Name: preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes
Uploaded: 2020-07-30T14:45:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes at JoVE.com

Författarna vill tacka Michael Solga och resten av Flow Cytometry Core-personalen för att ha tillhandahållit flödescytometriutbildning och tjänster. Författarna vill också erkänna Shiva Sai Krishna Dasa, Dustin K. Bauknight, Melissa A. Marshall, James C. Garmey, Chantel McSkimming, Aditi Upadhye och Prasad Srikakulapu för deras hjälp med liposomberedning (SSKD, DKB), vävnadsskördar (MAM, JCG) och flödescytometrifärgning och provförvärv (AU, PS, CM). Detta arbete stöddes av bidrag från AstraZeneca, R01HL 136098, R01HL 141123 och R01HL 148109, AHA 16PRE30770007 och T32 HL007284.

<ol>
	<li>Allen, T. M., Cullis, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liposomal+drug+delivery+systems:+from+concept+to+clinical+applications.">Liposomal drug delivery systems: from concept to clinical applications.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 65 (1), 36-48 (2013).</li><li>Sercombe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+and+Challenges+of+Liposome+Assisted+Drug+Delivery.">Advances and Challenges of Liposome Assisted Drug Delivery.</a> Frontiers in Pharmacology. 6, 286 (2015).</li><li>Osinski, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+liposomal+delivery+of+PPAR&#945;/&#947;+dual+agonist+tesaglitazar+in+a+model+of+obesity+enriches+macrophage+targeting+and+limits+liver+and+kidney+drug+effects.">In vivo liposomal delivery of PPAR&#945;/&#947; dual agonist tesaglitazar in a model of obesity enriches macrophage targeting and limits liver and kidney drug effects.</a> Theranostics. 10 (2), (2020).</li><li>Bauknight, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+thorough+tissue+and+cellular+level+characterization+of+targeted+drugs+in+the+evaluation+of+pharmacodynamic+effects.">Importance of thorough tissue and cellular level characterization of targeted drugs in the evaluation of pharmacodynamic effects.</a> PLoS ONE. 14 (11), (2019).</li><li>Rosales, C., Uribe-Querol, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phagocytosis:+A+Fundamental+Process+in+Immunity.">Phagocytosis: A Fundamental Process in Immunity.</a> BioMed Research International. , (2017).</li><li>He, H., Ghosh, S., Yang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanomedicines+for+dysfunctional+macrophage-associated+diseases.">Nanomedicines for dysfunctional macrophage-associated diseases.</a> Journal of Controlled Release. 247, 106-126 (2017).</li><li>Song, G., Petschauer, J. S., Madden, A. J., Zamboni, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoparticles+and+the+mononuclear+phagocyte+system:+pharmacokinetics+and+applications+for+inflammatory+diseases.">Nanoparticles and the mononuclear phagocyte system: pharmacokinetics and applications for inflammatory diseases.</a> Current Rheumatology Reviews. 10 (1), 22-34 (2014).</li><li>Litzinger, D. C., Buiting, A. M. J., van Rooijen, N., Huang, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+liposome+size+on+the+circulation+time+and+intraorgan+distribution+of+amphipathic+poly(ethylene+glycol)-containing+liposomes.">Effect of liposome size on the circulation time and intraorgan distribution of amphipathic poly(ethylene glycol)-containing liposomes.</a> BBA - Biomembranes. , (1994).</li><li>Su, C., Liu, Y., He, Y., Gu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analytical+methods+for+investigating+in+vivo+fate+of+nanoliposomes:+A+review.">Analytical methods for investigating in vivo fate of nanoliposomes: A review.</a> Journal of Pharmaceutical Analysis. , (2018).</li><li>Vasquez, K. O., Casavant, C., Peterson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+whole+body+biodistribution+of+fluorescent-labeled+agents+by+non-invasive+tomographic+imaging.">Quantitative whole body biodistribution of fluorescent-labeled agents by non-invasive tomographic imaging.</a> PLoS One. 6 (6), 20594 (2011).</li><li>Larmann, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+fluorescence-mediated+tomography+for+quantification+of+urokinase+receptor-dependent+leukocyte+trafficking+in+inflammation.">In vivo fluorescence-mediated tomography for quantification of urokinase receptor-dependent leukocyte trafficking in inflammation.</a> Anesthesiology. 113 (3), 610-618 (2010).</li><li>Feng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clodronate+liposomes+improve+metabolic+profile+and+reduce+visceral+adipose+macrophage+content+in+diet-induced+obese+mice.">Clodronate liposomes improve metabolic profile and reduce visceral adipose macrophage content in diet-induced obese mice.</a> PLoS One. 6 (9), 1-11 (2011).</li><li>Bu, L., Gao, M., Qu, S., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intraperitoneal+injection+of+clodronate+liposomes+eliminates+visceral+adipose+macrophages+and+blocks+high-fat+diet-induced+weight+gain+and+development+of+insulin+resistance.">Intraperitoneal injection of clodronate liposomes eliminates visceral adipose macrophages and blocks high-fat diet-induced weight gain and development of insulin resistance.</a> The AAPS Journal. 15 (4), 1001-1011 (2013).</li><li>Toita, R., Kawano, T., Murata, M., Kang, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anti-obesity+and+anti-inflammatory+effects+of+macrophage-targeted+interleukin-10-conjugated+liposomes+in+obese+mice.">Anti-obesity and anti-inflammatory effects of macrophage-targeted interleukin-10-conjugated liposomes in obese mice.</a> Biomaterials. 110, 81-88 (2016).</li><li>Sakurai, Y., Kajimoto, K., Hatakeyama, H., Harashima, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+an+active+and+passive+targeting+to+tumor+and+adipose+tissues.">Advances in an active and passive targeting to tumor and adipose tissues.</a> Expert Opin Drug Deliv. 12 (1), 41-52 (2015).</li><li>Nakhlband, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combating+atherosclerosis+with+targeted+nanomedicines:+Recent+advances+and+future+prospective.">Combating atherosclerosis with targeted nanomedicines: Recent advances and future prospective.</a> BioImpacts. , (2018).</li><li>Sibuyi, N. R. S., Meyer, M., Onani, M. O., Skepu, A., Madiehe, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vascular+targeted+nanotherapeutic+approach+for+obesity+treatment.">Vascular targeted nanotherapeutic approach for obesity treatment.</a> International Journal of Nanomedicine. , (2018).</li><li>Honig, M. G., Hume, R. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+carbocyanine+dyes+allow+living+neurons+of+identified+origin+to+be+studied+in+long-term+cultures.">Fluorescent carbocyanine dyes allow living neurons of identified origin to be studied in long-term cultures.</a> Journal of Cell Biology. , (1986).</li><li>Warren, J. S. A., Feustel, P. J., Lamar, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Combined+Use+of+Tail+Vein+Metastasis+Assays+and+Real-Time+In+Vivo+Imaging+to+Quantify+Breast+Cancer+Metastatic+Colonization+and+Burden+in+the+Lungs.">Combined Use of Tail Vein Metastasis Assays and Real-Time In Vivo Imaging to Quantify Breast Cancer Metastatic Colonization and Burden in the Lungs.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2019).</li><li>Dasa, S. S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plectin-targeted+liposomes+enhance+the+therapeutic+efficacy+of+a+PARP+inhibitor+in+the+treatment+of+ovarian+cancer.">Plectin-targeted liposomes enhance the therapeutic efficacy of a PARP inhibitor in the treatment of ovarian cancer.</a> Theranostics. , (2018).</li><li>Morrison, B. E., Park, S. J., Mooney, J. M., Mehrad, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokine-mediated+recruitment+of+NK+cells+is+a+critical+host+defense+mechanism+in+invasive+aspergillosis.">Chemokine-mediated recruitment of NK cells is a critical host defense mechanism in invasive aspergillosis.</a> Journal of Clinical Investigation. , (2003).</li><li>Finlon, J. M., Burchill, M. A., Jir&#243;n Tamburini, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Digestion+of+the+murine+liver+for+a+flow+cytometric+analysis+of+lymphatic+endothelial+cells.">Digestion of the murine liver for a flow cytometric analysis of lymphatic endothelial cells.</a> Journal of Visualized Experiments. , e58621 (2019).</li><li>Upadhye, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diversification+and+CXCR4-Dependent+Establishment+of+the+Bone+Marrow+B-1a+Cell+Pool+Governs+Atheroprotective+IgM+Production+Linked+to+Human+Coronary+Atherosclerosis.">Diversification and CXCR4-Dependent Establishment of the Bone Marrow B-1a Cell Pool Governs Atheroprotective IgM Production Linked to Human Coronary Atherosclerosis.</a> Circulation research. , (2019).</li><li>O'Brien, C. A., Harris, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ICOS-deficient+and+ICOS+YF+mutant+mice+fail+to+control+Toxoplasma+gondii+infection+of+the+brain.">ICOS-deficient and ICOS YF mutant mice fail to control Toxoplasma gondii infection of the brain.</a> PLoS ONE. , (2020).</li></ol>

Författarna har inget att avslöja.

Här beskriver vi ett tredelat protokoll för att (i) förbereda liposomer som är märkta med ett fluorescerande lipidfärgämne och laddade med en antidiabetisk förening, tesaglitazar, (ii) administrera liposomer till en mus via retroorbital injektion, och (iii) skörda, bearbeta och fläcka vävnader för att detektera liposomupptag på cellulär nivå genom flödescytometri. Detta protokoll granskar beredning av cirka 150 μm liposomer och bedömning av upptag i fett, blod och mjälte. Liposompreparatet är skalbart, utförs mestadels vid rumstemperatur och använder omvänd fasavdunstning för att maximera läkemedelsbelastning och avlägsnande av organiska lösningsmedel. Med hjälp av detta protokoll kan upp till 2 mg / ml tesaglitazarkoncentration uppnås i det renade liposomprovet. De beredda liposomerna kan förvaras i HEPES-buffert vid 4 °C i över ett år. Enligt vår erfarenhet visade de minimal variation av genomsnittlig partikelstorlek. Under 10% av läkemedelsinnehållsförlusten visades spektrofotometriskt, efter ultrafiltreringsseparation av liposomer från externt läkemedel med ett 10 kDa centrifugalfilter.
Under liposomberedning finns det några kritiska steg och faktorer att tänka på. För det första är ordningen på protokollstegen viktig och måste följas. För det andra måste pH-värdet i den lösning som används vid påfyllning av tesaglitazar hållas vid 7,4 för att maximera lösligheten och effektiv belastning. För det tredje säkerställer korrekt montering av utrustning och filter att utgången från varje steg är av rätt storlek och renhet. Till exempel, om 100- och 200-nm-filter inte monteras ordentligt, kan en mer heterogen och felaktigt dimensionerad sats liposomer resultera. För det fjärde behövs fullständigt avlägsnande av Ca-acetat före läkemedelsladdning för att maximera överföringen av tesaglitazar till liposomerna. För att testa för fullständigt avlägsnande av Ca-acetat, använd höghastighetssedimentering för att avlägsna liposomerna och sedan mäta Ca-acetatnivåerna i den icke-liposomala lösningen. För det femte är det viktigt att väga och registrera massan av alla material som läggs till liposompreparatet vid varje steg. Detta säkerställer att lämpliga koncentrationer kan beräknas och nödvändiga materialförhållanden bibehålls. Slutligen, om tekniken inte utförs korrekt, kan det finnas en oönskad nivå av heterogenitet. Det är viktigt att noggrant kontrollera denna parameter med DLS och andra metoder som elektronmikroskopi. Om du vill förbättra homogeniteten bör du överväga att justera den valda filterstorleken eller stapla två filter.
Dessutom är det viktigt att kontroller och en antikroppspanel för flödescytometri planeras och optimeras innan detta protokoll genomförs i sin helhet (tabell 1, tabell 3). Antikroppar bör testas för att säkerställa att lämpliga koncentrationer används för färgning och att överlappningen mellan fluoroforer är minimal. Excitationen och utsläppet av färgämnet som används under liposomberedning måste också beaktas i panelplaneringen. I våra resultat använde vi DiD, som har en liknande excitation och emission som fluoroforer som Allophycocyanin (APC) och AlexaFluor 647. Således valde vi inte antikroppar konjugerade till dessa fluoroforer i vår antikroppspanel. Dessutom ingår inte isotypkontroller i detta protokoll. Detta beror på att antikropparna som valts för detta protokoll är välvaliderade, kommersiellt tillgängliga antikroppar. Men om du är intresserad av att använda en antikropp som inte har optimerats tidigare, överväg att testa antikroppen mot en isotypkontroll på vävnaderna av intresse innan du utför hela experimentet.
Medan detta protokoll visar hur man extraherar och bearbetar blod, mjälte, inguinal fett och bitestikelfettvävnad från musen efter behandling, kan detta allmänna tillvägagångssätt tillämpas på andra vävnader. Beroende på vävnaden av intresse kan bearbetnings- och matsmältningsprotokoll behöva ändras som publiceras för följande vävnader: lunga21, lever22, bukhålan 3, benmärg3,23, hjärna 24.
En viktig begränsning med denna metod att beakta är att upptaget endast kan bedömas vid en tidpunkt per djur. Det kan därför vara fördelaktigt att koppla detta protokoll till andra icke-invasiva avbildningstekniker eller planera därefter för att säkerställa tillräckliga resurser för att genomföra bedömningen. Tidpunkten för cellulärt upptag och cellulär omsättning är viktiga faktorer att tänka på: liposomer kommer att cirkulera i hela kroppen under de första 24 timmarna och beroende på livslängden hos cellerna som tar upp liposomer eller hur de svarar på upptag kan celldöd eller ytterligare fagocytos uppstå. Vår tidigare studie visade förändringar i populationskarakteristika för DiD + -populationer vid olika tidpunkter3. Av den anledningen är det viktigt att utvärdera upptaget vid tidigare tidpunkter eller tidpunkter som är mest relevanta för biologin av mekanismen av intresse. Dessutom, medan kvantifiering av cellupptag i hela vävnaden kan utföras med detta protokoll, kan flödescytometri inte avslöja vävnadslokalisering. Att koppla detta tillvägagångssätt med histologiska metoder kan hjälpa till att hantera denna begränsning.
I allmänhet kompletterar detta protokoll befintlig metodik såsom histologi och helkroppsfluorescensavbildning. Med de fortsatta framstegen inom flödescytometriverktyg och metoder kommer utvecklingen av större paneler till mer och mer specifika cellpopulationer att bli möjlig. Vi föreslår att detta protokoll används utöver de ovan nämnda metoderna eftersom detta kommer att förbättra utvärderingen av cellulärt upptag och också ge möjlighet att validera de resultat som observerats med flödescytometri. Till exempel bör det konstateras att en majoritet av partiklarna i fettvävnad togs upp av makrofager genom flödescytometri. Immunofluorescens av ytterligare en alikvot av samma fettvävnad kan sparas, fixeras, snittas och färgas för makrofagmarkörer för att verifiera att celltypen verkligen tar upp liposomer. Detta tillvägagångssätt bör lägga till noggrannhet i nanopartikelbiodistributionsanalyser som utförs: validera cellspecifik inriktning, kvantifiera cellulärt upptag, identifiera off-target upptag och förhoppningsvis tillhandahålla information för att generera mekanistiska hypoteser för observerade terapeutiska resultat. Detta protokoll kan också anpassas för framtida studier med olika liposomer, undersöka upptag i andra vävnader och testa nya föreningar vid fetma och dysmetabolism eller någon annan sjukdom där nanopartikelleverans är ett genomförbart terapeutiskt alternativ.

Eftersom intresset för att utveckla terapier som använder nanopartiklar läkemedelsleverans växer, måste metoderna för att förbereda och bedöma partikelfördelning och upptag fortsätta att utvecklas, expandera och vara tillgängliga för forskarsamhället 1,2. Detta protokoll utvecklades för att bedöma de exakta celltyperna som tog upp liposomer in vivo efter en behandling med DiD-märkta liposomer laddade med tesaglitazar, en peroxisomproliferatoraktiverad receptor (PPAR)-α/γ-agonist 3,4. I dessa studier kunde vi bedöma vilka celltyper som påverkades direkt av liposomal tesaglitazarbehandling, effekten av att rikta in sig på delar och generera hypoteser för att förklara de behandlingsresultat vi observerade. Vidare tyder etablerade biologiska funktioner i en mängd olika celltyper på att fagocytiska celler såsom makrofager, dendritiska celler och leverspecifika Kupffer-celler tar upp de flesta liposomerna 5,6,7. Med hjälp av detta protokoll har vi visat att icke-klassiska fagocyter också kan ta upp liposomer 3,4.
Detta protokoll presenterar en optimerad metod för att solubilisera tesaglitazar, förbereda liposomer genom omvänd fasindunstning och använda kalciumacetat som ett lockmedel för fjärrladdning av läkemedel. De metoder som presenteras är tillgängliga för många laboratorier och saknar svårinförskaffade material och steg som kräver höga temperaturer. Protokollet producerar liposomer av storlekar som är optimala för ökad cirkulation in vivo8. Dessutom, som sammanfattats av Su et al., har hittills metoder för att utvärdera liposomdistribution in vivo och vävnadsupptag studerats och testats på djupet9. Positronemissionstomografi (PET), magnetisk resonanstomografi (MRT) och fluorescensmolekylär tomografi (FMT) metoder används för att kvantifiera vävnadsspecifik biodistribution och upptag 9,10,11. Även om dessa metoder har optimerats för att maximera detektion in vivo, saknar de fortfarande förmågan att kvantifiera liposomupptag in vivo vid cellulär upplösning. Protokollet som presenteras här syftar till att uppnå detta behov genom användning av flödescytometri. Slutligen, för detta protokoll, minskades cellulärt upptag till några vävnader inklusive fettvävnad. Det finns en växande mängd litteratur som undersöker potentialen för användning av nanopartiklar för att leverera terapier i inställningen av fetma, dysmetabolism och inflammation 12,13,14,15,16,17. Som sådan kände vi att det var viktigt att dela ett protokoll med effektiva metoder för bearbetning och analys av fettvävnad - en av vävnaderna som spelar en viktig roll i dessa patologier.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>309659</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10-mL syringe</td>
			<td>BD</td>
			<td>302995</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>27-gauge needle, sterile for retro-orbital injection</td>
			<td>BD</td>
			<td>305620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse B220 BV421</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>103251</td>
			<td>Clone RA3-6B2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD115 PE</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>12-1152-82</td>
			<td>Clone AFS98</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11b PerCP Cy5.5 antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>550993</td>
			<td>Clone M1/70</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD11c APC ef780 antibody</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>47-0114-82</td>
			<td>Clone N418</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD19 PE CF594</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>562291</td>
			<td>Clone 1D3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD3 FITC antibody</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>553061</td>
			<td>Clone 145-2C11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD31 BV605</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>102427</td>
			<td>Clone 390</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse CD45 PerCP</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>557235</td>
			<td>Clone 30-F11</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-mouse F4/80 PE Cy7</td>
			<td>Biolegend</td>
			<td>123114</td>
			<td>Clone BM8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine serum albumin</td>
			<td>Gemini Bio-products</td>
			<td>700-107P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desalting spin-column</td>
			<td>ThermoFisher</td>
			<td>89889, 89890</td>
			<td>Zeba spin column</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamic Light Scattering, Nicomp 370</td>
			<td>Particle Sizing System, Inc</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FIX &#38; PERM Cell Permeabilization Kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>GAS004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gauze sponges</td>
			<td>Dermacea</td>
			<td>441211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heparin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>3393-1MU</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome extruder</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>Z373400</td>
			<td>LiposoFast</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Live/Dead Aqua</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>L34957</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanosight</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td>NS300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic lubricant</td>
			<td>Optixcare</td>
			<td></td>
			<td>20g/70 oz Sterile</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde, 16% w/v aq. soln., methanol free</td>
			<td>Alfa Aesar</td>
			<td>433689L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polyethylene vial for mincing</td>
			<td>Wheaton</td>
			<td>986701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rotary evaporator</td>
			<td>Buchi</td>
			<td>Re111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sonicator</td>
			<td>Misonix</td>
			<td>XL2020</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>T/Pump Heat therapy pump and pad</td>
			<td>Gaymer Industries</td>
			<td>TP-500</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tesaglitazar</td>
			<td>Tocris</td>
			<td>3965</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Track-etched polycarbonate membranes</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td>1141Z**</td>
			<td>Whatman, Nuclepore Polycarbonate hydrophilic membranes</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ZetaSizer/DLS-ELS system</td>
			<td>Malvern Instruments Ltd</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation, administration, and assessment of in vivo tissue-specific cellular uptake of fluorescent dye-labeled liposomes

Det finns ett växande intresse för att använda liposomer för att leverera föreningar in vivo, särskilt för riktade behandlingsmetoder. Beroende på liposomformuleringen kan liposomer företrädesvis tas upp av olika celltyper i kroppen. Detta kan påverka effekten av den terapeutiska partikeln eftersom progressionen av olika sjukdomar är vävnads- och celltypspecifik. I detta protokoll presenterar vi en metod för att syntetisera och fluorescerande märka liposomer med DSPC, kolesterol och PEG-2000 DSPE och lipidfärgämnet DiD som en fluorescerande etikett. Detta protokoll presenterar också ett tillvägagångssätt för att leverera liposomer in vivo och bedöma cellspecifikt upptag av liposomer med hjälp av flödescytometri. Detta tillvägagångssätt kan användas för att bestämma vilka typer av celler som tar upp liposomer och kvantifiera fördelningen och andelen liposomupptag över celltyper och vävnader. Även om de inte nämns i detta protokoll, kommer ytterligare analyser såsom immunofluorescens och encellsfluorescensavbildning på en cytometer att stärka eventuella fynd eller slutsatser som görs eftersom de möjliggör bedömning av intracellulär färgning. Protokoll kan också behöva anpassas beroende på vävnaden / vävnaderna av intresse.

Liposomproduktion
Resultaten som publiceras här liknar dem i vårt tidigare publicerade arbete 3,4,20. Med hjälp av protokollet som presenteras här förväntar vi oss att producera liposomer med en storlek på cirka 150–160 nm. DLS avslöjar en genomsnittlig liposomdiameter på 163,2 nm och en zetapotential på -19,2 mV (figur 1A). Kryogen elektronmikroskopi (kryo-EM) avbildning avslöjar cirkulära liposomer (figur 1B) och DLS-diagrammet avslöjar en relativt liten standardavvikelse från medeldiametern (figur 1C).
Positiv liposombindning kräver en PBS-behandlad kontroll
Tidigare studier från vår grupp som använde detta protokoll undersökte vilka cellundergrupper i fett-SVF, mjälte och blod bundet till liposomer efter en veckas in vivo-administrering 3,4. Med hjälp av en PBS-behandlad mus färgades bukhålan och mjältceller med samma antikroppspanel som används på prover från liposombehandlade möss. Vävnaderna skördades efter en veckas behandlingar (figur 2A). Proverna från den PBS-behandlade musen fungerade som en DiD FMO för att skapa positiva DiD-grindar (figur 2B, C). En positiv grind kan skapas med hjälp av DiD-positiv signal, men prover som saknar DiD-signal måste också användas för att verifiera att den positiva grinden inte innehåller några DiD-negativa prover.
Titrering behövs för att optimera fluorescenssignaler
Innan ett fullständigt experiment utförs måste olika förhållanden, inklusive koncentrationen av fluorescerande konjugerade antikroppar som används under cellfärgning och lipidfärg som används under liposomberedning optimeras. Flödescytometrar har en övre detektionsgräns för fluorescensintensitet, så för mycket färgämne som ingår i liposomerna kommer att leda till okvantifierbara nivåer av DiD-signal i prover som går genom cytometern. Dessutom kan för mycket DiD i liposomerna leda till höga nivåer av icke-specifik färgöverföring, vilket kan skeva cellulära upptagsresultat. Figur 3 rapporterar resultat från ett experiment där koncentrationer av lipidfärgämne titrerades för att identifiera koncentrationen som skulle ge en optimal signal inom detektionsområdet för flödescytometern som användes. Detta utfördes på vävnaderna av intresse för det slutliga experimentet: Blod (Figur 3A), inguinal fett SVF (Figur 3B) och epididymal fett SVF (Figur 3C). De koncentrationer som valdes för testning var 10 mg DiD (hög, röd), 1 mg DiD (mitten, blå) eller 0,1 mg DiD (låg, grå) per 1 ml liposomer. Den högsta koncentrationen som användes i liposomerna var för hög och överträffade cytometerns kvantifierbara intervall i alla tre vävnaderna (figur 3A\u2012C, röd). Den lägsta koncentrationen av DiD visade någon signal (Figur 3 A\u2012C, grå), men en tydlig population bortom de PBS-behandlade cellerna (Figur 3A\u2012C, svart) observerades inte. Vid kvantifiering visade det aritmetiska medelvärdet av DiD MFI för varje vävnad och koncentration en tydlig skillnad mellan PBS-kontroller och den mellersta koncentrationen av DiD (figur 3D). Således, som anges i protokollet, valde vi den mellersta koncentrationen (figur 3, blå) som skulle användas i vår liposomberedning.
Användningen av multi-antikroppspanel möjliggör identifiering av liposomupptag av olika cellundergrupper
Med hjälp av panelen som beskrivs i tabell 3 färgades celler med antikroppar mot markörer för makrofager, B-celler, T-celler, dendritiska celler, monocyter och endotelceller (figur 4). Något olika grindstrategier krävs för varje vävnadstyp, men de flesta av samma celltyper kan identifieras i varje. Några undantag inkluderar endotelceller, som normalt inte finns i blodet, och monocyter, som vanligtvis har högre frekvens i blodet än andra vävnader. När populationer har identifierats kan den totala storleken på varje cellpopulation och frekvensen vid vilken de är DiD + kvantifieras. Ytterligare beräkningar kan utföras för att karakterisera DiD + -populationen: vilken procent av DiD + -celler är makrofager, endotelceller etc. Observera att detta är exempel på grindstrategier, men inte det enda sättet att analysera proverna. Analysen kommer att dikteras av den valda panelen och flödescytometer (er) tillgängliga.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig01.jpg"> Figur 1: Exempel på egenskaper hos beredda liposomer. (A) Storlek och zetapotential mättes enligt beskrivningen ovan och har rapporterats i tabellform. Varje parameter presenteras som medelvärdet ± standardavvikelsen. (B) Cryo-EM användes för att avbilda de beredda liposomerna. Den vita skalstången är 50 nm lång. (C) DLS användes för att generera ett histogram över liposomernas diameter i denna prep. Denna siffra är anpassad från Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig01large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig02.jpg"> Figur 2: Representativ DiD-färgning från PBS- eller liposombehandlade möss. (A) Experimentell schematisk för PBS- och liposombehandlingar. PBS eller liposomer injicerades tre gånger under loppet av en vecka. Vävnader skördades på dag 8 av behandlingen. (B, C) Representativa flödesdiagram visar positiv DiD-färgning hos liposombehandlade (C), men inte PBS-behandlade (B) möss. FSC, framåtriktad spridning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig02large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig03.jpg"> Figur 3: Titrering av DiD i liposomer. Liposomer framställdes med tre olika koncentrationer av DiD och injicerades i möss. Grått indikerar den låga koncentrationen vid 0,1 mg DiD per 1 ml liposomer, blått indikerar den mellersta koncentrationen vid 1 mg DiD / ml liposomer och rött indikerar den höga koncentrationen vid 10 mg DiD / ml liposomer. En PBS-behandlad mus användes som en negativ kontroll (svart). Blod (A, cirkel), inguinalfett (B, triange) och bitestikelfett (C, kvadrat) skördades 24 timmar efter injektion och bearbetades för att isolera en encellssuspension. Dessa prover kördes på en flödescytometer till nivån av detekterbar DiD. Vävnadsspecifika histogram med överlagringar av varje behandlingsgrupp presenteras för att visa fluorescensintensitet per koncentration (A\u2012C). Det aritmetiska medelvärdet av DiD kvantifierades också för varje vävnad och koncentration och plottades (D). SSC = sidospridning. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig03large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61585/61585fig04v4.jpg"> Figur 4: Representativ flödescytometrianalys av cellundergrupper i fett-SVF, blod och mjälte. (A\u2012C) Schematisk representant för grindstrategi för att identifiera cellundergrupper och DiD + -celler i fett SVF (A), mjälte (B) och blod (C). Förkortningar: FSC = forward scatter; LD = levande/döda; L-DCs = lymfoida dendritiska celler; M-DCs = myeloida dendritiska celler; SSC = sidospridning. Denna siffra är anpassad från Osinski et al.3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61585/61585fig04large.jpg" target="_blank">Klicka här för att se en större version av denna figur.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Kontroll</td>
			<td>Avsikt</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">Mus behandlad med PBS eller saltlösning</td>
			<td>Använd cellerna från den här musen för följande flödescytometrikontroller:</td>
		</tr><tr><td>1. Ofärgade celler</td>
		</tr><tr><td>2. Levande / död enstaka fläck</td>
		</tr><tr><td>3. Celler färgade med hela panelen, men saknar liposomfluorescensen för att bestämma positiv liposomsignal under analys</td>
		</tr><tr><td>Denna / dessa mus / möss kommer också att användas för att avgöra om liposomer har några effekter in vivo eftersom du kommer att ha en icke-liposomkontroll i ditt experiment.</td>
		</tr><tr><td>Lossade liposomer</td>
			<td>Om du laddar en förening i dina liposomer, bör en del av din liposomsats syntetiseras utan föreningen. Detta står för eventuella in vivo-effekter av liposomerna ensamma.</td>
		</tr><tr><td>DiD ensam</td>
			<td>Eftersom DiD också kan tas upp av cellmembran, kommer tilldelning av vissa möss för att få fritt färgämne i en mängd som är lika med den som finns i liposomerna att hjälpa till att redogöra för eventuell bakgrundsmembranfärgning.</td>
		</tr><tr><td>FMO-kontroller (fluorescens-minus-ett)</td>
			<td>Dessa är celler färgade med alla utom en av antikropparna i din panel. Liksom # 3 i rutan ovan hjälper detta till att bestämma sann positiv signal för den antikroppen under analysen</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 1: Kontroller som ska användas i detta protokoll.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Lösning</td>
			<td>Komponenter</td>
			<td>Ungefärlig volym som behövs per batch/mus</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Liposomberedning</td>
		</tr><tr><td>Kalciumacetat</td>
			<td>1 M kalciumacetat iH2O</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES buffert</td>
			<td>10 mM HEPES iH2O, pH 7,4</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Tesaglitazar i HEPES</td>
			<td>i 10 mM HEPES</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td colspan="3">Vävnadsskörd, bearbetning och färgning</td>
		</tr><tr><td>Fosfatbuffrad lösning (PBS)</td>
			<td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMNa2HPO4, 1,8 mM KH2PO4 i destilleradH2O</td>
			<td>2 ml</td>
		</tr><tr><td>PBS-heparin</td>
			<td>0,1 mM heparin i PBS</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>HEPES buffert</td>
			<td>20 mM HEPES i PBS</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Digestion buffert</td>
			<td>2 mg/ml kollagenas typ I i HEPES-buffert</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>AKC-lysbuffert</td>
			<td>0,158 M NH 3 Cl, 10 mM KHCO3, 0,1 mM Na 2 EDTA i ddH 2 O, pH7,2</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>FACS-buffert</td>
			<td>1% BSA, 0,05% NaN3 i PBS</td>
			<td>15 ml</td>
		</tr><tr><td>Fc-block (utspätt)</td>
			<td>1:50 Fc-block i FACS-buffert</td>
			<td>250 μL</td>
		</tr><tr><td>Fixeringsbuffert</td>
			<td>2% paraformaldehyd i PBS</td>
			<td>200 μL</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 2: Lösningar att förbereda.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>A</td>
			<td>B</td>
			<td>C</td>
			<td>D</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Extracellulär färgning (2x antikroppsblandning)</td>
		</tr><tr><td>Antigen</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Ab-volym per 100 μL-test</td>
			<td>Total volym som behövs:</td>
		</tr><tr><td>CD45</td>
			<td>PerCP</td>
			<td>0,5 μL</td>
			<td>Kolumn C x 1,2 x Totalt # prover</td>
		</tr><tr><td>CD11b</td>
			<td>PerCP Cy5.5</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,5 μl/test) x (1,2) x (# prover)</td>
		</tr><tr><td>F4/80</td>
			<td>PE Cy7</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>(0,25 μl/test) x (1,2) x (# prover)</td>
		</tr><tr><td>CD19</td>
			<td>PE-CF594</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(0,25 μl/test) x (1,2) x (# prover)</td>
		</tr><tr><td>CD3</td>
			<td>FITC</td>
			<td>1 μL</td>
			<td>(1,0 μl/test) x (1,2) x (# prover)</td>
		</tr><tr><td>CD31</td>
			<td>BV605</td>
			<td>0,25 μL</td>
			<td>etc...</td>
		</tr><tr><td>CD11c</td>
			<td>APC ef780</td>
			<td>1 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>CD115</td>
			<td>PE</td>
			<td>1,5 μL</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="4">För att skapa din antikroppsblandning, kombinera antikropparna beräknade i kolumn D med FACS-buffert eller Brilliant Violet Staining Buffer* till en slutlig volym på (50 μL x 1,2 x Totalt # prover)</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Levande / död färgning (1x)</td>
		</tr><tr><td>Levande/död</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>L/D-volym per 200 uL test</td>
			<td>Total volym som behövs:</td>
		</tr><tr><td>Levande/död</td>
			<td>Aqua</td>
			<td>0,67 μL</td>
			<td>Kolumn C x 1,2 x Totalt # prover</td>
		</tr><tr><td colspan="4">Intracellulär färgning (1x)</td>
		</tr><tr><td>Antigen</td>
			<td>Fluorofor</td>
			<td>Ab-volym per 50 μl-test</td>
			<td>Total volym som behövs:</td>
		</tr><tr><td>αSMA</td>
			<td>FITC</td>
			<td>0.125</td>
			<td>Kolumn C x 1,2 x Totalt # prover</td>
		</tr><tr><td colspan="4">*Brilliant Violet Staining Buffer ska användas om mer än en antikropp konjugerad till en Brilliant Violet-fluorofor används i din panel.</td>
		</tr></tbody></table>Tabell 3: Exempel på antikroppspanel och beräkningar av färgningsblandningar som ska användas för flödesfärgning.

Watch this Scientific Journal Video about Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes at JoVE.com

Preparation, Administration, and Assessment of In Vivo Tissue-Specific Cellular Uptake of Fluorescent Dye-Labeled Liposomes

Målet med detta protokoll är att syntetisera fluorescerande märkta liposomer och använda flödescytometri för att identifiera in vivo-lokalisering av liposomer på cellulär nivå.

Beredning, administrering och bedömning av vävnadsspecifikt cellulärt upptag in vivo av fluorescerande färgämnesmärkta liposomer

There is a growing interest in using liposomes to deliver compounds in vivo particularly for targeted treatment approaches. Depending on the liposome ...

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Preparation of Complaint Matrices for Quantifying Cellular Contraction

Beredning av Klagomål Matriser för kvantifiering Cellular Sammandragning

The regulation of cellular adhesion to the extracellular matrix (ECM) is essential for cell migration and ECM remodeling.  Focal adhesions are ...

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

Cellular Lipid Extraction för riktade Stabil isotoputspädning Vätskekromatografi-masspektrometri Analys

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

Preparation and Photoacoustic Analysis of Cellular Vehicles Containing Gold Nanorods

Upprättande och Photoacoustic Analys av Cellular fordon som innehåller guld nanostavar

Gold nanorods are attractive for a range of biomedical applications, such as the photothermal ablation and the photoacoustic imaging of cancer, thanks to ...

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In Vivo Quantitative Assessment of Myocardial Structure, Function, Perfusion and Viability Using Cardiac Micro-computed Tomography

In vivo kvantitativ bedömning av Myocardial struktur, funktion, perfusion och livskraft Använda Cardiac Micro-datortomografi

The use of Micro-Computed Tomography (MicroCT) for in vivo studies of small animals as models of human disease has risen tremendously due to the fact that ...

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Preparation of 3D Collagen Gels and Microchannels for the Study of 3D Interactions In Vivo

Beredning av 3D koUagengeler och mikro för studien av 3D interaktioner<em&gt; In Vivo</em

Historically, most cellular processes have been studied in only 2 dimensions.  While these studies have been informative about general cell signaling ...

Delivery of Therapeutic siRNA to the CNS Using Cationic and Anionic Liposomes

Avgivning av terapeutiska siRNA mot CNS Använda katjoniska och anjoniska liposomer

Prion diseases result from the misfolding of the normal, cellular prion protein (PrPC) to an abnormal protease resistant isomer called PrPRes.  The ...

Fabrication of Extracellular Matrix-derived Foams and Microcarriers as Tissue-specific Cell Culture and Delivery Platforms

Tillverkning av extracellulär matrix-härledda Skum och Mikrobärare som Vävnadsspecifik Cellodling och Delivery Platforms

Cell function is mediated by interactions with the extracellular matrix (ECM), which has complex tissue-specific composition and architecture. The focus ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Förberedelse, rening och användning av fettsyra-innehållande liposomer

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Repressing Gene Transcription by Redirecting Cellular Machinery with Chemical Epigenetic Modifiers

Ompressning gentranskription genom att omdirigera cellulära maskineriet med kemiska epigenetiska modifierare

Regulation of chromatin compaction is an important process that governs gene expression in higher eukaryotes. Although chromatin compaction and gene ...

Rigid Embedding of Fixed and Stained, Whole, Millimeter-Scale Specimens for Section-free 3D Histology by Micro-Computed Tomography

Styv inbäddning av fixeras och färgas, hela Millimeter-skala prover för avsnitt-gratis 3D histologi av mikro-datortomografi

For over a hundred years, the histological study of tissues has been the gold standard for medical diagnosis because histology allows all cell types in ...