Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM et BR sont soutenus par le Center for Cellular Construction, un Centre des sciences et de la technologie de la National Science Foundation (NSF), en vertu de l’accord de subvention DBI-1548297. BR est également soutenu par un prix NSF CAREER, 1553695.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici est très polyvalent et facilement adaptable pour étudier les événements biologiques à divers stades du développement embryonnaire de Drosophila. Ce protocole est bien adapté pour étudier les processus biologiques qui se produisent sur de longues périodes de temps. Par exemple, des études sur la cellularisation29,30 ou la formation de domaines hétérochromatines dans Drosophila31,32 pourraientbénéficier de l’utilisation des méthodes décrites dans ce protocole puisque ces processus se produisent sur une longue période de temps. En outre, la taille de l’échantillon peut être augmentée en diminuant le grossissement pour étudier les questions qui nécessitent moins de résolution optique, comme le moment entre les divisions syncytiales33 ou la durée de la gastrulation34.  De même, un objectif 20x permet d’imager deux embryons dans un même plan d’imagerie. Les méthodes de ce protocole fournissent une plate-forme dynamique pour poser des questions biologiques en utilisant le développement embryonnaire comme un système modèle d’analyse quantitative.
Il y a 3 étapes critiques dans ce protocole. Après la déchorionation dans 50% d’eau de Javel, il est impératif que les embryons soient rincés et séchés vigoureusement 5 fois (2,3,4). Cette étape élimine les restes de petits morceaux de chorion. Les restes de chorion obstruent le champ de vision lors de l’imagerie de l’embryon. Lors du montage des embryons sur le couvercle en verre (3,5), il est important de presser les embryons sur la colle avec une pression uniforme. Cela placera les embryons sur le même plan z. Lorsque vous coupez l’aiguille de microinjection, il est important de rétracter immédiatement le piston pour ajuster le débit de l’aiguille ou vous perdrez tout votre injecteur.
Notre étude a été limitée par deux facteurs. Le premier facteur était de ne pas avoir de processus automatisé de segmentation. Nous avons conçu un script de segmentation manuelle à l’aide de MATLAB, cependant; avec un marqueur de fuseau génétiquement codé, ce processus pourrait être automatisé. À l’avenir, nous aimerions produire CNN-RFP21,Rtln1-GFP et CNN-RFP; Lignes transgéniques ReepB-GFP pour permettre la segmentation automatisée des fuseaux. Pour de plus amples renseignements sur notre pipeline de scripts et d’analyses MATLAB, consultez les documents supplémentaires de Diaz et coll.15. Deuxièmement, nous avons également été limités par notre intervalle d’acquisition de 35 s, qui ne nous a permis d’imager 6 embryons simultanément. Un intervalle d’acquisition plus long nous permettrait d’imager plus d’embryons simultanément. Bien que le débit de livraison de médicaments puisse être augmenté en remplaçant la microinjection par une étape de perméation, nous avons constaté que cela n’était pas nécessaire puisque la taille de notre échantillon était déjà limitée par intervalle d’acquisition.
Bien que ce protocole ait été utilisé pour l’image du développement embryonnaire de Drosophila, l’approche globale est adaptable pour étudier le développement embryonnaire dans d’autres systèmes modèles multicellulaires, tels que C. elegans,Oursins et Xenopus. Les embryons sont extrêmement utiles pour l’analyse quantitative puisqu’ils sont facilement synchronisés par collecte ou fécondation. En outre, les embryons ne se déplacent pas ou ne nagent pas loin d’un champ de vision, permettant l’utilisation d’un logiciel simple d’acquisition multipoint capable de produire plusieurs vidéos time lapse pour l’analyse quantitative. Bien que nous avons utilisé un analyseur à contenu élevé dans notre étude, tout système de microscope inversé capable d’acquisition multipoint peut être jumelé avec les méthodes mentionnées ci-après.
Des résultats similaires peuvent être obtenus à l’aide d’un microscope confocal inversé capable d’acquérir plusieurs points; cependant, les avantages d’un analyseur à contenu élevé émergent à mesure que l’on augmente la taille de l’échantillon pour étudier les questions qui nécessitent moins de résolution dans le temps. Un avantage évident à l’aide d’un analyseur à contenu élevé est la possibilité d’imager 4 diapositives distinctes simultanément par rapport à 1 diapositive sur les systèmes traditionnels. Avec un ensemble complet de 4 diapositives et 40 embryons sur chaque diapositive, 160 embryons peuvent être photographiés sur plusieurs heures, tant que l’intervalle d’acquisition est d’au moins 15 min entre les images. Un autre avantage important à l’aide d’un analyseur à haute teneur est que les échantillons sont complètement scellés à partir de toutes les sources de lumière externes, ce qui est nécessaire pour les mesures basées sur l’intensité de fluorescence. Enfin, l’analyseur à contenu élevé utilisé dans notre étude dispose d’un appareil photo CMOS de 5,5 mégapixels qui offre un champ de vision généreux de 221,87 μm au grossissement 60x. Ce champ de vision plus vaste nous a permis d’imager la moitié d’un embryon par point d’acquisition.

Au cours des 30 dernières années, les progrès des technologies d’imagerie et des sondes moléculaires pour l’imagerie cellulaire vivante ont fait progresser notre compréhension de la complexité et du fonctionnement interne de la cellule. Cette avancée technologique s’accompagne d’une plus grande dépendance à l’égard de l’utilisation de modèles de culture cellulaire ex vivo pour l’acquisition de données d’imagerie à haut débit. Les modèles de culture cellulaire offrent plusieurs avantages, y compris le contrôle du microenvironnement par des systèmes microfluidiques, et la capacité d’image de plusieurs cellules simultanément, permettant l’utilisation d’approches quantitatives nécessaires pour le criblage à hautdébit 1,2. Cependant, il y a également des inconvénients significatifs associés aux modèles de culture cellulaire dans le contexte des études morphologiques, telles que le verre bidimensionnel ou les surfaces en plastique produisant des effets confusionnels sur la morphologie cellulaire et sarégulation 3,4,5. Ces effets peuvent fournir des données fausses ou trompeuses en ce qui concerne l’étude des processus biologiques régissant la morphologie cellulaire.
Bien que l’alternative ait été d’étudier la morphologie cellulaire dans le contexte d’un organisme intact6, peu d’organismes intacts appropriés facilitent l’imagerie quantitative de cellules vivantes à haut débit en raison des difficultés à maintenir des organismes entiers vivants par l’imagerie, et des défis liés à l’imagerie à l’intérieur d’un grand organisme multicellulaire. Par conséquent, les études biologiques cellulaires chez les organismes intacts se sont généralement concentrées sur l’observation d’un seul organisme au fil du temps, ce qui limite considérablement la taille de l’échantillon. De plus, cette limitation d’un animal à la fois rend l’imagerie en direct difficile et coûteuse à utiliser sous la forme d’un écran et limite la capacité d’appliquer des outils d’analyse quantitative puisque le nombre d’échantillons est généralement trop faible. Ainsi, se pose la nécessité d’un organisme modèle multicellulaire qui peut être utilisé pour les approches quantitatives basées sur le contenu élevé.
Ce protocole adapte l’embryon de Drosophile à l’imagerie à haute teneur à base de plaques pour générer des tailles expérimentales d’échantillons suffisamment grandes pour une analyse quantitative. Drosophila melanogaster est communément connu comme le premier organisme modèle. La recherche utilisant Drosophila a mené à des percées dans la biologie cellulaire et moléculaire, y compris la transmission de l’information génétique, l’identification des voies de signalisation cellulaire, et les exigences génétiques du développement embryonnaire7,8,9. En outre, l’embryon de Drosophila a été utilisé pour explorer la dynamique in vivo microtubule au cours de la divisioncellulaire 10,11,12. L’utilisation de la microinjection pour livrer de petites molécules et des sondes moléculaires fournit le contrôle temporel qui rend le développement embryonnaire de Drosophila particulièrement puissant pour sonder des processus cellulaires in vivo13,14. Cependant, générer un nombre important de répétitions expérimentales avec une approche d’imagerie traditionnelle est extrêmement laborieux et a une utilisation limitée dans les écrans d’imagerie à haut débit et l’analyse quantitative. Notre approche utilise un analyseur à contenu élevé généralement réservé à l’analyse cellulaire unique et adapte l’analyse d’imagerie in vivo dans le syncytium du début de Drosophila embryo.
Ce protocole a été employé pour recueillir, étape, et embryons de Drosophila de microinject pour explorer les mécanismes qui conduisent des changements morphologiques dans le reticulum endoplasmique (ER) pendant la mitose15. Bien que de nombreuses études aient décrit la nature dynamique de l’ER au cours du cyclecellulaire 16,17,18,19, il a été difficile de comparer les effets de perturbations multiples à travers le temps sur la morphologie des ER. Pour identifier les composants qui conduisent des changements dans la morphologie d’urgence à travers la division cellulaire, les méthodes énumérées dans ce protocole ont été employées pour sonder le rôle des microtubules et d’autres facteurs cytosquelettiques sur la réorganisation mitotic d’urgence utilisant la division syncytiale corticale dans l’embryon tôt de Drosophila. Dans l’ensemble, la disponibilité de perturbations génétiques au sein de la communauté de Drosophila, la capacité de microinjecter des médicaments et des sondes moléculaires à des moments précis pendant le développement, et le coût peu coûteux de travailler avec Drosophila rend cette approche très agréable au criblage basé sur l’image à haut débit. Les méthodes décrites ici sont applicables pour l’étude d’une grande variété de processus cellulaires et développementaux in vivo utilisant l’embryon de Drosophila 20. Plus précisément, ce protocole est bien adapté pour étudier les événements biologiques qui se produisent sur une longue période et dans les 100 microns du cortex embryonnaire de Drosophila.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Les approches modernes en imagerie quantitative des cellules vivantes sont devenues un outil essentiel pour explorer la biologie cellulaire, en permettant l’utilisation de statistiques et de modélisation computationnelle pour classer et comparer les processus biologiques. Bien que les systèmes modèles de culture cellulaire soient excellents pour l’imagerie à haute teneur, des études à haut débit de morphologie cellulaire suggèrent que les cultures ex vivo sont limitées dans la récapitulation de la complexité morphologique que l’on trouve dans les cellules des organismes vivants. En tant que tel, il est nécessaire d’avoir un système évolutif modèle à haut débit pour l’image des cellules vivantes dans un organisme intact. Décrit ici est un protocole pour l’utilisation d’un analyseur d’image à contenu élevé pour acquérir simultanément plusieurs vidéos time-lapse de développement embryonnaire Drosophila melanogaster au cours de l’étape syncytiale blastoderm. Le blastoderm syncytial a traditionnellement servi de grand modèle in vivo pour l’imagerie des événements biologiques; cependant, l’obtention d’un nombre significatif de répliques expérimentales pour les approches quantitatives et à haut débit a été laborinelle et limitée par l’imagerie d’un seul embryon par répétition expérimentale. Présenté ici est une méthode pour adapter l’imagerie et les approches de microinjection pour convenir à un système d’imagerie à haute teneur, ou tout microscope inversé capable d’acquisition automatisée multipoint. Cette approche permet l’acquisition simultanée de 6 à 12 embryons, selon les facteurs d’acquisition souhaités, en une seule séance d’imagerie.

L’approche présentée dans ce protocole a été employée pour examiner le rôle des microtubules dans la réorganisation endoplasmique de Reticulum (ER) pendant la mitose dans l’embryon de Drosophila 15. Pendant la mitose, la structure des ER montre une réorganisation spectaculaire, cependant, les forces qui conduisent ces changements sont mal comprises. Récemment, une famille de protéines de formation d’ER ont été montrées pour favoriser la formation du tubuled’ER 25,26,27,28,qui sont connus pour leur proximité avec des microtubules28. Pour étudier le rôle des microtubules sur la morphologie des urgences, les méthodes fournies dans le protocole ont été utilisées pour générer des données afin de comparer quantitativement les effets de plusieurs traitements médicamenteux microinjectés sur la réorganisation des urgences pendant la mitose. La colchicine, qui empêche une nouvelle polymérisation des microtubules, a considérablement réduit la réorganisation de l’ER pendant la mitose, comme le montrent la figure 5 et la figure 6. En outre, l’approche décrite ici a permis la production de données d’imagerie des tours de temps pour 32 embryons. Des mesures d’intensité moyenne et maximale ont été produites à partir de 12 800 régions d’intérêt à l’aide d’un script MATLAB personnalisé, qui a également généré des statistiques descriptives et inférentielles essentielles pour faire des comparaisons entre les traitements médicamenteux. En raison de la disponibilité des sondes moléculaires et de la facilité des microinjections, les méthodes décrites ici sont facilement adaptables pour étudier une variété de processus biologiques par le biais de la quantification de l’intensité de fluorescence.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figure 5 : Images représentatives de l’enrichissement de Rtnl1-GFP et reepB-GFP aux poteaux de fuseaux pendant la mitose. (A) champ de vision 60x de ReepB-GFP pendant la mitose dans le cycle cellulaire 10. Le carré bleu représente le champ de vision utilisé pour les panneaux B-E. Le panneau A est traité avec un filtre binaire de seuil. Ce filtre n’a pas été appliqué aux panneaux B-E puisqu’il exclut les données des pixels en dessous du seuil défini. (B,D) ReepB-GFP en contrôle, et en colchicine. (C,E) Rtnl1-GFP en contrôle, et en colchicine. Ce chiffre a été modifié de Diaz et coll.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figure 6 : Quantitation de l’enrichissement de Rtnl1-GFP et reepB-GFP aux poteaux de fuseau pendant la mitose. 20 broches et 20 IRM cytoplasmiques sur 10 images ont été analysées pour 32 embryons dans les conditions suivantes. (A) 10% injections de contrôle DMSO pour rtnl1-GFP. Les embryons de contrôle ont montré une augmentation de 0,1 fois l’enrichissement (p<0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux échantillons non injectés (p < 0,001 pour tous les échantillons à T210). (B) Embryons ReepB-GFP injectés avec 10% DMSO pour servir de contrôle. Les embryons de contrôle ont montré une augmentation de 0,1 fois l’enrichissement (p<0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux échantillons non injectés(figure 1E; p < 0,001 pour tous les échantillons à T210). (C) Embryons Rtnl1-GFP injectés avec 5 μM Colchicine. Ici, nous avons mesuré une réduction de l’enrichissement rtnl1-GFP aux broches (p < 0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux contrôles (A) (p < 0,001 pour tous les échantillons à T210). (D) Embryons ReepB-GFP injectés avec 5 μM Colchicine. Nous avons mesuré une réduction de l’enrichissement reepB-GFP aux broches (p<0,001 pour tous les échantillons à T210) par rapport aux témoins (B) (p<0,001 pour tous les échantillons à T210). Ce chiffre a été modifié de Diaz et coll.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Pâte de levure21</td>
			<td>2. Assiettes de raisin21</td>
			<td>3. Colle heptane24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Ajouter 7 grammes de levure sèche active à un cône de 50 ml. Ajouter 9 millilitres d’eau DI et mélanger jusqu’à la constance à l’aide d’une spatule métallique.</td>
			<td>2.1 Faire la solution a: Ajouter 6 grammes d’agar à 140ml d’eau DI dans un flacon de 250ml et l’autoclave.</td>
			<td>3.1 Remplissez un flacon de scintillation en verre de 50 pouces de ruban adhésif à double face.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Ajouter 7 grammes de levure sèche active à un cône de 50 ml. Ajouter 9 millilitres d’eau DI et mélanger jusqu’à la constance à l’aide d’une spatule métallique.</td>
			<td>2.2 Faire la solution b : Mélanger 0,1 gramme de parabène méthylique dans 2 ml d’éthanol, puis ajouter cette solution à 60 ml de concentré de jus de pamplemousse.</td>
			<td>3.2 Ajouter 20 ml d’heptane et sceller le flacon de scintillation en verre avec le parafilm. Faire pivoter toute la nuit à température ambiante.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Immédiatement après la solution d’autoclaving a, mélanger dans la solution b et verser le mélange dans des plats perti de 10 x 35mm. (fait 35 assiettes de raisin)</td>
			<td>3.3 Enlever les débris de ruban adhésif en plastique en transférant la colle dans 2 tubes coniques de 15 ml et en les centrifugant à 3 000 rpm pendant 15 minutes.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Laisser les assiettes de raisin s’installer à température ambiante pendant la nuit, les couvercles des assiettes éteints. Couvrir les assiettes de couvercles et les conserver à 4°C après qu’elles soient réglées.</td>
			<td>3.4 Transférer le supernatant de colle dans des tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml pour le stockage.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Recettes de médias et de solutions.

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Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Présenté ici est un protocole de microinject et simultanément l’image de plusieurs embryons de Drosophila au cours du développement embryonnaire à l’aide d’une plaque à base, imageur à haute teneur.

Préparation et microinjection d’embryons de drosophile pour la microscopie cellulaire vivante effectuée à l’aide d’un analyseur automatisé à contenu élevé

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Ce protocole permet l’acquisition simultanée de plusieurs embryons en une seule séance d’imagerie. Bien que la préparation de l’échantillon soit adaptée pour l’acquisition en plusieurs points à l’aide d’un analyseur à contenu élevé, les échantillons préparés à l’aide de ce protocole peuvent être photographiés sur n’importe quel microscope inversé capable d’acquérir plusieurs points. Pour commencer, organisez deux rangées de 15 à 20 embryons sur une section propre de grande plaque à l’aide d’un outil de cueilleur d’ovules.Aligner les embryons sur leur côté ventral dans la même orientation par rapport aux extrémités antérieures et postérieures. Adhérez un espaceur sur un coverslip et strie 10 microlitres de colle d’heptane vers le bas de l’encart de verre de coverslip exposé. Pendant que la colle sèche, utilisez une lame de rasoir pour couper un rectangle autour des deux rangées d’embryons.Couper un deuxième rectangle à côté du premier et retirer le deuxième rectangle avec un côté droit bord d’une spatule en acier inoxydable. Faites glisser délicatement le bord droit de la spatule sous le premier rectangle et retirez-le. Ensuite, placez la découpe avec des embryons sur le côté externe d’un plat de 3,5 centimètres.Au microscope stéréo, abaissez un couvercle préparé sur les embryons et appuyez doucement sur les deux rangées d’embryons sur la colle. Si vous n’effectuez pas de microinjection, remplissez l’espaceur en silicone à mi-chemin vers le haut avec de l’huile d’halocarbone 700 à l’huile d’halocarbone 27. Tapisser les bords inférieurs d’un adaptateur de plaque à quatre glissières d’un ruban adhésif à double face.Cela empêchera la diapositive de se déplacer pendant l’imagerie. Assurez-vous de ne pas placer la bande sur le chemin de l’objectif. Montez le coverslip sur l’adaptateur de plaque à quatre diapositives.Si vous microinjecter les embryons, placez le coverslip avec des embryons sur une diapositive pour empêcher le fond de la couverture de se salir pendant la dessiccation et la microinjection. Dessiccate les embryons pendant cinq à 10 minutes, puis couvrez-les immédiatement avec de l’huile d’halocarbone 700 à l’huile d’halocarbone 27, remplissant l’espaceur de silicone à mi-chemin vers le haut. Chargez deux ou trois aiguilles de microinjection avec environ deux microlitres d’injecteur à l’aide d’une pointe de chargement prolongée.Monter une aiguille sur le microinjecteur et déprimer le piston à mi-hauteur de la pointe, augmentant la pression d’air à l’intérieur du capillaire en verre. Abaissez l’aiguille en verre sur une glissière en verre et coupez la pointe de l’aiguille avec un nouveau rasoir numéro neuf, en coupant à un angle de 45 degrés pour produire une pointe ouverte nette. L’injecteur doit descendre au fond de la pointe sans sortir de l’aiguille.Ajouter délicatement 20 microlitres d’huile d’halocarbone sur la pointe de l’aiguille et la couper à nouveau ouverte à un angle de 45 degrés. L’injecteur doit commencer à circuler rapidement, alors n’oubliez pas d’ajuster la pression en rétractant le piston. Utilisez le micromanipulateur pour positionner l’aiguille au centre du champ de vision.Soulevez ensuite l’aiguille et retirez la glissière de verre de dessous. Placez les embryons au stade du microscope stéréo, sous l’aiguille de microinjection et concentrez-vous sur eux à 50 fois le grossissement. Abaissez l’aiguille jusqu’à ce qu’elle entre dans le même plan de mise au point que les embryons.Déplacer la diapositive d’une main et faire fonctionner le microinjecteur de l’autre, injecter une rangée d’embryons. Soulevez l’aiguille et faites pivoter la glissière à 180 degrés pour exposer la deuxième rangée d’embryons à l’aiguille de microinjection. Abaissez l’aiguille et injectez la deuxième rangée d’embryons.Ce protocole a été employé pour examiner le rôle des microtubules dans la réorganisation endoplasmique de reticulum pendant la mitose dans l’embryon de Drosophila. Les effets de plusieurs traitements médicamenteux microinjectés sur la réorganisation des services d’assurance-santé ont été comparés quantitativement. La colchicine, qui empêche la nouvelle polymérisation des microtubules, a considérablement réduit la localisation des ER aux poteaux de fuseaux pendant la mitose.Des données de formation image de time lapse ont été acquises pour 32 embryons. Des mesures d’intensité moyenne et maximale ont été analysées à partir de 12 800 régions d’intérêt à l’aide d’un script MATLAB personnalisé. Lorsque vous essayez ce protocole pour la première fois, n’oubliez pas de ne pas prendre trop de temps sur une seule étape, sinon vous risquez de manquer votre stade de développement que vous voulez l’image.Pratiquez ce protocole étape par étape avant de tenter des expériences. Notre méthode de préparation de l’échantillon facilite l’acquisition simultanée d’embryons multiples au cours d’une expérience, générant ainsi suffisamment de répliques expérimentales pour l’analyse quantitative. Ce protocole peut aider à la transition de l’embryologie développementale des expériences d’imagerie qualitative à quantitative.La capacité d’image de plusieurs embryons en une seule séance d’imagerie élimine également le bruit expérimental entre les répliques.

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