Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM und BR werden vom Center for Cellular Construction, einem Wissenschafts- und Technologiezentrum der National Science Foundation (NSF), im Rahmen des Zuschussvertrags DBI-1548297 unterstützt. BR wird auch durch einen NSF CAREER Award, 1553695, unterstützt.

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Die Autoren haben nichts zu verraten.

Das hier beschriebene Protokoll ist sehr vielseitig und leicht anpassungsfähig für die Untersuchung biologischer Ereignisse in einer Vielzahl von Stadien der Embryonalentwicklung von Drosophila. Dieses Protokoll eignet sich gut für die Untersuchung biologischer Prozesse, die über lange Zeiträume hinweg auftreten. Zum Beispiel, Studien der Zellularisierung29,30 oder die Bildung von Heterochromatin-Domänen in Drosophila31,32 könnte von der Verwendung der in diesem Protokoll beschriebenen Methoden profitieren, da diese Prozesse über einen längeren Zeitraum auftreten. Darüber hinaus kann die Stichprobengröße durch abnehmende Vergrößerung erhöht werden, um Fragen zu untersuchen, die weniger optische Auflösung erfordern, wie z. B. das Timing zwischen den Synzytial-Divisionen33 oder die Dauer der Gastrulation34.  Ebenso ermöglicht ein 20-faches Objektiv die Abbildung von zwei Embryonen innerhalb einer Bildebene. Die Methoden in diesem Protokoll bieten eine dynamische Plattform, um biologische Fragen zu stellen, indem sie die embryonale Entwicklung als Modellsystem für die quantitative Analyse verwenden.
Dieses Protokoll besteht aus drei wichtigen Schritten. Nach der Dechorionation bei 50% Bleichmittel ist es zwingend erforderlich, dass Embryonen fünfmal kräftig gespült und getrocknet werden (2.3.4). Dieser Schritt entfernt alle übrig gebliebenen kleinen Akkordstücke. Übrige Chorion wird das Sichtfeld bei der Abbildung des Embryos behindern. Bei der Montage der Embryonen auf den Glasdeckel (3.5) ist es wichtig, die Embryonen mit gleichmäßigem Druck auf den Leim zu drücken. Dadurch werden die Embryonen auf der gleichen z-Ebene platziert. Beim Schneiden der Mikroinjektionsnadel ist es wichtig, den Kolben sofort zurückzuziehen, um die Durchflussrate der Nadel einzustellen, oder Sie verlieren alle Ihre Injektion.
Unsere Studie wurde durch zwei Faktoren begrenzt. Der erste Faktor war kein automatisierter Segmentierungsprozess. Wir haben jedoch ein manuelles Segmentierungsskript mit MATLAB entwickelt; mit einem genetisch kodierten Spindelmarker könnte dieser Prozess automatisiert werden. In Zukunft möchten wir CNN-RFP21, Rtln1-GFP und CNN-RFP produzieren; Transgene ReepB-GFP-Linien zur automatisierten Spindelsegmentierung. Weitere Informationen zu unserer MATLAB-Skript- und Analysepipeline finden Sie unter ergänzenden Materialien von Diaz et al.15. Zweitens waren wir auch durch unser Erfassungsintervall von 35 s eingeschränkt, was uns nur erlaubte, 6 Embryonen gleichzeitig abzubilden. Ein längeres Erfassungsintervall würde es uns ermöglichen, mehr Embryonen gleichzeitig abzubilden. Obwohl der Durchsatz der Arzneimittelabgabe erhöht werden kann, indem die Mikroinjektion durch einen Permeationsschritt ersetzt wird, hielten wir dies für unnötig, da unsere Stichprobengröße bereits durch das Erfassungsintervall begrenzt war.
Während dieses Protokoll verwendet wurde, um Drosophila embryonale Entwicklung abzubilden, ist der Gesamtansatz anpassungsfähig für die Untersuchung der embryonalen Entwicklung in anderen multizellulären Modellsystemen, wie C. elegans, Sea Urchins, und Xenopus. Embryonen sind äußerst nützlich für die quantitative Analyse, da sie leicht durch Entnahme oder Befruchtung synchronisiert werden können. Darüber hinaus bewegen sich Embryonen nicht aus einem Sichtfeld oder schwimmen weg, was die Verwendung einer einfachen Multipoint-Erfassungssoftware ermöglicht, um mehrere Zeitraffervideos für die quantitative Analyse zu erstellen. Obwohl wir in unserer Studie einen Analyser mit hohem Inhalt verwendet haben, kann jedes invertierte Mikroskopsystem, das multipoint-erfassung ist, mit den hier genannten Methoden gekoppelt werden.
Ähnliche Ergebnisse können mit einem Multipoint-Erfassungsfähigen invertierten konfokalen Mikroskop erzielt werden; Die Vorteile eines Analyseprogramms mit hohem Inhalt ergeben sich jedoch, wenn die Stichprobengröße erhöht wird, um Fragen zu untersuchen, die weniger zeitliche Auflösung erfordern. Ein offensichtlicher Vorteil bei der Verwendung eines Analysators mit hohem Inhalt ist die Möglichkeit, 4 separate Dias gleichzeitig abzubilden, verglichen mit 1 Folie auf herkömmlichen Systemen. Mit einem vollständigen Satz von 4 Dias und 40 Embryonen auf jedem Dia können 160 Embryonen über mehrere Stunden abgebildet werden, solange das Erfassungsintervall mindestens 15 min zwischen den Rahmen beträgt. Ein weiterer wichtiger Vorteil bei der Verwendung eines Hochgehaltsanalysators besteht darin, dass die Proben vollständig von externen Lichtquellen abgeschottet sind, was für fluoreszenzintensitätsbasierte Messungen erforderlich ist. Schließlich verfügt der in unserer Studie verwendete High-Content-Analysator über eine 5,5-Megapixel-CMOS-Kamera, die ein großzügiges Sichtfeld von 221,87 m bei 60-facher Vergrößerung bietet. Dieses größere Sichtfeld ermöglichte es uns, einen halben Embryo pro Erfassungspunkt abzubilden.

In den letzten 30 Jahren haben Fortschritte in bildgebenden Technologien und molekularen Sonden für die Live-Zell-Bildgebung unser Verständnis der Komplexität und des inneren Funktionierens der Zelle erweitert. Begleitet wird dieser technologische Fortschritt durch die Verwendung von Ex-vivo-Zellkulturmodellen für die Erfassung von Bilddaten mit hohem Durchsatz. Zellkulturmodelle bieten mehrere Vorteile, einschließlich der Steuerung der Mikroumgebung durch mikrofluidische Systeme und die Möglichkeit, mehrere Zellen gleichzeitig abzubilden, was die Verwendung quantitativer Ansätze ermöglicht, die für das Hochdurchsatzscreening1,2erforderlich sind. Es gibt jedoch auch erhebliche Nachteile, die mit Zellkulturmodellen im Kontext morphologischer Studien verbunden sind, wie zweidimensionale Glas- oder Kunststoffoberflächen, die verwirrende Effekte auf die Zellmorphologie und ihre Regulation3,4,5erzeugen. Diese Effekte können falsche oder irreführende Daten in Bezug auf die Untersuchung biologischer Prozesse liefern, die die zelluläre Morphologie regulieren.
Obwohl die Alternative darin besteht, die zelluläre Morphologie im Kontext eines intakten Organismus zu untersuchen6, nur wenige geeignete intakte Organismen ermöglichen quantitative Lebendzellbilder mit hohem Durchsatz aufgrund von Schwierigkeiten, ganze Organismen durch Bildgebung am Leben zu erhalten, und Herausforderungen, die mit der Bildgebung in einem großen multizellulären Organismus verbunden sind. Infolgedessen konzentrierten sich zellbiologische Studien an intakten Organismen im Allgemeinen auf die Beobachtung eines einzelnen Organismus im Laufe der Zeit, was die Probengröße stark einschränkt. Darüber hinaus macht diese Ein-Tier-zu-eine-Zeit-Beschränkung die Verwendung von Live-Bildgebung in Form eines Bildschirms schwierig und kostspielig und schränkt die Fähigkeit ein, quantitative Analysewerkzeuge anzuwenden, da die Anzahl der Proben im Allgemeinen zu gering ist. So entsteht die Notwendigkeit eines multizellulären Modellorganismus, der für hochgehaltbasierte quantitative Ansätze verwendet werden kann.
Dieses Protokoll passt den Drosophila-Embryo für plattenbasierte Bildgebung mit hohem Gehalt an, um experimentelle Probengrößen zu generieren, die groß genug für quantitative Analysen sind. Drosophila melanogaster ist allgemein bekannt als der erste Modellorganismus. Die Forschung mit Drosophila hat zu Durchbrüchen in der Zell- und Molekularbiologie geführt, einschließlich der Übertragung genetischer Informationen, der Identifizierung von Zellsignalwegen und genetischen Anforderungen der embryonalen Entwicklung7,8,9. Darüber hinaus wurde der Drosophila-Embryo verwendet, um die In-vivo-Mikrotubuli-Dynamik während der zellulären Teilung10,11,12zu erforschen. Der Einsatz von Mikroinjektion zur Lieferung kleiner Moleküle und molekularer Sonden bietet eine zeitliche Kontrolle, die die embryonale Entwicklung von Drosophila besonders leistungsfähig für die Untersuchung zellulärer Prozesse in vivo13,14macht. Die Generierung einer signifikanten Anzahl experimenteller Wiederholungen mit einem traditionellen bildgebenden Ansatz ist jedoch äußerst arbeitsintensiv und hat nur einen begrenzten Einsatz in bildgebenden Bildschirmen mit hohem Durchsatz und quantitativer Analyse. Unser Ansatz nutzt einen Hochgehaltsanalysator, der typischerweise für einzellige Analysen reserviert ist, und passt die in vivo-Bildgebungsanalyse im Syncytium der frühen Drosophila embryo an.
Dieses Protokoll wurde verwendet, um Drosophila-Embryonen zu sammeln, zu inszenieren und zu mikroinjizieren, um die Mechanismen zu erforschen, die morphologische Veränderungen im Endoplasmaischen Retikulum (ER) während der Mitose15vorantreiben. Obwohl viele Studien die dynamische Natur des ER während des Zellzyklus16,17,18,19skizziert haben, war es schwierig, die Auswirkungen mehrerer Störungen über die Zeit auf die ER-Morphologie zu vergleichen. Um die Komponenten zu identifizieren, die Veränderungen in der ER-Morphologie über die Zellteilung hinweg vorantreiben, wurden die in diesem Protokoll aufgeführten Methoden verwendet, um die Rolle von Mikrotubuli und anderen zytoskelettalen Faktoren bei der mitotischen ER-Reorganisation mithilfe der kortikalen synzytialen Teilung im frühen Drosophila-Embryo zu untersuchen. Zusammengenommen machen die Verfügbarkeit genetischer Störungen innerhalb der Drosophila-Gemeinschaft, die Fähigkeit, Medikamente und molekulare Sonden zu genauen Zeiten während der Entwicklung mikroinjizieren, und die kostengünstigen Kosten für die Arbeit mit Drosophila diesen Ansatz sehr freundlich für ein bildbasiertes Screening mit hohem Durchsatz. Die hier beschriebenen Methoden sind für die Untersuchung einer Vielzahl von zellulären und Entwicklungsprozessen in vivo mit dem Drosophila Embryo20anwendbar. Insbesondere ist dieses Protokoll gut angepasst, um biologische Ereignisse zu untersuchen, die über einen längeren Zeitraum und innerhalb von 100 Mikrometern des Drosophila Embryokortex auftreten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Moderne Ansätze in der quantitativen Livezellbildgebung sind zu einem wesentlichen Werkzeug für die Erforschung der Zellbiologie geworden, indem sie die Verwendung von Statistiken und computergestützter Modellierung zur Klassifizierung und Zum Vergleich biologischer Prozesse ermöglichen. Obwohl Zellkulturmodellsysteme für bildgebende Aufnahmen mit hohem Gehalt hervorragend sind, deuten Studien mit hohem Durchsatz der Zellmorphologie darauf hin, dass Ex-vivo-Kulturen bei der Rekapitulation der morphologischen Komplexität, die in Zellen in lebenden Organismen vorkommt, begrenzt sind. Daher ist ein skalierbares Modellsystem mit hohem Durchsatz erforderlich, um lebende Zellen innerhalb eines intakten Organismus abzubilden. Hier wird ein Protokoll für die Verwendung eines hochauflösenden Bildanalysators beschrieben, um gleichzeitig mehrere Zeitraffervideos der embryonalen Drosophila-Melanogaster-Entwicklung während der synzytialen Blastoderm-Phase zu erfassen. Das synzytiale Blastoderm diente traditionell als großartiges In-vivo-Modell für die Abbildung biologischer Ereignisse; Die Erlangung einer signifikanten Anzahl experimenteller Replikationen für quantitative und Hochdurchsatzansätze war jedoch arbeitsintensiv und durch die Abbildung eines einzelnen Embryos pro experimenteller Wiederholung begrenzt. Hier wird eine Methode vorgestellt, um bildgebende und Mikroinjektionsansätze an ein Bildgebungssystem mit hohem Inhalt oder ein invertiertes Mikroskop anzupassen, das in der Lage ist, eine automatisierte Multipoint-Erfassung zu erzielen. Dieser Ansatz ermöglicht die gleichzeitige Erfassung von 6-12 Embryonen, abhängig von den gewünschten Erfassungsfaktoren, innerhalb einer einzigen Bildgebungssitzung.

Der in diesem Protokoll vorgestellte Ansatz wurde verwendet, um die Rolle von Mikrotubuli bei der Reorganisation von Endoplasmaic Reticulum (ER) während der Mitose im Drosophila-Embryo 15zu untersuchen. Während der Mitose zeigt die Struktur des ER eine dramatische Reorganisation, aber die Kräfte, die diese Veränderungen vorantreiben, sind schlecht verstanden. Kürzlich wurde gezeigt, dass eine Familie von ER-Formierproteinen die Bildung von ER Tubule25,26,27,28, fördert, die für ihre Nähe zu Mikrotubuli28bekannt sind. Um die Rolle der Mikrotubuli auf er-Morphologie zu untersuchen, wurden die im Protokoll vorgesehenen Methoden verwendet, um Daten zu generieren, um die Auswirkungen mehrerer mikroinjizierter Arzneimittelbehandlungen auf die ER-Reorganisation während der Mitose quantitativ zu vergleichen. Colchicin, das eine neue Mikrotubulipolymerisation verhindert, hat festgestellt, dass es die Reorganisation des ER während der Mitose drastisch reduziert, wie in Abbildung 5 und Abbildung 6dargestellt. Darüber hinaus ermöglichte der hier beschriebene Ansatz die Erstellung von Zeitrunden-Bilddaten für 32 Embryonen. Mittelwert- und Max-Intensitätsmessungen wurden aus 12.800 Interessengebieten mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript erstellt, das auch beschreibende und inferentiale Statistiken generierte, die für Vergleiche zwischen medikamentösen Behandlungen unerlässlich sind. Aufgrund der Verfügbarkeit molekularer Sonden und der Einfachen von Mikroinjektionen sind die hier beschriebenen Methoden leicht anpassungsfähig, um eine Vielzahl biologischer Prozesse mittels Fluoreszenzintensitätsquantifizierung zu untersuchen.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Bilder der Rtnl1-GFP- und ReepB-GFP-Anreicherung an den Spindelstangen während der Mitose. (A) 60x Sichtfeld von ReepB-GFP während der Mitose im Zellzyklus 10. Das blaue Quadrat stellt das Sichtfeld dar, das für die Bedienfelder B-E verwendet wird. Panel A wird mit einem binären Schwellenwertfilter verarbeitet. Dieser Filter wurde nicht auf die Bedienfelder B-E angewendet, da er Daten von Pixeln unterhalb des festgelegten Schwellenwerts ausschließt. (B,D) ReepB-GFP unter Kontrolle und in Colchicin. (C,E) Rtnl1-GFP unter Kontrolle und in Colchicin. Diese Zahl wurde von Diaz et al.15geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Abbildung 6: Quantifizierung der Rtnl1-GFP- und ReepB-GFP-Anreicherung an den Spindelstangen während der Mitose. 20 Spindeln und 20 Zytoplasma-ROIs über 10 Frames wurden für 32 Embryonen unter folgenden Bedingungen analysiert. (A) 10% DMSO-Kontrollinjektionen für Rtnl1-GFP. Kontrollembryonen zeigten eine 0,1-fache Erhöhung der Anreicherung (p<0.001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu nicht injizierten Proben (p < 0,001 für alle Proben bei T210). (B) ReepB-GFP-Embryonen, die mit 10 % DMSO injiziert werden, um als Kontrolle dienen. Kontrollembryonen zeigten eine 0,1-fache Erhöhung der Anreicherung (p<0.001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu nicht injizierten Proben(Abbildung 1E; p < 0,001 für alle Proben bei T210). (C) Rtnl1-GFP-Embryonen, die mit 5 M Colchicin injiziert werden. Hier haben wir eine Reduktion der Rtnl1-GFP-Anreicherung auf Spindeln (p < 0,001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu den Kontrollen (A) (p < 0,001 für alle Proben bei T210) gemessen. (D) ReepB-GFP-Embryonen, die mit 5 M Colchicin injiziert werden. Wir haben eine Reduktion der ReepB-GFP-Anreicherung auf Spindeln (p<0.001 für alle Proben bei T210) im Vergleich zu den Kontrollen (B) (p<0.001 für alle Proben bei T210) gemessen. Diese Zahl wurde von Diaz et al.15geändert. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Hefepaste21</td>
			<td>2. Traubenteller21</td>
			<td>3. Heptankleber24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 7 Gramm aktive Trockenhefe zu einem 50 ml konischen geben. Fügen Sie 9 Milliliter DI-Wasser hinzu und mischen Sie mit einem Metallspachtel gleichmäßige Konstanz.</td>
			<td>2.1 Lösung a: Fügen Sie 6 Gramm Agar zu 140ml DI-Wasser in einem 250ml Kolben hinzu und autoklavieren Sie es.</td>
			<td>3.1 Füllen Sie eine Glasszintillationsflasche mit 50 Zoll doppelseitigem Klebeband.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 7 Gramm aktive Trockenhefe zu einem 50 ml konischen geben. Fügen Sie 9 Milliliter DI-Wasser hinzu und mischen Sie mit einem Metallspachtel gleichmäßige Konstanz.</td>
			<td>2.2 Lösung b herstellen: 0,1 Gramm Methylparaben in 2ml Ethanol mischen und dann 60 ml Grapefruitsaftkonzentrat hinzufügen.</td>
			<td>3.2 20 ml Heptan hinzufügen und Glasszintillationsflasche mit Parafilm versiegeln. Drehen Sie über Nacht bei Raumtemperatur.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Unmittelbar nach dem Autoklavieren Lösung a mischen sie in Lösung b und gießen Sie die Mischung in 10 x 35mm Perti-Gerichte. (macht 35 Traubenteller)</td>
			<td>3.3 Entfernen Sie Kunststoffband-Abfall, indem Sie den Kleber 15 Minuten lang in 2 15 ml konische Schläuche und Zentrifugieren bei 3000 U/min übertragen.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Lassen Sie Traubenteller über Nacht bei Raumtemperatur mit abschaltenden Tellerdeckeln einstellen. Platten mit Deckeln abdecken und nach dem Einstellen in 4C° lagern.</td>
			<td>3.4 Leim überlagern sie zur Lagerung in 1,5 ml Mikrozentrifugenrohre.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabelle 1: Medienrezepte und Lösungen.

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Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Hier wird ein Protokoll zur Mikroinjektion und gleichzeitigen Abbildung mehrerer Drosophila-Embryonen während der embryonalen Entwicklung mit einem plattenbasierten, hochinhaltigen Imager vorgestellt.

Drosophila Embryo Vorbereitung und Mikroinjektion für die Live-Zellmikroskopie mit einem automatisierten High Content Analyzer durchgeführt

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Dieses Protokoll ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Embryonen innerhalb einer Bildgebungssitzung. Während die Probenvorbereitung für die Mehrpunkterfassung mit einem Hochgehaltsanalysator angepasst ist, können Proben, die mit diesem Protokoll erstellt wurden, auf jedem invertierten Mikroskop abgebildet werden, das in der Lage ist, mehrere Punkte zu akzieren. Um zu beginnen, organisieren Sie zwei Reihen von 15 bis 20 Embryonen auf einem sauberen Abschnitt der großen Platte mit einem Eierpflücker-Werkzeug.Richten Sie die Embryonen auf ihrer ventralen Seite in der gleichen Ausrichtung in Bezug auf vordere und hintere Enden aus. Einen Abstandsabstand auf einen Deckelschlupf und Streifen 10 Mikroliter Heptan leimen den freiliegenden Deckelglaseinschub. Während der Kleber trocknet, verwenden Sie eine Rasierklinge, um ein Rechteck um die beiden Reihen von Embryonen zu schneiden.Schneiden Sie ein zweites Rechteck neben dem ersten und entfernen Sie das zweite Rechteck mit einer geraden Randseite eines Edelstahlspachtels. Schieben Sie vorsichtig die gerade Kante des Spachtels unter das erste Rechteck und entfernen Sie ihn. Dann legen Sie den Ausschnitt mit Embryonen auf der Außenseite einer 3,5-Zentimeter-Schale.Senken Sie unter einem Stereomikroskop einen vorbereiteten Deckel über die Embryonen und drücken Sie vorsichtig die beiden Embryonenreihen auf den Kleber. Wenn keine Mikroinjektion durchführen, füllen Sie den Silikon-Abstandsraum auf halbem Weg nach oben mit einem 1:1-Halocarbonöl 700 bis Halocarbonöl 27. Verfeinern Sie die unteren Ränder eines Vier-Schiebe-Plattenadapters mit doppelseitigem Klebeband.Dadurch wird verhindert, dass sich das Dia während der Bildgebung bewegt. Stellen Sie sicher, dass Sie das Band nicht in den Pfad der Objektivlinse legen. Montieren Sie den Deckelschlupf am Vier-Schiebe-Plattenadapter.Wenn die Embryonen mikroinjiziert werden, legen Sie den Deckelrutsch mit Embryonen über einen Schlitten, um zu verhindern, dass der Boden des Deckels während der Austrocknung und Mikroinjektion schmutzig wird. Die Embryonen fünf bis zehn Minuten lang verachten und dann sofort mit einem Halocarbonöl 700 bis Halocarbonöl 27 bedecken und den Silikonabstands auf halbem Weg nach oben füllen. Laden Sie zwei oder drei Mikroinjektionsnadeln mit etwa zwei Mikroliter Ninjectant mit einer verlängerten Ladespitze.Montieren Sie eine Nadel auf den Mikroinjektor und drücken Sie den Kolben auf halbem Weg zur Spitze, wodurch der Luftdruck innerhalb der Glaskapillare erhöht wird. Senken Sie die Glasnadel auf eine Glasrutsche und schneiden Sie die Spitze der Nadel mit einem neuen Rasiermesser mit der Nummer neun, wobei Sie in einem 45-Grad-Winkel schneiden, um eine scharfe offene Spitze zu erzeugen. Der Injektor sollte bis zum Boden der Spitze fließen, ohne aus der Nadel zu fließen.Fügen Sie vorsichtig 20 Mikroliter Halocarbonöl über die Spitze der Nadel und schneiden Sie es in einem 45-Grad-Winkel geöffnet. Der Injektor sollte schnell zu fließen beginnen, also denken Sie daran, den Druck durch Einziehen des Kolbens einzustellen. Verwenden Sie den Mikromanipulator, um die Nadel in der Mitte des Sichtfeldes zu positionieren.Heben Sie dann die Nadel an und entfernen Sie die Glasrutsche unter ihr. Stellen Sie die Embryonen auf die Stereomikroskop-Stufe unter die Mikroinjektionsnadel und konzentrieren Sie sich bei der 50-fachen Vergrößerung auf sie. Senken Sie die Nadel, bis sie in die gleiche Fokusebene wie die Embryonen kommt.Bewegen Sie die Folie mit einer Hand und bedienen Sie den Mikroinjektor mit der anderen, injizieren Sie eine Reihe von Embryonen. Heben Sie die Nadel an und drehen Sie den Schlitten um 180 Grad, um die zweite Reihe von Embryonen der Mikroinjektionsnadel auszusetzen. Senken Sie die Nadel und injizieren Sie die zweite Reihe von Embryonen.Dieses Protokoll wurde verwendet, um die Rolle von Mikrotubuli bei der endoplasmatischen Retikulumreorganisation während der Mitose im Drosophila-Embryo zu untersuchen. Die Auswirkungen mehrerer mikroinjizierter Arzneimittelbehandlungen auf die ER-Reorganisation wurden quantitativ verglichen. Colchicin, das eine neue Mikrotubulipolymerisation verhindert, wurde gefunden, um die Lokalisation des ER auf Spindelpole während der Mitose drastisch zu reduzieren.Für 32 Embryonen wurden Zeitraffer-Bildgebungsdaten erfasst. Mittelwert- und Max-Intensitätsmessungen wurden aus 12. 800 Interessensgebieten mit einem benutzerdefinierten MATLAB-Skript analysiert. Wenn Sie dieses Protokoll zum ersten Mal versuchen, denken Sie daran, nicht zu lange auf einen Schritt zu nehmen, sonst riskieren Sie, Ihre Entwicklungsphase zu verpassen, die Sie abbilden möchten.Üben Sie dieses Protokoll Schritt für Schritt, bevor Sie Experimente versuchen. Unsere Methode der Probenvorbereitung ermöglicht die gleichzeitige Erfassung mehrerer Embryonen während eines Experiments und erzeugt so genügend experimentelle Replikationen für die quantitative Analyse. Dieses Protokoll kann den Übergang der Entwicklungsembryologie von qualitativen zu quantitativen bildgebenden Experimenten erleichtern.Die Möglichkeit, mehrere Embryonen innerhalb einer Bildgebungssitzung abzubilden, eliminiert auch experimentelles Rauschen zwischen Replikationen.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

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Mittelmaßnahme Vorbereitung von<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoextrakte für Proteomversuche

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

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In-vitro- Ovulum Anbau für Live Cell Imaging der Zygote Polarisation und Embryo Musterung in Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

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Hochauflösende episkopische Mikroskopie (HREM) - Einfache und robuste Protokolle zur Verarbeitung und Visualisierung von organischen Materialien

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

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Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

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Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

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Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

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Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Vorbereitung von Drosophila Larval und Pupal Hoden für die Analyse der Zellteilung in Leben, intaktes Gewebe

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...