Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM og BR støttes af Center for Cellular Construction, en National Science Foundation (NSF) Science and Technology Center, under tilskudsaftale DBI-1548297. BR er også støttet gennem en NSF CAREER pris, 1553695.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Den protokol, der er beskrevet her, er meget alsidig og let kan tilpasses til at studere biologiske hændelser i en række forskellige faser i Drosophila embryonale udvikling. Denne protokol er velegnet til at studere biologiske processer, der forekommer over lange perioder. For eksempel, undersøgelser af cellulalisering29,30 eller dannelsen af heterochromatin domæner i Drosophila31,32 kunne drage fordel af at udnytte demetoder,der er beskrevet i denne protokol, da disse processer opstår over en længere periode. Desuden kan stikprøvestørrelsen øges ved at mindske forstørrelsen for at undersøge spørgsmål, der kræver mindre optisk opløsning,f.eks.  På samme måde giver et mål på 20x mulighed for, at to embryoner afbildes inden for et billedplan. Metoderne i denne protokol udgør en dynamisk platform til at stille biologiske spørgsmål ved hjælp af embryonal udvikling som modelsystem til kvantitativ analyse.
Der er 3 kritiske trin i denne protokol. Post dechorionation i 50% blegemiddel er det bydende nødvendigt, at embryoner skylles og tørres kraftigt 5 gange (2.3.4). Dette trin fjerner eventuelle rester små stykker af chorion. Sidesten chorion vil hindre synsfeltet, når billeddannelse fosteret. Ved montering af embryonerne på glasdækslipset (3.5) er det vigtigt at trykke embryonerne på limen med ensartet tryk. Dette vil placere embryoner på samme z fly. Når du skærer mikroinfektionsnålen op, er det vigtigt straks at trække stemplet tilbage for at justere nålens strømningshastighed, eller du mister alt dit injektormiddel.
Vores undersøgelse var begrænset af to faktorer. Den første faktor var ikke at have en automatiseret segmentering proces. Vi har designet et manuelt segmenteringsscript ved hjælp af MATLAB, dog; med en genetisk kodet spindel markør denne proces kunne automatiseres. I fremtiden vil vi gerne producere CNN-RFP21, Rtln1-GFP og CNN-RFP; ReepB-GFP transgene linjer for at muliggøre automatiseret spindelsegmentering. For mere information om vores MATLAB script og analyse pipeline, henvises til supplerende materialer af Diaz et al.15. For det andet var vi også begrænset af vores erhvervelse interval på 35 s, som kun tillod os at billedet 6 embryoner samtidigt. En længere erhvervelse interval ville give os mulighed for at billedet flere embryoner samtidigt. Selv om lægemiddelleveringsoverførselshastigheden kan øges ved at erstatte mikroinjektion med et gennemtrængende trin, fandt vi, at dette var unødvendigt, da vores stikprøvestørrelse allerede var begrænset af anskaffelsesintervallet.
Mens denne protokol blev brugt til at billedet Drosophila embryonale udvikling, den overordnede tilgang er fleksibel til at studere embryonale udvikling i andre multicellulære model systemer, såsom C. elegans, Søpindsvin, og Xenopus. Embryoner er yderst nyttige til kvantitativ analyse, da de let synkroniseres via indsamling eller befrugtning. Desuden bevæger embryoner sig ikke eller svømmer væk fra et synsfelt, hvilket gør det muligt at bruge en simpel multipunktsopkøbssoftware til at producere videoer med flere tidsforfald til kvantitativ analyse. Selv om vi brugte et højt indhold analysator i vores undersøgelse, enhver omvendt mikroskop system i stand til multipoint erhvervelse kan parres med de metoder, der henvises til heri.
Lignende resultater kan opnås ved hjælp af en multipoint erhvervelse i stand inverteret konfokal mikroskop; Men fordelene ved et højt indhold analysator fremstå som en øger stikprøvestørrelsen for at studere spørgsmål, der kræver mindre opløsning i tide. En indlysende fordel ved at bruge en høj indhold analysator er evnen til at billedet 4 separate dias samtidigt i forhold til 1 dias på traditionelle systemer. Med et komplet sæt på 4 dias og 40 embryoner på hvert dias kan 160 embryoner afbildes over flere timer, så længe anskaffelsesintervallet er mindst 15 min mellem rammerne. En anden vigtig fordel ved at bruge en høj indhold analysator er, at prøverne er helt afspærret fra eventuelle eksterne lyskilder, som er nødvendig for fluorescens intensitet-baserede målinger. Endelig har det høje indhold analysator, der anvendes i vores undersøgelse har en 5,5-megapixel CMOS kamera, som giver en generøs 221.87 μm synsfelt på 60x forstørrelse. Dette større synsfelt gjorde det muligt for os at afbilde et halvt embryon pr. anskaffelsespunkt.

I løbet af de sidste 30 år har fremskridt inden for billeddannelsesteknologier og molekylære sonder til livecellebilleddannelse fremmet vores forståelse af cellens kompleksitet og indre funktioner. Ledsagende denne fremskridt inden for teknologi er en større afhængighed af brugen af ex vivo celle kultur modeller for erhvervelse af høj gennemløbsscanning data. Cellekulturmodeller giver flere fordele, herunder kontrol af mikromiljøet gennem mikrofluidiske systemer og evnen til at afbilde flere celler samtidigt, hvilket gør det muligt at anvende kvantitative tilgange, der er nødvendige for screening med høj kapacitet1,2. Der er imidlertid også betydelige ulemper forbundet med cellekulturmodeller i forbindelse med morfologiske undersøgelser, såsom todimensionale glas- eller plastoverflader, der har tilhørende virkninger på cellemorfologien ogregulering 3,4,5. Disse virkninger kan give falske eller vildledende data med hensyn til studiet af biologiske processer, der regulerer cellulær morfologi.
Selv om alternativet har været at studere cellulær morfologi i forbindelse med en intakt organisme6, kun få egnede intakte organismer lette høj gennemløb kvantitative levende celle billeddannelse på grund af vanskeligheder med at holde hele organismer i live gennem ud billeddannelse, og udfordringer forbundet med billeddannelse inde i en stor flercellet organisme. Som følge heraf har cellebiologiske undersøgelser i intakte organismer generelt fokuseret på at observere en enkelt organisme over tid, hvilket i høj grad begrænser stikprøvestørrelsen. Desuden gør denne ene dyr-at-a-time-begrænsning levende billeddannelse vanskelig og dyr at anvende i form af en skærm og begrænser evnen til at anvende kvantitative analyseværktøjer, da antallet af prøver generelt er for lille. Således opstår behovet for en multicellulær model organisme, der kan bruges til højt indhold baseret kvantitative tilgange.
Denne protokol tilpasser Drosophila-embryonet til pladebaseret billeddannelse med højt indhold for at generere eksperimentelle stikprøvestørrelser, der er store nok til kvantitativ analyse. Drosophila melanogaster er almindeligt kendt som den første model organisme. Forskning ved hjælp af Drosophila har ført til gennembrud i celle- og molekylærbiologi, herunder overførsel af genetisk information, identifikation af cellesignalveje og genetiske krav til embryonal udvikling7,8,9. Desuden er Drosophila embryo blevet brugt til at udforske in vivo microtubule dynamik under cellulære division10,11,12. Brugen af mikroinjektion til at levere små molekyler og molekylære sonder giver tidsmæssig kontrol, der gør Drosophila embryonale udvikling særligt kraftfuld til sondering cellulære processer in vivo13,14. Men, genererer et betydeligt antal eksperimentelle gentagelser med en traditionel billeddannelse tilgang er yderst arbejdskrævende og har begrænset brug i høj-throughput imaging skærme og kvantitativ analyse. Vores tilgang gør brug af et højt indhold analysator typisk forbeholdt enkelt celle analyse og tilpasser in vivo billeddannelse analyse i syncytium af den tidlige Drosophila embryo.
Denne protokol blev brugt til at indsamle, fase, og microinject Drosophila embryoner til at udforske de mekanismer, der driver morfologiske ændringer i Endoplasmic Reticulum (ER) under mitose15. Selv om mange undersøgelser har skitseret den dynamiske karakter af ER i løbet af cellecyklus 16,17,18,19, det har været vanskeligt at sammenligne virkningerne af flere mikrens på tværs af tid på ER morfologi. For at identificere de komponenter, der driver ændringer i ER morfologi på tværs af celledeling, blev de metoder, der er anført i denne protokol, brugt til at undersøge mikrotubulis rolle og andre cytoskeletale faktorer på mitotisk ER-reorganisering ved hjælp af den kortikale synkrone division i det tidlige Drosophila-embryo. Samlet set tilgængeligheden af genetiske miks i Drosophila samfund, evnen til at mikroinject narkotika og molekylære sonder på præcise tidspunkter under udviklingen, og de billige omkostninger ved at arbejde med Drosophila gør denne tilgang meget modtagelig for høj-throughput image-baseret screening. De metoder, der er beskrevet her, gælder for at studere en bred vifte af cellulære og udviklingsmæssige processer in vivo ved hjælp af Drosophila embryo20. Specifikt, denne protokol er godt tilpasset til at studere biologiske hændelser, der opstår over en længere periode og inden for 100 mikron af Drosophila embryo cortex.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Moderne tilgange til kvantitativ levende cellebilleddannelse er blevet et vigtigt redskab til at udforske cellebiologi ved at gøre det muligt at anvende statistikker og beregningsmodeller til at klassificere og sammenligne biologiske processer. Selv om cellekultur model systemer er fantastisk til højt indhold billeddannelse, høj gennemløb undersøgelser af celle morfologi tyder på, at ex vivo kulturer er begrænset i recapitulating den morfologiske kompleksitet findes i celler i levende organismer. Som sådan er der behov for en skalerbar høj kapacitet model system til at billedet levende celler i en intakt organisme. Beskrevet her er en protokol for brug af et højt indhold billede analysator til samtidig erhverve flere time-lapse videoer af embryonale Drosophila melanogaster udvikling under syncytial blastoderm fase. Den syncytial blastoderm har traditionelt fungeret som en stor in vivo model for billeddannelse biologiske begivenheder; opnåelse af et betydeligt antal eksperimentelle replikater for kvantitative og høj-gennemløb tilgange har været arbejdskrævende og begrænset af billeddannelse af et enkelt foster pr eksperimentel gentagelse. Præsenteret her er en metode til at tilpasse billedbehandling og microinjection tilgange, der passer til et højt indhold billeddannelse system, eller enhver omvendt mikroskop i stand til automatiseret multipunkt erhvervelse. Denne tilgang gør det muligt samtidig at anskaffe 6-12 embryoner, afhængigt af de ønskede erhvervelsesfaktorer, inden for en enkelt billedbehandlingssession.

Den fremgangsmåde, der præsenteres i denne protokol, blev anvendt til at undersøge mikrotubulis rolle i endoplasmatisk reorganisering (ER) under mitose i Drosophila embryo15. Under mitose, strukturen af ER viser en dramatisk reorganisering, men de kræfter, der driver disse ændringer er dårligt forstået. For nylig, en familie af ER forme proteiner blev vist sig at fremme dannelsen af ER tubul25,26,27,28, som er kendt for deres nærhed med mikrotubuli28. For at studere rulle mikrotubuli på ER morfologi, de metoder, der er fastsat i protokollen blev brugt til at generere data til kvantitativt sammenligne virkningerne af flere microinjected lægemiddelbehandlinger på ER reorganisering under mitose. Colchicin, som forhindrer ny mikrotubule polymerisering, viste sig at drastisk reducere reorganiseringen af ER under mitose som vist i figur 5 og figur 6. Desuden gjorde den fremgangsmåde, der er beskrevet her, det muligt at få til at indsamle data om tidsomgange for 32 embryoner. Middelværdi- og max intensitetsmålinger blev fremstillet fra 12.800 interesseområder ved hjælp af et brugerdefineret MATLAB-script, som også genererede beskrivende og inferential statistik, der var afgørende for sammenligninger mellem lægemiddelbehandlinger. På grund af tilgængeligheden af molekylære sonder og den lethed af mikroinjektioner, de metoder, der er beskrevet her er let kan tilpasses til at studere en række biologiske processer via fluorescens intensitet kvantificering.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figur 5: Repræsentative billeder af Rtnl1-GFP og ReepB-GFP-berigelse ved spindelstængerne under mitose. a) 60x synsfelt af ReepB-GFP under mitose i cellecyklus 10. Den blå firkant repræsenterer det synsfelt, der bruges til paneler B-E. Panel A behandles med et binært tærskelfilter. Dette filter blev ikke anvendt på paneler B-E, da det udelukker data fra pixel under den fastsatte grænse. (B,D) ReepB-GFP i kontrol, og i colchicin. (C,E) Rtnl1-GFP i kontrol, og i colchicin. Dette tal er blevet ændret fra Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figur 6: Kvantisering af Rtnl1-GFP og ReepB-GFP-berigelse ved spindelstængerne under mitose. 20 spindler og 20 cytoplasma-RO'er på tværs af 10 rammer blev analyseret for 32 embryoner under følgende forhold. a) 10 % DMSO-kontrolinjekt injektioner for Rtnl1-GFP. Kontrolembryoner viste en 0,1 gange stigning i tilsætningen (p<0,001 for alle prøver på T210) sammenlignet med ikke-injicerede prøver (p < 0,001 for alle prøver på T210). b) ReepB-GFP-embryoner, der injiceres med 10 % DMSO, som skal fungere som kontrol. Kontrolembryoner viste en 0,1 gange større tilsætning (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med ikke-injicerede prøver (figur 1E; p < 0,001 for alle prøver på T210). c) Rtnl1-GFP-embryoner, der injiceres med 5 μM colchicin. Her målte vi en reduktion i Rtnl1-GFP berigelse til spindler (p < 0,001 for alle prøver på T210) sammenlignet med kontrol (A) (p < 0,001 for alle prøver på T210). d) ReepB-GFP-embryoner, der injiceres med 5 μM colchicin. Vi målte en reduktion i ReepB-GFP-berigelse til spindler (p<0,001 for alle prøver på T210) sammenlignet med kontrol (B) (p<0,001 for alle prøver på T210). Dette tal er blevet ændret fra Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Gær Sæt21</td>
			<td>2. Drueplader21</td>
			<td>3. Heptane Lim24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Tilsæt 7 gram aktiv tørgær til en 50 ml konisk. Tilsæt 9 milliliter DI vand og bland til selv konstans med en metal spatel.</td>
			<td>2.1 Gør opløsning a: Tilsæt 6 gram agar til 140 ml DI-vand i en 250 ml kolbe og autoklave det.</td>
			<td>3.1 Fyld et glasscintillationshætteglas med 50 tommer dobbeltsidet tape.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Tilsæt 7 gram aktiv tørgær til en 50 ml konisk. Tilsæt 9 milliliter DI vand og bland til selv konstans med en metal spatel.</td>
			<td>2.2 Gør opløsning b: Bland 0,1 gram methylparaben i 2 ml ethanol, og tilsæt derefter denne opløsning til 60 ml grapefrugtsaftkoncentrat.</td>
			<td>3.2 Der tilsættes 20 ml heptan og tætningsglasscintillationshætteglas med parafilm. Drej natten over ved stuetemperatur.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Umiddelbart efter autoclavingsopløsningen blandes opløsning b, og blandingen hældes i 10 x 35 mm pertiretter. (fremstiller 35 drueplader)</td>
			<td>3.3 Fjern plasttaperester ved at overføre lim til 2 15 ml koniske rør og centrifugering ved 3000 omdr./min. i 15 minutter.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Lad druepladerne indstilles ved stuetemperatur natten over med pladelåg af. Dækplader med låg og opbevares i 4C°, når de er indstillet.</td>
			<td>3.4 Limsupernatant overføres til 1,5 ml mikrocentrifugerør til opbevaring.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabel 1: Opskrifter på medier og løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Præsenteret her er en protokol til mikroinject og samtidig billede flere Drosophila embryoner under embryonale udvikling ved hjælp af en plade-baseret, højt indhold imager.

Drosophila Embryo Forberedelse og Microinjection for Levende Cell Mikroskopi Udført ved hjælp af en automatiseret højt indhold Analyzer

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Denne protokol muliggør samtidig erhvervelse af flere embryoner inden for én billedbehandlingssession. Mens prøveforberedelse er tilpasset til erhvervelse af flere point ved hjælp af en analysator med højt indhold, kan prøver, der er fremstillet ved hjælp af denne protokol, afbildes på ethvert omvendt mikroskop, der kan erhverve flere point. Til at begynde, organisere to rækker af 15 til 20 embryoner på en ren del af stor plade ved hjælp af et æg picker værktøj.Juster embryonerne på deres ventrale side i samme retning med hensyn til forreste og bageste ender. Klæbe en spacer på en coverslip og streak 10 mikroliter heptan lim ned udsatte coverslip glas indsat. Mens limen tørrer, skal du bruge et barberblad til at skære et rektangel omkring de to rækker af embryoner.Skær et andet rektangel ved siden af den første og fjerne det andet rektangel med en lige kant side af en rustfrit stål spatel. Skub forsigtigt spatelens lige kant under det første rektangel, og fjern det. Derefter placere udskæringen med embryoner på den udvendige side af en 3,5 centimeter skål.Under et stereomikroskop skal du sænke en forberedt dækslæd over embryonerne og forsigtigt trykke de to rækker af embryoner på limen. Hvis der ikke udføres mikroinjektion, fylde silikone afstandsuddelemning halvvejs til toppen med en-til-en halocarbon olie 700 til halocarbon olie 27. Line de nederste kanter af en fire-slide plade adapter med dobbeltsidet tape.Dette forhindrer diaset i at bevæge sig under billeddannelse. Sørg for ikke at placere båndet i stien til objektivet linsen. Monter dækslæbet på fire-slide plade adapter.Hvis embryonerne mikroinjecting sættes i, skal dækslen med embryoner sættes over et dias for at forhindre, at bunden af dæksækken bliver snavset under udiskring og mikroinjektion. Udtørre embryonerne i fem til 10 minutter, derefter straks dække dem med en-til-en halocarbon olie 700 til halocarbon olie 27, fylde silikone afstandsløb halvvejs til toppen. Læg to eller tre mikroinfektionnåle med ca. to mikroliter injean ved hjælp af en forlænget læssetip.Monter en nål på mikroinjektoren og tryk stemplet halvt ned til spidsen, hvilket øger lufttrykket inde i glaskapillæren. Sænk glasnålen på et glasrutsjebane og skær spidsen af nålen med et nyt nummer ni barbermaskine, der skærer i en 45 graders vinkel for at producere en skarp åben spids. Injektoren skal flyde ned til bunden af spidsen uden at strømme ud af nålen.Tilsæt forsigtigt 20 mikroliter halocarbonolie over spidsen af nålen og skær den igen i en vinkel på 45 grader. Injektoren skal begynde at flyde hurtigt, så husk at justere trykket ved at trække stemplet tilbage. Brug mikromanipulatoren til at placere nålen i midten af synsfeltet.Løft derefter nålen og fjern glasrutsjebanen under den. Placer embryonerne på stereomikroskopet fase, under mikroinjektion nålen og fokusere på dem på 50 gange forstørrelse. Sænk nålen, indtil den kommer ind i samme fokusplan som embryonerne.Hvis du flytter diaset med den ene hånd og betjener mikroinjektoren med den anden, skal du injicere den ene række embryoner. Hæv nålen og drej rutsjebanen 180 grader for at udsætte den anden række af embryoner for mikroinjektionsnålen. Sænk nålen og injicer den anden række af embryoner.Denne protokol blev brugt til at undersøge den rolle, som mikrotubuli i endoplasmic reticulum reorganisering under mitose i Drosophila embryo. Virkningerne af flere mikroindsjævnede lægemiddelbehandlinger på ER-reorganiseringen blev kvantitativt sammenlignet. Colchicin, som forhindrer nye mikrotubule polymerisering, blev fundet at drastisk reducere lokaliseringen af ER til spindel poler under mitose.Der blev indhentet data om scanning af tid for 32 embryoner. Gennemsnits- og max intensitetsmålinger blev analyseret fra 12.800 interesseområder ved hjælp af et brugerdefineret MATLAB-script. Når du forsøger denne protokol for første gang, skal du huske ikke at tage for lang tid på et enkelt trin, ellers risikerer du mangler din udviklingsmæssige fase, som du ønsker at billedet.Øv denne protokol trin for trin, før du forsøger at udføre eksperimenter. Vores metode til prøvepræparat letter en samtidig erhvervelse af flere embryoner under et eksperiment, hvilket genererer nok eksperimentelle replikater til kvantitativ analyse. Denne protokol kan hjælpe udviklingsmæssige embryologi overgang fra kvalitative til kvantitative billeddannelse eksperimenter.Evnen til at afbilde flere embryoner inden for en billedbehandlingssession eliminerer også eksperimentel støj mellem replikater.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Mikroinjektion og Elektroporering i Chordatzoologi<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Middelskala forberedelse af<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoekstrakter til proteomiske forsøg

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrkning for Live-celle Imaging af Zygote polarisering og Embryo mønstre i Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-Resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple og robuste protokoller til behandling og visualisering af organiske materialer

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle billeddannelse af kromosom Segregation under mitosen

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Mikroinjektion-baseret System for i Vivo Implantation af embryonale Cardiomyocytes i aviær Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Levende billeddannelse og analyse af muskelsammentrækninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Optøning, dyrkning og Cryopreserving Drosophila cellelinjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Præparat af Drosophila Larve og Pupal Testikler til analyse af celledeling i Levende, Intakt væv

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...