellular+Resolution.">Silicon Nanowires for Intracellular Optical Interrogation with Sub-Cellular Resolution.</a> Nano Letters. 20 (2), 1226-1232 (2020).</li><li>Rotenberg, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Living+myofibroblast-silicon+composites+for+probing+electrical+coupling+in+cardiac+systems.">Living myofibroblast-silicon composites for probing electrical coupling in cardiac systems.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 116 (45), 22531-22539 (2019).</li><li>Zimmerman, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+uptake+and+dynamics+of+unlabeled+freestanding+silicon+nanowires.">Cellular uptake and dynamics of unlabeled freestanding silicon nanowires.</a> Science Advances. 2 (12), 1601039 (2016).</li><li>Jiang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nongenetic+optical+neuromodulation+with+silicon-based+materials.">Nongenetic optical neuromodulation with silicon-based materials.</a> Nature protocols. 14 (5), 1339 (2019).</li><li>. dFoFmovie-CatFullAutoSave.java Available from: <a target="_blank" href="https://gist.github.com/ackman678/11155761">https://gist.github.com/ackman678/11155761</a> (2020)</li><li>Rueden, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ImageJ2:+ImageJ+for+the+next+generation+of+scientific+image+data.">ImageJ2: ImageJ for the next generation of scientific image data.</a> BMC Bioinformatics. 18 (1), 5229 (2017).</li><li>Lee, J. -. H., Zhang, A., You, S. S., Lieber, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+internalization+of+cell+penetrating+peptide-modified+nanowires+into+primary+neurons.">Spontaneous internalization of cell penetrating peptide-modified nanowires into primary neurons.</a> Nano Letters. 16 (2), 1509-1513 (2016).</li><li>Lozano, O., Torres-Quintanilla, A., Garc&#237;a-Rivas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicine+for+the+cardiac+myocyte:+where+are+we.">Nanomedicine for the cardiac myocyte: where are we.</a> Journal of Controlled Release. 271, 149-165 (2018).</li><li>Lozano, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoencapsulated+quercetin+improves+cardioprotection+during+hypoxia-reoxygenation+injury+through+preservation+of+mitochondrial+function.">Nanoencapsulated quercetin improves cardioprotection during hypoxia-reoxygenation injury through preservation of mitochondrial function.</a> Oxidative Medicine and Cellular Longevity. 2019, 7683091 (2019).</li><li>Gaudesius, G., Miragoli, M., Thomas, S. P., Rohr, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coupling+of+cardiac+electrical+activity+over+extended+distances+by+fibroblasts+of+cardiac+origin.">Coupling of cardiac electrical activity over extended distances by fibroblasts of cardiac origin.</a> Circulation Researach. 93 (5), 421-428 (2003).</li><li>Klesen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+fibroblasts+:+Active+players+in+(atrial)+electrophysiology.">Cardiac fibroblasts : Active players in (atrial) electrophysiology.</a> Herzschrittmacherther Elektrophysiology. 29 (1), 62-69 (2018).</li><li>He, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-distance+intercellular+connectivity+between+cardiomyocytes+and+cardiofibroblasts+mediated+by+membrane+nanotubes.">Long-distance intercellular connectivity between cardiomyocytes and cardiofibroblasts mediated by membrane nanotubes.</a> Cardiovascular Research. 92 (1), 39-47 (2011).</li><li>Carvalho-de-Souza, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photosensitivity+of+neurons+enabled+by+cell-targeted+gold+nanoparticles.">Photosensitivity of neurons enabled by cell-targeted gold nanoparticles.</a> Neuron. 86 (1), 207-217 (2015).</li><li>Wang, S. -. H., Lee, C. -. W., Chiou, A., Wei, P. -. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Size-dependent+endocytosis+of+gold+nanoparticles+studied+by+three-dimensional+mapping+of+plasmonic+scattering+images.">Size-dependent endocytosis of gold nanoparticles studied by three-dimensional mapping of plasmonic scattering images.</a> Journal of Nanobiotechnology. 8 (1), 33 (2010).</li></ol>

Burada hücrelerin hücre içi elektriksel stimülasyonunu gerçekleştirmenin basit bir yolunu gösterdik. Bu gösteride, SiNW'lerle önceden melezleştirilen, daha sonra CM'lerle birlikte kültürlenmiş MF'ler kullandık. Genel olarak, en çoğalan hücreler siNWs içselleştirme eğilimi var, hangi diğer birçok hücre türleri ile bu metodolojinin kullanımına izin verir. Ayrıca, biz hücrelerin hücre içi stimülasyon gösterdi iken, aynı ilkeler hücrelerin ekstrahücresel stimülasyon gerçekleştirmek için...

Tüm biyolojik organizmalar hücresel davranışı düzenlemek için iyonlar şeklinde elektrik kullanırlar. Hücre zarları iyonların pasif ve aktif taşınmasına izin veren çeşitli spesifik iyon kanalları içerir. Bu iyonlar, nöronal aktivite ve iskelet ve kardiyak kas kontrilliği gibi heyecanlı hücrelerin işlevlerini yönetir. Ancak, biyoelektrik de olmayan uyarılabilir hücrelerde önemli bir rol oynar, hücre çoğalması gibi birçok hücresel fonksiyonları yöneten1, nöroimmünite2,3,4, ve kök hücre farklılaşması5.
Son yıllarda, biyoelektrik alanında biyoelektronik arayüzler için çok sayıda teknolojinin geliştirilmesine katkıda bulunmuştur ilgi giderek artan bir düzeyde çekmiştir. Mikroelektrot yaması pipetleri hücre içi kayıt ve stimülasyon altın standart6. Bu metodolojide, bir cam pipet birkaç mikron bir gözenek boyutu ile keskin bir kenar oluşturmak için belirli koşullar altında çekilir. Bu pipet bir tampon ile doldurulur ve pipet hücre içi hacmi ile tampon doğrudan temas sağlar. Bu gürültü oranları, hücresel elektrik aktivitesi üzerinde hassas kontrol ve son derece yüksek zamansal çözünürlük için son derece yüksek sinyal veren bir biyoelektrik arayüzü ile sonuçlanır. Bu metodoloji son derece güçlü bir araç olmasına rağmen, hangi son zamanlarda bir nano-pipet yapılandırmaindirgendi 7, birkaç önemli teknik sınırlamalar ile ilişkilidir. Sitosol seyreltme etkisi8,yanı sıra mekanik titreşimler, kısa vadeli sorgulamalar için yarar sınırlar, ve pahalı özel ekipman ve teknik beceri yüksek düzeyde gerektirir. Ayrıca, hantallığı aynı anda kaydedilebilen veya uyarılabilen hücre sayısını sınırlar ve invazivliği nedeniyle bir deney boyunca yeniden yapılandırılamaz. Bu sınırlamaları aşmak için mikroelektrot dizileri geliştirilmiştir, ancak elektrotların büyüklüğü hücre içi erişimin yanı sıra uzamsal çözünürlüğü de sınırlar. Nanoelektrot dizileri hücre içi kayıt ve stimülasyon sağlar ama sitosol erişmek için aşındırıcı elektroporasyon gerektirir9,10. Buna ek olarak, tüm bu metodolojiler substrat bağlı ve böylece in vitro hücre kültürleri ile sınırlıdır, ya da dış yüzeysel hücreler, bir 3 boyutlu (3D) doku içinde hücrelere erişim ile.
Optogenetik11 yaygın olarak bu 3D ve in vivo sınırlamaları gidermek için kullanılır. Ancak, optogenetik yöntemler, 3D uzamsal çözünürlük12 ve hücre içi yetenekleri sınırlayan, plazma membran Dağıtılan ışık aktive plazma membran iyon kanallarının tedirginlikdayanmaktadır.
Biz son zamanlarda silikon nanowires (SiNWs) farklı non-excitable hücreleri ile submikron mekansal çözünürlük ile hücre içi biyoelektrik sorgulama gerçekleştirmek için kullanılabilir göstermiştir, yani kardiyak miyofibroblastlar ve oligodendrocytes13. Ayrıca, bu SiNWs bir 3D kardiyak doku içinde ex-vivo hücre spesifik sorgulama gerçekleştirmek için kullanılan, nasıl kardiyak hücrelerin elektriksel olarak vivo14çift araştırmak için . Bu metodolojinin en önemli avantajı sadeliğidir; herhangi bir genetik modifikasyon veya hantal enstrümantasyon gerektirmez. Birçok hücre spontan sonication veya elektroporasyon15gerek kalmadan fotoğraf duyarlı SiNWs içselleştirmek olacaktır. Buna ek olarak, onlar kendiliğinden endozomal kapsülleme kaçış ve sitosol ve hücre içi organeller ile sorunsuz bir entegrasyon oluşturacak13,15. Bu hücre-SiNWs kompozitler, hücre-silikon melez olarak adlandırılan, orijinal hücrenin dinamik, yumuşak ve çok yönlü doğası, yanı sıra SiNWs optoelektrik yeteneklerine sahip. Hibridizasyon sonra, hücre-SiNW hibrid standart doku kültürü teknikleri kullanılarak hasat edilebilir ve hücre içi biyoelektrik stimülasyon gibi çeşitli uygulamalar için kullanılır; in vitro hücreler arası biyoelektrik bağlantı eğitimi; ve in vivo cell özel sorgulama için. Etkili bir stimülasyon yüksek optik güç yoğunlukları ve SiNWs birlikte lokalizasyonu gerektirir gibi, bir 2D ve 3D hem de yüksek mekansal çözünürlük elde edebilirsiniz. Bu protokolde metodolojiyi ve sonuçların nasıl analiz edilebildiğini ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Odak in vitro intra-ve hücreler arası araştırma yerleştirilir, ancak bu metodolojinin in vivo uygulanması doğrudan diğer birçok biyolojik senaryolar için kullanılabilir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:666px;" width="665">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35 mm Glass bottom dishes</td>
			<td style="width:121px;">Cellvis</td>
			<td style="width:161px;">D35-10-0-N</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3i Marianas Spinning Disk Confocal</td>
			<td style="width:121px;">3i</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Calcein-AM</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C1430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CellMask Orange Plasma membrane Stain</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">C10045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Collagen I, rat tail</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1048301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Deluxe Diamond Scribing Pen</td>
			<td style="width:121px;">Ted Pella</td>
			<td style="width:161px;">54468</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10313039</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMSO, Anhydrous</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">D12345</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Falcon Standard Tissue Culture Dishes</td>
			<td style="width:121px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">08-772E</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated,</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10082147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fibronectin Human Protein, Plasma</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">33016015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Fisherbrand 112xx Series Advanced Ultrasonic Cleaner</td>
			<td style="width:121px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:161px;">FB11201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fluo-4, AM, cell permeant</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">F14201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">FluoroBrite DMEM Media</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">A1896701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-Glutamine (200 mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25030081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">OKO full environmental control chamber (constant temperature, humidity and CO2)</td>
			<td style="width:121px;">OKO</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">PBS, pH 7.4</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">10010023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pierce Primary Cardiomyocyte Isolation Kit</td>
			<td style="width:121px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">88281</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:161px;">25200056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

silicon nanowires and optical stimulation for investigations of intra- and intercellular electrical coupling

Miyofibroblastlar kendiliğinden silikon nanowires içselleştirebilirsiniz (SiNWs), onları biyoelektronik uygulamalar için cazip bir hedef yapma. Bu hücre-silikon meleznormal hücre davranışı için en az tedirginlik ile kurşunsuz optik modülasyon yetenekleri sunuyoruz. Optik yetenekler SiNWs fototermal ve fotoelektrik özellikleri ile elde edilir. Bu melezler standart doku kültürü teknikleri kullanılarak hasat edilebilir ve daha sonra farklı biyolojik senaryolara uygulanabilir. Burada bu melezlerin kardiyak hücrelerin elektriksel bağlantılarını incelemek ve miyofibroblastların birbirleriyle ya da kardiyomiyositlerle nasıl çiftleştiğiyle karşılaştırılabildiğini gösteriyoruz. Bu işlem, birleştirilmiş lazer hattı ile floresan mikroskop ötesinde özel ekipman olmadan gerçekleştirilebilir. Ayrıca kültürde farklı hücreler arasında ve içinde kalsiyum yayılımı nicelik sağlar özel olarak inşa MATLAB rutin kullanımı gösterilir. Miyofibroblastların kardiyomiyositlere göre daha yavaş elektriksel yanıtı olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, miyofibroblast hücreler arası yayılımı biraz daha yavaş gösterir, onların hücre içi hızları karşılaştırılabilir hızları rağmen, boşluk kavşakveya nanotüpler ile pasif yayılma düşündürmektedir. Bu teknik son derece uyarlanabilir ve kolayca diğer hücresel arenalara uygulanabilir, in vitro yanı sıra in vivo veya ex vivo araştırmalar için.

Bu metodolojinin hücre içi sitosola doğrudan erişime izin verebilme yeteneği SiNW'nin hücrelere spontan içselleştirmesine bağlıdır. SiNWs birçok hücre tipleri içine spontan içselleştirme geçmesine rağmen15, kardiyomiyosit ler ve nöronlar gibi bazı hücreler, kendi içselleştirme sağlamak için tedavi edilecek SiNWs gerekir19. Bu protokolde p-i-n SiNWs'nin 200-300 nm çapında ve ~1-3 μm uzunluğunda kardiyak MF'lere dahiliyet sürecini açıklıyoruz....

Watch this Scientific Journal Video about Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling at JoVE.com

Silicon Nanowires and Optical Stimulation for Investigations of Intra- and Intercellular Electrical Coupling

Bu protokol, hücre içi optik biyo-modülasyonu için basit ve kolay bir yöntemde silikon nanotellerin kullanımını açıklamaktadır. Bu teknik, çeşitli hücre tiplerine son derece uyarlanabilir ve in vitro ve in vivo uygulamaları için de kullanılabilir.

Silikon Nanowires ve Optik Stimülasyon İç-ve Hücrelerarası Elektrik Kaplin İncelemeler için

Myofibroblasts can spontaneously internalize silicon nanowires (SiNWs), making them an attractive target for bioelectronic applications. These ...

Bu teknik, sadece standart optik mikroskopi kullanarak son derece yüksek uzamsal çözünürlük ve hücre özgüllüğü ile hücre içi biyoelektrik sorgulama sağlar. Bu yöntem, hücrelerin ve hücrelerin belirli yerlerinin uyarılmasını ve elektriksel olarak sorgulanmasını kolaylaştırır ve invitro ve 3Boyutlu ekstrem doku preparatlarında da yapılabilir. Bu teknik, kalp veya beyin hücreleri gibi birçok hücresel arenanın biyo-elektronik incelemesinin yanı sıra tüm heyecansız hücrelerimiz arasındaki elektriksel iletişimi de sağlar.Miyofibroblastkardiyomiyosit süspansiyonundan miyofibroblastları izole etmek için, kardiyomiyositlerin yapışması için fiber boyunlu ve tedavi edilmiş bir yüzeye ihtiyaç duydukları ndan, 100 milimetrelik doku kültür çanamındaki izole hücreleri bir saat önceden plakalayın. Kuluçka sonunda, downstream co-kültür için supernatant içeren zenginleştirilmiş kardiyomiyosit toplamak. Kalan kardiyomiyositleri ortadan kaldırmak ve iki ila dört günlük kuluçkadan önce hücreleri taze kültür ortamıyla beslemek için Miyofibroblastları DMEM ile yıkın.Hücreler %80 birleştiğinde, kimyasal buhar birikimi nevruz lu silikon nanotelleriçeren bir gofretten üç milimetrelik bir çipi kesmek için elmas bir kâtip kullanın. Ve %70 etanolde talaşları durulamak için keskin forceps kullanın. Durulama sonra, steril bir mikro santrifüj tüpü ne çipleri aktarmadan önce, bir biyo-güvenlik laminar akış kaputunda ultraviyole ışık altında 30 dakika boyunca cips kuru.Bir ila 10 dakika boyunca bir sonication banyotaze kültür orta bir mililitre cips sonicating önce, kalan etanol kaldırmak için tam bir hücre kültürü orta durulama kullanın. Nano kablolar serbest bırakılırken supernatant bulutlu dönecektir. Silikon nanofon süspansiyonu beş mililitre taze kültür ortamına karıştırın ve nano tel çözeltisini miyofibroblastların yemeğine tohumlayın.Hücre kültürü kuluçka dört saat sonra, herhangi bir içselleştirilmiş nanowires kaldırmak için taze kültür ortamı ile çanak beş kez durulayın ve herhangi bir kısmen içselleştirilmiş nanowires tamamen dahil edilmesine izin vermek için başka bir saat için hücreleri kuluçkaya devam. Sonraki 35 milimetrecam alt çanak için taze hazırlanmış kollajen kaplama çözeltisi 500 mikrolitre ekleyin. 37 santigrat derece bir saat kuluçka sonra, steril PBS ile çanak durulayın ve Silikon nanowire miyofibroblast melez hasat, tripsin üç mililitre ile, 37 santigrat derece iki dakika için.Hücreler ayrıldığında, 10 mililitre kültür ortamı ile reaksiyonu durdurun, pipetleme ile şiddetle durulanın ve hücrelere zarar vermemek için 200 G'nin üzerinde santrifüj etmeyin. Sonra taze orta bir mililitre hibrid hücre pelet yeniden askıya, ve kollajen kaplı cam alt çanak hücreleri tohum. Nano tel içselleştirmedoğrulamak için, standart protokollere göre floresan sitosol ve membran boyaları ile hücreleri etiketleyin ve hücreleri görüntülemek için bir konfokal mikroskop kullanın.Silikon nanoteller son derece yansıtıcı olduğundan, yansıtılan ışık görselleştirme için floresan yerine kullanılabilir. Bir miyofibroblast silikon nanowire hibrid kardiyomiyosit co-kültür kurmak için, bir kollajen kaplı cam alt çanak üzerine her hücre tipinin uygun sayıda tohum. Ve 48 saat boyunca 37 derecedeki hücreleri kültürlendirin, böylece hücreler hücreler arası boşluk kavşaklarını oluşturabilesin.Deney günü, kültür supernatant kültür supernatant kültür ortamı taze hazırlanmış kalsiyum duyarlı boya ile takviye ile değiştirin, 37 santigrat derecede 20 ila 30 dakikalık kuluçka için. Kuluçka sonunda, önceden ısıtılmış fenol kırmızı serbest DMEM bir mililitre ile hücreleri tedavi etmeden önce, steril PBS ile iki kez plaka yıkayın. Daha sonra hücre içi kalsiyum boyasının temel görüntüleri elde etmeden önce 37 santigrat derecede 30 dakika estersizleşmeye geçmesine izin verin.Optik görüntüleme ve stimülasyondan önce, 37 santigrat dereceye kadar kalsiyum görüntüleme ve optik stimülasyon ve %5 kabarcık dönemi karbondioksit karışımı için ışık yoluna birleştirilmiş bir lazer hattı ile bir mikroskop üzerinde nemlendirilmiş mikro-kuluçka makinesi önceden ısıtın. Mikroskop hazır olduğunda, mikro inkübatör içine miyofibroblast hibrid kardiyomiyosit co-kültür yerleştirin ve uygun bir stimülasyon sitesi bulmak için parlak alan mikroskobu ile nanowires görselleştirmek. Bir site tespit edildiğinde, ışık yolunu floresan moduna yeniden yapılandırın, nano telin önceden tanımlanmış konumundaki stimülasyon noktasını korurken, ve her silikon nanowire boyutu ve hücre tipi için en uygun uyarım gücünü ve darbe uzunluğunu doğrulayın.Nano teli 1 ila 10 melowatt güç ve 1 ila 10 milisaniyelik tek bir lazer darbesi ile uyarmadan önce, başlangıç noktası hücre içi kalsiyum aktivitesinin 2-10 saniyelik kaydını elde edin ve elde edilen kalsiyum dalgasını 2 ila 10 saniye daha kaydedin. Denemenin sonunda ek analiz için optik stimülasyonun kaydedilmiş filmlerini uygun yazılım programına aktarın. Standart faz kontrast optik kullanılarak, birleştiği hücreler ışık mikroskobu ile kolayca görüntülenebilir.Silikon nanoteller, ancak, ancak görünür, konumlarını imkansız bu yöntemle tanımlamak için yapım. Ancak, Açık ve koyu alan görüntülerinin süper dayatma, ışık yansıtıcı silikon nanowires Perry nükleer düzenleme görselleştirme sağlar. Konfokal mikroskopi floresan marker lekeli sitosol ve plazma membranları görselleştirmek için kullanılabilir, silikon nanowires hücre içi konumu daha belirgin hale.Standart mikroskopi kullanılarak, uyarılması gereken silikon nanofonun yerini belirlemek için parlak bir alan görüntüsü elde edilebilir. Spontan dayak kardiyomiyositler ve istirahat miyofibroblastlar kısa bir temel video daha sonra elde edilebilir. Stimülasyondan sonra, ortak kültür içinde kalsiyum yayılımı kaydedilebilir.Farklı hücrelerin heyecanlandığı zaman, ortalama optik akıştaki değişimin maksimuma ulaştığı noktaya göre belirlenebilir. Optik akış daha sonra her hücre bölgesi içinde aktivasyon zamanının belirlenmesine yardımcı olmak için hesaplanabilir. Hücre içi hızlar khaimah grafikleri kullanılarak her hücre için belirlenebilir, hücre içi yayılma hızıters temsil eden çizginin eğimi ile.Örneğin, burada, tek bir ortak kültür içindeki hücre etkileşimleri için ölçülen farklı hücre içi ve hücre içi hızların bir özeti görülebilir. Bu yöntem in vivo elektrik şirketi çalışma için hücre Silikon melezdoğrudan dokuya enjekte ve 3D ex vivo preparatları kullanarak in vivo çalışmalar için kullanılabilir.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Soft Lithographic Functionalization and Patterning Oxide-free Silicon and Germanium

Yumuşak Litografik işlevsellik ve Desenlendirme Oksit Silisyum ve germanyum

The development of hybrid electronic devices relies in large part on the integration of (bio)organic materials and inorganic semiconductors through a ...

Attaching Biological Probes to Silica Optical Biosensors Using Silane Coupling Agents

Silan Kaplin Ajanlar kullanarak Silika Optik Biyosensörler için Biyolojik Probları takılması

In order to interface with biological environments, biosensor platforms, such as the popular Biacore system (based on the Surface Plasmon Resonance (SPR) ...

Engineering Skeletal Muscle Tissues from Murine Myoblast Progenitor Cells and Application of Electrical Stimulation

Elektrik Stimülasyonu murin myoblast Progenitör Hücreler ve Uygulama Mühendislik İskelet Kası Dokular

Engineered muscle tissues can be used for several different purposes, which include the production of tissues for use as a disease model in vitro, e.g. to ...

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

In vitro Synthesis of Native, Fibrous Long Spacing and Segmental Long Spacing Collagen

Yerli, Fibröz Uzun Aralığı ve Bölümlere Uzun Aralığı Kollajen in vitro sentezi olarak

Collagen fibrils are present in the  extracellular matrix of animal tissue to provide structural scaffolding and  mechanical strength. These native ...

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optical Detection of E. coli Bacteria by Mesoporous Silicon Biosensors

Optik Algılama<em&gt; E. coli</emMezopor Silikon Biyosensörlerin tarafından&gt; Bakteri

A label-free optical biosensor based on a nanostructured porous Si is designed for rapid capture and detection of Escherichia coli K12 bacteria, as a ...

Porous Silicon Microparticles for Delivery of siRNA Therapeutics

SiRNA Therapeutics teslimi için Gözenekli Silikon Mikropartiküller

Small interfering RNA (siRNA) can be used to suppress gene expression, thereby providing a new avenue for the treatment of various diseases. However, the ...

Computed Tomography and Optical Imaging of Osteogenesis-angiogenesis Coupling to Assess Integration of Cranial Bone Autografts and Allografts

Bilgisayarlı Tomografi ve Osteogenezi-anjiyogenez bağlamalar Optik Görüntüleme Kranial Kemik Otogreftlerin ve allogreft Entegrasyon değerlendirmek için

A major parameter determining the success of a bone-grafting procedure is vascularization of the area surrounding the graft. We hypothesized that ...

Optical Control of Living Cells Electrical Activity by Conjugated Polymers

Konjuge Polimerler tarafından Hücreler Elektrik Etkinliği Yaşam Optik Kontrol

Hybrid interfaces between organic semiconductors and living tissues represent a new tool for in-vitro and in-vivo applications. In particular, conjugated ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Kimya ve Biyoalgılayıcı Uygulamaları için Silikon Nanotel Alan etkili Transistör hazırlanması

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Transmission of Multiple Signals through an Optical Fiber Using Wavefront Shaping

Wavefront Şekillendirme kullanarak bir Fiber Optik aracılığıyla Çoklu Sinyalleri İletim

The transmission of multiple independent optical signals through a multimode fiber is accomplished using wavefront shaping in order to compensate for the ...