Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD، WFM و BR مدعومة من قبل مركز البناء الخلوي، وهو مركز العلوم والتكنولوجيا (NSF) المؤسسة الوطنية، بموجب اتفاقية منحة DBI-1548297. كما يتم دعم BR من خلال جائزة NSF Career، 1553695.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

ليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

البروتوكول الموصوف هنا متعدد الاستخدامات للغاية ويمكن تكييفه بسهولة لدراسة الأحداث البيولوجية في مجموعة متنوعة من المراحل في التنمية الجنينية دروسوفيليا. وهذا البروتوكول مناسب تماما لدراسة العمليات البيولوجية التي تحدث على مدى فترات زمنية طويلة. على سبيل المثال، يمكن أن تستفيد دراسات الخلايا29،30 أو تشكيل مجالات هيتروكروومتين في Drosophila31،32 من استخدام الطرق الموصوفة في هذا البروتوكول لأن هذه العمليات تحدث على مدى فترة طويلة من الزمن. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن زيادة حجم العينة عن طريق تقليل التكبير لدراسة الأسئلة التي تتطلب أقل دقة البصرية، مثل توقيت بين الانقساماتالمتزامنة 33 أو مدة gastrulation34.  وبالمثل، فإن الهدف 20x يسمح لتصوير جنينين داخل طائرة تصوير واحدة. وتوفر الأساليب المستخدمة في هذا البروتوكول منصة دينامية لطرح الأسئلة البيولوجية باستخدام التنمية الجنينية كنظام نموذجي للتحليل الكمي.
هناك 3 خطوات هامة في هذا البروتوكول. بعد dechorionation في 50٪ تبييض من الضروري أن يتم شطف الأجنة وتجفيفها بقوة 5 مرات (2.3.4). هذه الخطوة يزيل أي بقايا قطع صغيرة من chorion. سوف بقايا chorion عرقلة مجال الرؤية عند تصوير الجنين. عند تركيب الأجنة على غطاء الزجاج (3.5)، من المهم الضغط على الأجنة على الغراء مع ضغط موحد. وهذا سوف يضع الأجنة على نفس الطائرة z. عند قطع فتح إبرة الحقن المجهري، من المهم سحب المكبس على الفور لضبط معدل تدفق الإبرة أو سوف تفقد كل ما تبذلونه من الحقن.
كانت دراستنا محدودة بعوامل اثنين. العامل الأول هو عدم وجود عملية تجزئة آلية. قمنا بتصميم سيناريو تجزئة يدوي باستخدام MATLAB ، ومع ذلك ، مع علامة المغزل المشفرة وراثيا يمكن أن تكون هذه العملية الآلي. في المستقبل نود أن تنتج CNN-RFP21،RTLN1-GFP و CNN-RFP؛ خطوط ReepB-GFP المعدلة وراثيا لتمكين تجزئة المغزل الآلي. لمزيد من المعلومات حول خط MATLAB وخط أنابيب التحليل ، راجع المواد التكميلية من Diaz etal. 15. ثانيا، كنا أيضا محدودة من قبل لدينا فترة اقتناء 35 s، والتي سمحت لنا فقط لتصوير 6 أجنة في وقت واحد. فترة حيازة أطول من شأنها أن تسمح لنا لصورة المزيد من الأجنة في وقت واحد. على الرغم من أن إنتاجية تسليم المخدرات يمكن أن تزيد عن طريق استبدال الحقن المجهري مع خطوة تغلغل، وجدنا أن هذا غير ضروري لأن حجم العينة لدينا كان محدودا بالفعل من قبل فترة الاقتناء.
في حين تم استخدام هذا البروتوكول لصورة Drosophila تطوير الجنينية، والنهج الشامل هو قابل للتكيف لدراسة التنمية الجنينية في أنظمة نموذج متعددة الخلايا الأخرى، مثل C. elegans،قنفذ البحر، وXenopus. الأجنة مفيدة للغاية للتحليل الكمي لأنها متزامنة بسهولة عن طريق الجمع أو الإخصاب. بالإضافة إلى ذلك، لا تتحرك الأجنة أو تسبح بعيداً عن مجال الرؤية، مما يتيح استخدام برنامج بسيط للاكتساب متعدد النقاط قادر على إنتاج مقاطع فيديو متعددة للفاصل الزمني للتحليل الكمي. على الرغم من أننا استخدمنا محلل محتوى عالي في دراستنا ، يمكن أن يقترن أي نظام مجهر مقلوب قادر على الاستحواذ متعدد النقاط بالطرق المشار إليها هنا.
ويمكن الحصول على نتائج مماثلة باستخدام احتياز متعدد النقاط يمكن أن يُعكس مجهراً مقلوباً؛ ومع ذلك، تظهر مزايا محلل المحتوى العالي كـ أحد يزيد حجم العينة لدراسة الأسئلة التي تتطلب دقة أقل في الوقت. ميزة واضحة لاستخدام محلل المحتوى العالي هو القدرة على صورة 4 شرائح منفصلة في وقت واحد مقارنة مع 1 الشريحة على النظم التقليدية. مع مجموعة كاملة من 4 شرائح و 40 أجنة على كل شريحة، يمكن تصوير 160 جنينا على مدى عدة ساعات، طالما أن فترة الاستحواذ هي 15 دقيقة على الأقل بين الإطارات. ميزة أخرى هامة لاستخدام محلل المحتوى العالي هي أن العينات مغلقة تماما من أي مصادر الضوء الخارجي، وهو أمر ضروري لقياسات كثافة الفلوريسينس القائمة على. وأخيرا، فإن محلل المحتوى العالي المستخدم في دراستنا لديه كاميرا CMOS 5.5 ميجابيكسل التي توفر حقل عرض سخي 221.87 ميكرومتر في التكبير 60x. وقد مكننا هذا المجال الأكبر من الرؤية من تصوير نصف جنين لكل نقطة اقتناء.

على مدى السنوات ال 30 الماضية، تقدم التقدم في تقنيات التصوير والتحقيقات الجزيئية للتصوير بالخلايا الحية إلى الأمام فهمنا لتعقيد الخلية وعملها الداخلي. ويرافق هذا التقدم في التكنولوجيا هو زيادة الاعتماد على استخدام السابقين نماذج الخلايا الحية ثقافة للحصول على بيانات التصوير عالية الإنتاجية. توفر نماذج ثقافة الخلايا العديد من المزايا، بما في ذلك التحكم في البيئة الدقيقة من خلال أنظمة microfluidic، والقدرة على تصوير خلايا متعددة في وقت واحد، مما يتيح استخدام الأساليب الكمية اللازمة لفحص الإنتاجية العالية1،2. ومع ذلك ، هناك أيضا عيوب كبيرة مرتبطة بنماذج ثقافة الخلية في سياق الدراسات المورفولوجية ، مثل الزجاج ثنائي الأبعاد أو الأسطح البلاستيكية التي تنتج تأثيرات محيرة على مورفولوجيا الخلية وتنظيمها3،4،5. يمكن أن توفر هذه الآثار بيانات خاطئة أو مضللة فيما يتعلق بدراسة العمليات البيولوجية التي تنظم مورفولوجيا الخلايا.
على الرغم من أن البديل كان لدراسة مورفولوجيا خلوية في سياق كائن حي سليم6، فإن عدد قليل من الكائنات الحية السليمة المناسبة تسهل عالية الإنتاجية التصوير الخلايا الحية الكمية بسبب صعوبات في الحفاظ على الكائنات الحية بأكملها على قيد الحياة من خلال التصوير ، والتحديات المرتبطة بالتصوير داخل كائن حي كبير متعدد الخلايا. ونتيجة لذلك، ركزت الدراسات البيولوجية للخلايا في الكائنات الحية السليمة عموما على مراقبة كائن حي واحد مع مرور الوقت، مما يحد إلى حد كبير من حجم العينة. بالإضافة إلى ذلك، فإن هذا الحد من الحيوانات الواحدة في الوقت الواحد يجعل التصوير الحي صعبًا ومكلفًا في استخدام الشاشة ويحد من القدرة على تطبيق أدوات التحليل الكمي نظرًا لأن عدد العينات صغير جدًا بشكل عام. وهكذا، تنشأ الحاجة إلى كائن حي نموذج متعدد الخلايا التي يمكن استخدامها للنهج الكمية ذات المحتوى العالي القائمة.
يكيف هذا البروتوكول جنين دروسوفيليا للتصوير عالي المحتوى القائم على الألواح لتوليد أحجام عينات تجريبية كبيرة بما يكفي للتحليل الكمي. Drosophila الميلانوغاستر المعروف باسم الكائن أول نموذج. وقد أدت البحوث باستخدام Drosophila إلى اختراقات في الخلايا والبيولوجيا الجزيئية ، بما في ذلك نقل المعلومات الوراثية ، وتحديد مسارات إشارات الخلايا ، والمتطلبات الوراثية للتنمية الجنينية7،8،9. وبالإضافة إلى ذلك، وقد استخدم الجنين Drosophila لاستكشاف في ديناميات ميكروتوبول في الجسم الحي خلال التقسيم الخلوي10،11،12. استخدام الحقن المجهرية لتقديم جزيئات صغيرة و تحقيقات الجزيئية يوفر التحكم الزمني الذي يجعل Drosophila تطوير الجنينية قوية بشكل خاص لتحري العمليات الخلوية في الجسم الحي13،14. ومع ذلك، فإن توليد عدد كبير من التكرارات التجريبية باستخدام نهج التصوير التقليدي هو عمل كثيف للغاية وله استخدام محدود في شاشات التصوير عالية الإنتاجية والتحليل الكمي. نهجنا يجعل استخدام محلل محتوى عالية محفوظة عادة لتحليل خلية واحدة ويتكيف في تحليل التصوير في الجسم الحي في syncytium من الدرسونو فيوقت مبكر ه mbryo.
تم استخدام هذا البروتوكول لجمع، مرحلة، وmicroinject الأجنة Drosophila لاستكشاف الآليات التي تدفع التغيرات المورفولوجية في إندوبلاسميك ريتيكولوم (ER) خلال الانقسام15. على الرغم من أن العديد من الدراسات قد حددت الطبيعة الديناميكية لـ ER خلال دورة الخلية16،17،18،19، فقد كان من الصعب مقارنة آثار الانزعاجات المتعددة عبر الزمن على مورفولوجيا ER. لتحديد المكونات التي تدفع التغييرات في ER مورفولوجيا عبر انقسام الخلايا، واستخدمت الأساليب المذكورة في هذا البروتوكول للتحقيق في دور microtubules وغيرها من العوامل الخلوية في إعادة تنظيم ER ميتوسيتيك باستخدام الانقسام المتزامن القشرية في الجنين الدروسوفيا في وقت مبكر. إذا ما أخذت معا، وتوافر الانزعاج الوراثي داخل المجتمع Drosophila، والقدرة على microinject المخدرات و التحقيقات الجزيئية في أوقات دقيقة أثناء التنمية، وتكلفة غير مكلفة للعمل مع Drosophila يجعل هذا النهج قابل جدا لفحص الصورة عالية الإنتاجية على أساس. الأساليب المذكورة هنا قابلة للتطبيق لدراسة مجموعة واسعة من العمليات الخلوية والتنموية في الجسم الحي باستخدام الجنين Drosophila 20. على وجه التحديد، هذا البروتوكول هو جيد التكيف لدراسة الأحداث البيولوجية التي تحدث على مدى فترة طويلة وضمن 100 ميكرون من قشرة الجنين دروسوفيليا.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

وقد أصبحت الأساليب الحديثة في التصوير الحي للخلايا الكمية أداة أساسية لاستكشاف بيولوجيا الخلايا، من خلال تمكين استخدام الإحصاءات والنمذجة الحسابية لتصنيف العمليات البيولوجية ومقارنتها. على الرغم من أن أنظمة نموذج ثقافة الخلية كبيرة للتصوير عالي المحتوى ، فإن دراسات الإنتاجية العالية لمورفولوجيا الخلايا تشير إلى أن ثقافات الخلايا الحية السابقة محدودة في تلخيص التعقيد المورفولوجي الموجود في الخلايا داخل الكائنات الحية. على هذا النحو ، هناك حاجة لنظام نموذج عالي الإنتاجية قابلة للتطوير لصورة الخلايا الحية داخل كائن حي سليم. وصف هنا هو بروتوكول لاستخدام محلل صورة عالية المحتوى للحصول في وقت واحد متعددة الوقت الفاصل الفيديو من الجنينية Drosophila التنمية الميلانوغاستر خلال مرحلة blastoderm متزامن. وقد خدم البلاستدرم المتزامن تقليديا كنموذج كبير في الجسم الحي لتصوير الأحداث البيولوجية; ومع ذلك، فإن الحصول على عدد كبير من النسخ المتماثلة التجريبية للنهج الكمية والعالية الإنتاجية كان كثيف العمالة ومحدودًا من خلال تصوير جنين واحد لكل تكرار تجريبي. هنا هو طريقة لتكييف التصوير وmicroinjection النهج لتتناسب مع نظام التصوير ذات المحتوى العالي ، أو أي مجهر مقلوب قادرة على الحصول الآلي multipoint. يتيح هذا النهج الحصول المتزامن على 6-12 جنينًا، حسب عوامل الاكتساب المرغوبة، في جلسة تصوير واحدة.

وقد استخدم النهج المقدم في هذا البروتوكول لدراسة دور microtubules في إندوبلاسميك Reticulum (ER) إعادة التنظيم أثناء الانقسام في الجنين Drosophila 15. خلال الانقسام ، وهيكل ER يعرض إعادة تنظيم مثيرة ، ومع ذلك ، فإن القوى التي تدفع هذه التغييرات غير مفهومة بشكل جيد. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أن عائلة من البروتينات تشكيل ER لتعزيز تشكيل أنبوبER 25،26،27،28، والتي هي معروفة لقربها من قرب مع microtubules28. لدراسة لفة microtubules على ER مورفولوجيا، واستخدمت الأساليب المنصوص عليها في البروتوكول لتوليد البيانات لمقارنة كمية آثار العديد من العلاجات الدوائية microinjected على إعادة تنظيم ER أثناء الانقسام. كولشيسين، الذي يمنع البلمرة microtubule جديدة، ووجد أن تقلل بشكل كبير من إعادة تنظيم ER أثناء الانقسام كما هو مبين في الشكل 5 والشكل 6. وعلاوة على ذلك، فإن النهج الموصوف هنا مكّن من إنتاج بيانات التصوير في اللفات الزمنية لـ 32 جنيناً. تم إنتاج قياسات الكثافة القصوى والأقصى من 12800 منطقة ذات أهمية باستخدام سيناريو MATLAB مخصص ، والذي أدى أيضًا إلى توليد إحصاءات وصفية واستدلية حيوية لإجراء مقارنات بين علاجات الأدوية. نظرا لتوافر المسابير الجزيئية وسهولة الحقن المجهري، والطرق المذكورة هنا قابلة للتكيف بسهولة لدراسة مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية عن طريق القياس الكمي كثافة الفلوريسين.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> الشكل 5: صور تمثيلية لإثراء Rtnl1-GFP و ReepB-GFP في قطبي المغزل أثناء الانقسام. (أ) 60x مجال الرؤية من ReepB-GFP خلال الانقسام في دورة الخلية 10. ويمثل المربع الأزرق مجال الرؤية المستخدم في اللوحات B-E. تتم معالجة اللوحة A مع عامل تصفية ثنائي العتبة. لم يتم تطبيق هذا المرشح على لوحات B-E لأنه يستبعد البيانات من وحدات البكسل تحت العتبة المحددة. (B, D) ReepB-GFP في السيطرة، وفي colchicine. (C, E) Rtnl1-GFP في السيطرة، وفي colchicine. وقد تم تعديل هذا الرقم من دياز وآخرون15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> الشكل 6: كمية الإثراء من Rtnl1-GFP و ReepB-GFP في قطبي المغزل أثناء الانقسام. تم تحليل 20 مغزل و 20 سيتوبلازم ريال عماني عبر 10 إطارات ل32 أجنة في الظروف التالية. (أ)10% حقن التحكم في DMSO لRtnl1-GFP. أظهرت الأجنة التحكم زيادة 0.1 أضعاف في التخصيب (p<0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة مع العينات غير المحقونة (p < 0.001 لجميع العينات في T210). (ب) الأجنة ReepB-GFP حقن مع 10٪ DMSO لتكون بمثابة السيطرة. وأظهرت الأجنة التحكم زيادة 0.1 أضعاف في التخصيب (p< 0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة بالعينات غير المحقونة(الشكل 1E؛ p < 0.001 لجميع العينات في T210). (C)Rtnl1-GFP الأجنة حقنها مع 5 μM كولشيسين. هنا قمنا بقياس انخفاض في إثراء Rtnl1-GFP إلى مغزل (p < 0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة بالضوابط (A) (p < 0.001 لجميع العينات في T210). (د)الأجنة ReepB-GFP حقن مع 5 μM كولشيسين. قمنا بقياس انخفاض في إثراء ReepB-GFP إلى مغزل (p< 0.001 لجميع العينات في T210) مقارنة بالضوابط (B) (p<0.001 لجميع العينات في T210). وقد تم تعديل هذا الرقم من دياز وآخرون15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. معجون الخميرة21</td>
			<td>2. صفائح العنب21</td>
			<td>3. هيبتان الغراء24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 إضافة 7 غراما من الخميرة الجافة النشطة إلى 50 مل مخروطي. إضافة 9 ملليلتر من المياه DI ويخلط حتى إلى ثبات مع ملعقة معدنية.</td>
			<td>2.1 جعل الحل أ: إضافة 6 غرامات من أجار إلى 140ml من المياه DI في قارورة 250ml وautoclave ذلك.</td>
			<td>3.1 ملء قارورة التألق الزجاجي مع 50 بوصة من الشريط على الوجهين.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 إضافة 7 غراما من الخميرة الجافة النشطة إلى 50 مل مخروطي. إضافة 9 ملليلتر من المياه DI ويخلط حتى إلى ثبات مع ملعقة معدنية.</td>
			<td>2.2 جعل حل ب: مزيج 0.1 غرام من البارابين الميثيل في 2ml من الإيثانول، ثم إضافة هذا الحل إلى 60ml من عصير الجريب فروت التركيز.</td>
			<td>3.2 إضافة 20 مل من heptane وختم الزجاج المظلة مع قارورة البارا فيلم. تدوير بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 مباشرة بعد حل autoclaving a، مزيج في حل ب وتصب الخليط في 10 × 35mm أطباق بيرتي. (يجعل 35 صفائح العنب)</td>
			<td>3.3 إزالة الحطام الشريط البلاستيك عن طريق نقل الغراء في 2 15 مل أنابيب المخروطية وsuguging في 3000 دورة في الدقيقة لمدة 15 دقيقة.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 السماح للوحات العنب لتعيين في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها مع أغطية لوحة قبالة. لوحات تغطية مع الأغطية وتخزينها في 4C درجة بعد تعيينها.</td>
			<td>3.4 نقل الغراء supernatant في أنابيب 1.5 مل microcentrifuge للتخزين.</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: وصفات وسائط الإعلام والحلول.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

يتم تقديمها هنا هو بروتوكول لmicroinject وفي وقت واحد صورة الأجنة Drosophila متعددة خلال النمو الجنيني باستخدام لوحة المستندة إلى، صورة عالية المحتوى.

Drosophila إعداد الجنين و Microinjection لالمجهر الخلية لايف تنفيذها باستخدام محلل المحتوى العالي الآلي

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

يتيح هذا البروتوكول الحصول المتزامن على أجنة متعددة في جلسة تصوير واحدة. في حين يتم تكييف إعداد العينة للحصول على نقاط متعددة باستخدام محلل محتوى عالي ، يمكن تصوير العينات المعدة باستخدام هذا البروتوكول على أي مجهر مقلوب قادر على الحصول على نقاط متعددة. للبدء، تنظيم صفين من 15 إلى 20 أجنة على قسم نظيف من لوحة كبيرة باستخدام أداة منتقي البيض.محاذاة الأجنة على الجانب البطني في نفس التوجه فيما يتعلق بالغايات الأمامية والخلفية. الانضمام إلى المسافة على غطاء وشرائط 10 ميكرولترات من الغراء heptane أسفل الزجاج غطاء مكشوف inset. في حين يجف الغراء، واستخدام شفرة حلاقة لقطع مستطيل حول صفين من الأجنة.قطع مستطيل الثاني بجوار الأول وإزالة المستطيل الثاني مع جانب حافة مستقيمة من ملعقة الفولاذ المقاوم للصدأ. حرك بعناية الحافة المستقيمة للمُسَقَق تحت المستطيل الأول وأزاله. ثم، ضع القطع مع الأجنة على الجانب الخارجي من طبق 3.5 سنتيمتر.تحت مجهر ستيريو، خفض غطاء المعدة على الأجنة واضغط بلطف على صفين من الأجنة على الغراء. إذا لم يكن أداء الحقن المجهري، وملء الفضاء سيليكون في منتصف الطريق إلى أعلى مع واحد إلى واحد زيت الهالكربون 700 إلى زيت الهالوكربون 27. خط الحواف السفلية لمحول لوحة ذات أربعة شرائح مع شريط مزدوج الوجه.سيمنع هذا الشريحة من الحركة أثناء التصوير. ضمان عدم وضع الشريط في مسار العدسة الهدف. قم بتحميل الغطاء على محول لوحة الشرائح الأربعة.إذا microinjecting الأجنة، ووضع غطاء مع الأجنة على شريحة لمنع الجزء السفلي من غطاء من أن تصبح قذرة أثناء الجفاف والضنجن الدقيق. قم بـ دق الأجنة لمدة خمس إلى عشر دقائق، ثم تغطيها على الفور بزيت الهالكربون واحد إلى واحد 700 إلى زيت الهالكربون 27، وملء مساحة السيليكون في منتصف الطريق إلى الأعلى. قم بتحميل إبرين أو ثلاثة حقنة صغيرة مع ما يقرب من اثنين من الحقن باستخدام طرف تحميل ممتد.جبل إبرة على الحقن المجهري والاكتئاب المكبس في منتصف الطريق إلى طرف، وزيادة ضغط الهواء داخل الشعيرات الدموية الزجاجية. خفض إبرة الزجاج على شريحة زجاجية وقطع غيض من إبرة مع شفرة حلاقة رقم 9 جديدة، وقطع في زاوية 45 درجة لإنتاج طرف مفتوحة حادة. يجب أن تتدفق الحقنة إلى أسفل الطرف دون أن تتدفق من الإبرة.إضافة بعناية 20 ميكرولترات من زيت الهالوكربون على طرف الإبرة وإعادة قطع فتحه في زاوية 45 درجة. يجب أن يبدأ حقن في التدفق بسرعة، لذلك تذكر لضبط الضغط عن طريق سحب المكبس. استخدام micromanipulator لوضع الإبرة في وسط مجال الرؤية.ثم ارفع الإبرة وأزل الشريحة الزجاجية من تحتها. ضع الأجنة على مرحلة المجهر الاستريو، تحت إبرة الحقن المجهري والتركيز عليها عند التكبير 50 مرة. خفض الإبرة حتى يأتي في نفس الطائرة التركيز مثل الأجنة.تحريك الشريحة بيد واحدة وتشغيل الحقن المجهري مع الآخر، حقن صف واحد من الأجنة. رفع الإبرة وتدوير الشريحة 180 درجة لفضح الصف الثاني من الأجنة لإبرة الحقن المجهري. خفض الإبرة وحقن الصف الثاني من الأجنة.وقد استخدم هذا البروتوكول لدراسة دور microtubules في إعادة تنظيم التشنج endoplasmic خلال الانقسام في الجنين Drosophila. تم مقارنة آثار العديد من العلاجات الدوائية الدقيقة على إعادة تنظيم ER كمياً. كولشيسين، الذي يمنع البلمرة microtubule جديدة، ووجد للحد بشكل كبير من توطين ER إلى قطبي المغزل خلال الانقسام.تم الحصول على بيانات التصوير الفاصل الزمني لـ 32 جنينًا. تم تحليل القياسات كثافة الحد الأقصى والأقصى من 12، 800 المناطق ذات الاهتمام باستخدام سيناريو MATLAB مخصص. عند محاولة هذا البروتوكول للمرة الأولى، تذكر ألا تأخذ وقتاً طويلاً في أي خطوة واحدة، وإلا فإنك تخاطر بفقدان مرحلة التطوير التي تريد تصويرها.ممارسة هذا البروتوكول خطوة بخطوة قبل محاولة أي تجارب. طريقة إعداد العينة لدينا تسهل الحصول المتزامن على أجنة متعددة خلال تجربة واحدة، وبالتالي توليد ما يكفي من التكرار التجريبي للتحليل الكمي. يمكن أن يساعد هذا البروتوكول في الانتقال من تجارب علم الأجنة في النمو من تجارب التصوير النوعي إلى الكمي.القدرة على صورة أجنة متعددة في جلسة تصوير واحدة يزيل أيضا الضوضاء التجريبية بين النسخ المتماثلة.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

حقن مكروي الجنين و Electroporation في حبلي<em&gt; Ciona المعوية</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

إعداد على نطاق متوسط ​​من<em&gt; ذبابة الفاكهة</em&gt; مقتطفات الجنين للتجارب بروتيوميك

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

في المختبر زراعة ovule للتصوير خلايا حية من الاستقطاب الزيجوت والزخرفة الجنين في التمويل نبات

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

عالية الدقة مجهر ابيسكوبي (هريم) - بروتوكولات بسيطة وقوية لمعالجة وتصور المواد العضوية

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

تصوير الخلايا الحية لفصل الكروموسومات أثناء الانقسام

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

النظام القائم على microinjection لفي غرس فيفو Cardiomyocytes الجنينية في جنين الطيور

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

التصوير الحي وتحليل تقلصات العضلات في جنين دروسوفيلا

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

ذوبان الجليد واستزراع كريوبريسيرفينج خطوط الخلايا المورفولوجية

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

المجهر الضوئي ورقه الخفيفة والمؤتمتة الخلايا النسب تحليلات لكتالوج Caenorhabditis الاجنه الجنينية مع القرار تحت الخلوية

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

إعداد دروسوفيلا رفال واختبارات Pupal لتحليل انقسام الخلايا في الأنسجة الحية والسليمة

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...