Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM ו-BR נתמכים על ידי המרכז לבנייה סלולרית, מרכז מדע וטכנולוגיה של הקרן הלאומית למדע (NSF), במסגרת הסכם מענק DBI-1548297. BR נתמכת גם באמצעות פרס NSF CAREER, 1553695.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

לסופרים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול המתואר כאן הוא רב-תכליתי מאוד וניתן להתאמה בקלות ללימוד אירועים ביולוגיים במגוון שלבים בהתפתחות העוברית של דרוסופילה. פרוטוקול זה מתאים היטב ללימוד תהליכים ביולוגיים המתרחשים על פני פרקי זמן ארוכים. לדוגמה, מחקרים שלהסלולר 29,30 או היווצרות של תחומים הטרוכרומטין ב Drosophila31,32 יכול להפיק תועלת מנוצל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה מאז תהליכים אלה מתרחשים על פני תקופה ממושכת של זמן. בנוסף, ניתן להגדיל את גודל המדגם על-ידי הקטנת ההגדלה כדי ללמוד שאלות הדורשות רזולוציה אופטית פחות, כגון התזמון ביןחטיבות סנכרון 33 או משך הזמן של gastrulation34.  כמו כן, יעד של פי 20 מאפשר תדמית של שני עוברים בתוך מטוס הדמיה אחד. השיטות בפרוטוקול זה מספקות פלטפורמה דינמית לשאול שאלות ביולוגיות באמצעות פיתוח עוברי כמערכת מודל לניתוח כמותי.
קיימים 3 שלבים קריטיים בפרוטוקול זה. לאחר ההתנקשות ב-50% אקונומיקה זה הכרחי שהעוברים יצונו ויתייבשו במרץ 5 פעמים (2.3.4). שלב זה מסיר את כל שאריות חתיכות קטנות של כוריון. שאריות כוריון יחסמו את שדה התצוגה בעת הדמיית העובר. בעת הרכבת העוברים על כיסוי הזכוכית (3.5), חשוב ללחוץ על העוברים על הדבק בלחץ אחיד. זה ילמקם את העוברים באותו מטוס Z. בעת חיתוך לפתוח את מחט microinjection, חשוב למשוך את הבוכנה באופן מיידי כדי להתאים את קצב הזרימה של המחט או תאבד את כל המזרק שלך.
המחקר שלנו הוגבל על ידי שני גורמים. הגורם הראשון לא היה תהליך פילוח אוטומטי. עם זאת, עיצבנו סקריפט פילוח ידני באמצעות MATLAB; עם סמן ציר מקודד גנטית תהליך זה יכול להיות אוטומטי. בעתיד ברצוננו לייצר CNN-RFP21, Rtln1-GFP ו- CNN-RFP; קווים טרנסגניים ReepB-GFP כדי לאפשר פילוח ציר אוטומטי. לקבלת מידע נוסף לגבי שלנו MATLAB סקריפט וניתוח צינור, עיין בחומרים משלימים של דיאז ואח'15. שנית, היינו מוגבלים גם על ידי מרווח הרכישה שלנו של 35 s, אשר אפשר לנו רק למצוא 6 עוברים בו זמנית. מרווח רכישה ארוך יותר יאפשר לנו למצוא יותר עוברים בו זמנית. למרות תפוקת משלוח תרופות יכול להיות להגדיל על ידי החלפת microinjection עם צעד חחלה, מצאנו את זה להיות מיותר מאז גודל המדגם שלנו כבר היה מוגבל על ידי מרווח רכישה.
בעוד פרוטוקול זה שימש כדי למצוא את ההתפתחות העוברית Drosophila, הגישה הכוללת ניתנת להתאמה ללימוד התפתחות עוברית במערכות מודל רב-תאיות אחרות, כגון C. elegans, קיפודי ים, ו Xenopus. עוברים שימושיים מאוד לניתוח כמותי שכן הם מסונכרנים בקלות באמצעות איסוף או הפריה. בנוסף, עוברים אינם זזים או שוחים הרחק תחום תצוגה, ומאפשרים שימוש בתוכנה פשוטה המסוגלת לרכישת נקודות מרובות כדי להפיק סרטוני וידאו מרובים לשגות זמן לניתוח כמותי. למרות שהשתמשנו במנתח תוכן גבוה במחקר שלנו, כל מערכת מיקרוסקופ הפוכה המסוגלת להשיג ריבוי נקודות יכולה להיות מזווגת לשיטות המוזכרות בזאת.
תוצאות דומות ניתן להשיג באמצעות רכישה מרובת נקודות מסוגל מיקרוסקופ confocal הפוך; עם זאת, היתרונות של מנתח תוכן גבוה מופיעים כאחד מגדיל את גודל המדגם כדי ללמוד שאלות הדורשות פחות רזולוציה בזמן. יתרון ברור לשימוש במנתח תוכן גבוה הוא היכולת ליצור תמונה של 4 שקופיות נפרדות בו-זמנית בהשוואה לשקופית אחת במערכות מסורתיות. עם קבוצה מלאה של 4 שקופיות ו-40 עוברים בכל שקופית, ניתן למצוא 160 עוברים על פני מספר שעות, כל עוד מרווח הרכישה הוא לפחות 15 דקות בין מסגרות. יתרון חשוב נוסף בשימוש במנתח תוכן גבוה הוא שהדגימות אטומות לחלוטין ממקורות אור חיצוניים, דבר הנחוץ למדידות מבוססות עוצמה פלואורססייטית. לבסוף, מנתח התוכן הגבוה המשמש במחקר שלנו יש מצלמת CMOS 5.5 מגה פיקסל המספק שדה תצוגה נדיב 221.87 μm בהגדלה 60x. שדה תצוגה גדול זה איפשר לנו למצוא חצי עובר לכל נקודת רכישה.

במהלך 30 השנים האחרונות, ההתקדמות בטכנולוגיות הדמיה ובדיקות מולקולריות להדמיית תאים חיים קידמה את הבנתנו את המורכבות והמנגנונים הפנימיים של התא. ליווי התקדמות זו בטכנולוגיה הוא הסתמכות רבה יותר על השימוש במודלים לשעבר של תרבות תאי vivo לרכישת נתוני הדמיית תפוקה גבוהה. מודלים של תרבות התא מספקים מספר יתרונות, כולל שליטה על המיקרו-סביבה באמצעות מערכות מיקרו-נוזלים, והיכולת למצוא תאים מרובים בו-זמנית, ומאפשרים שימוש בגישות כמותיות הנחוצות להקרנה בתפוקה גבוהה1,2. עם זאת, ישנם גם חסרונות משמעותיים הקשורים מודלים תרבות התא בהקשר של מחקרים מורפולוגיים, כגון משטחי זכוכית דו מימדית או פלסטיק לייצר השפעות מבלבלות על מורפולוגיה תא ותקנהשלה 3,4,5. השפעות אלה יכולות לספק נתונים כוזבים או מטעים לגבי המחקר של תהליכים ביולוגיים ויסות מורפולוגיה תאית.
למרות החלופה הייתה ללמוד מורפולוגיה תאית בהקשר של אורגניזםשלם 6, כמה אורגניזמים מתאימים שלמים להקל על תפוקה גבוהה כמותית דימות תאים חיים בשל קשיים בשמירה על אורגניזמים שלמים בחיים באמצעות הדמיה החוצה, ואתגרים הקשורים הדמיה בתוך אורגניזם רב תאי גדול. כתוצאה מכך, מחקרים ביולוגיים של תאים באורגניזמים שלמים התמקדו בדרך כלל בהתבוננות אורגניזם יחיד לאורך זמן, אשר מגביל מאוד את גודל המדגם. בנוסף, מגבלה זו של בעל חיים אחד בכל פעם מקשה על הדמיה חיה ויקרה לשימוש בצורה של מסך ומגבילה את היכולת להחיל כלים אנליטיים כמותיים מכיוון שמספר הדגימות קטן בדרך כלל. לכן, נובע הצורך אורגניזם מודל רב תאי שיכול לשמש עבור גישות כמותיות מבוססות תוכן גבוה.
פרוטוקול זה מתאים את העובר Drosophila עבור הדמיית תוכן גבוה מבוססצלחת כדי ליצור גדלים מדגם ניסיוני גדול מספיק לניתוח כמותי. מלנוגסטר Drosophila ידוע בכינויו אורגניזם המודל הראשון. מחקר באמצעות Drosophila הוביל לפריצות דרך בביולוגיה תא מולקולרית, כולל העברת מידע גנטי, זיהוי של מסלולי איתות תא, ודרישות גנטיות שלהתפתחות עוברית 7,8,9. בנוסף, העובר Drosophila שימש כדי לחקור בדינמיקה microtubule vivoבמהלך חטיבה סלולרית 10,11,12. השימוש microinjection כדי לספק מולקולות קטנות ובדיקות מולקולריות מספק שליטה זמנית שעושה פיתוח עוברי Drosophila חזק במיוחד עבור חיטויתהליכים תאייםvivo 13,14. עם זאת, יצירת מספר משמעותי של חזרות ניסיוניות עם גישת הדמיה מסורתית היא עתירת עבודה מאוד ויש לה שימוש מוגבל במסכי הדמיה בתפוקה גבוהה וניתוח כמותי. הגישה שלנו עושה שימוש במנתח תוכן גבוה השמור בדרך כלל לניתוח תא יחיד ומסתגל בניתוח הדמיה vivo בסנכרון של Drosophila embryo המוקדם.
פרוטוקול זה שימש לאיסוף, שלב, ועוברי Drosophila microinject כדי לחקור את המנגנונים הנעים שינויים מורפולוגיים ברטיקולום אנדופלסמי (ER) במהלך מיטוזה15. למרות שמחקרים רבים תיארו את האופי הדינמי של ה-ERבמהלך מחזור התא 16,17,18,19, היה קשה להשוות את ההשפעות של סתיות מרובות לאורך זמן על מורפולוגיה של ER. כדי לזהות את הרכיבים המניעים שינויים מורפולוגיה ER על פני חלוקת תאים, השיטות המפורטות בפרוטוקול זה שימשו כדי לבדוק את התפקיד של microtubules וגורמים ציטו-שלד אחרים על ארגון מחדש של חדר ER מיטוטי באמצעות החטיבה הסינכרונית קליפתית בעובר Drosophila מוקדם. יחד, הזמינות של הפרעות גנטיות בתוך קהילת Drosophila, היכולת microinject תרופות ובדיקות מולקולריות בזמנים מדויקים במהלך הפיתוח, ואת העלות הזולה של עבודה עם Drosophila עושה גישה זו מאוד נוחה להקרנה מבוססת תמונה בתפוקה גבוהה. השיטות המתוארות כאן ישימות ללימוד מגוון רחב של תהליכים תאיים והתפתחותיים ב-vivo באמצעות עובר Drosophila 20. באופן ספציפי, פרוטוקול זה מותאם היטב כדי ללמוד אירועים ביולוגיים המתרחשים על פני תקופה ממושכת ובתוך 100 מיקרון של קליפת המוח עובר Drosophila.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

גישות מודרניות בהדמיית תאים חיים כמותיים הפכו לכלי חיוני לחקר הביולוגיה של התאים, על ידי מתן אפשרות לשימוש בסטטיסטיקה ובמידול חישובי כדי לסווג ולהשוות תהליכים ביולוגיים. למרות שמערכות מודל תרבות התא נהדרות להדמיית תוכן גבוה, מחקרי תפוקה גבוהה של מורפולוגיה של תאים מצביעים על כך שתרביות vivo לשעבר מוגבלות בהצמדת המורכבות המורפולוגית שנמצאה בתאים בתוך אורגניזמים חיים. ככזה, יש צורך במערכת מודל תפוקה גבוהה מדרגית כדי תמונה תאים חיים בתוך אורגניזם שלם. מתואר כאן הוא פרוטוקול לשימוש מנתח תמונה תוכן גבוה כדי לרכוש בו זמנית קטעי וידאו מרובים זמן לשגות של התפתחות מלנוגסטר Drosophila עוברי במהלך שלב blastoderm syncytial. Blastoderm syncytial שימש באופן מסורתי נהדר במודל vivo עבור הדמיה אירועים ביולוגיים; עם זאת, השגת מספר משמעותי של משכפלים ניסיוניים עבור גישות כמותיות ותפוקה גבוהה היה עבודה אינטנסיבית ומו מוגבלת על ידי הדמיה של עובר יחיד לכל חוזר ניסיוני. מוצג כאן היא שיטה להתאים את גישות הדמיה ומיקרו-גישות כדי להתאים למערכת הדמיית תוכן גבוהה, או כל מיקרוסקופ הפוך המסוגל לרכישה אוטומטית של ריבוי נקודות. גישה זו מאפשרת רכישה בו-זמנית של 6-12 עוברים, בהתאם לגורמים רצויים לרכישה, בתוך מפגש הדמיה אחד.

הגישה המוצגת בפרוטוקול זה שימשה כדי לבחון את התפקיד של microtubules בארגון מחדש של רשתית אנדופלסמית (ER) במהלך מיטוזה בעובר Drosophila 15. במהלך המיטוזה, המבנה של חדר ההתכונה מציג ארגון מחדש דרמטי, עם זאת, הכוחות שנוהגים בשינויים אלה אינם מובנים כהלכה. לאחרונה, משפחה של חלבוני עיצוב חדר ER הוצגו כדי לקדם את היווצרות צינורER 25,26,27,28, אשר ידועים בקרבה שלהם עם microtubules28. כדי ללמוד את גליל microtubules על מורפולוגיה ER, השיטות שסופקו בפרוטוקול שימשו כדי ליצור נתונים כדי להשוות כמותית את ההשפעות של מספר טיפולים תרופתיים microinjected על ארגון מחדש של חדר השלום במהלך מיטוזה. קולכיצין, אשר מונע פולימר מיקרוטובול חדש, נמצאה כדי להפחית באופן דרסטי את ארגון מחדש של הER במהלך המיטוזה כפי שמצג איור 5 ואיור 6. יתר על כן, הגישה המתוארת כאן אפשרה את הייצור של נתוני הדמיה הקפות זמן עבור 32 עוברים. מדידות אינטנסיביות ממוצעות ומקסימום הופקו מ-12,800 תחומי עניין באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית, אשר גם יצר נתונים סטטיסטיים תיאוריים ולא נחותים החיוניים להשוואות בין טיפולים תרופתיים. בשל הזמינות של בדיקות מולקולריות ואת הקלות של microinjections, השיטות המתוארות כאן ניתנות להתאמה בקלות ללמוד מגוון רחב של תהליכים ביולוגיים באמצעות כימות עוצמת פלואורסצנטית.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> איור 5: תמונות מייצגות של העשרה של Rtnl1-GFP ו- ReepB-GFP במוטות ציר במהלך המיטוזה. (A) שדה תצוגה 60x של ReepB-GFP במהלך מיטוזה במחזור תא 10. הריבוע הכחול מייצג את שדה התצוגה המשמש עבור לוחות B-E. לוח א' מעובד עם מסנן בינארי של סף. מסנן זה לא הוחל על לוחות B-E מאחר שהוא אינו כולל נתונים מפיקסלים מתחת לסף שנקבע. (B, D) אני לא יודע אם אני יכול לעשות את זה. ReepB-GFP בשליטה, בקולכיצין. אני לאיודע מה לעשות. Rtnl1-GFP בשליטה, ובקולכיצין. נתון זה שונה מדיאז ואח'15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> איור 6: כמות של העשרה Rtnl1-GFP ו- ReepB-GFP במוטות ציר במהלך המיטוזה. 20 צירים ו 20 cytoplasm ROIs על פני 10 מסגרות נותחו עבור 32 עוברים בתנאים הבאים. (A) 10% זריקות בקרת DMSO עבור Rtnl1-GFP. עוברי בקרה הראו עלייה של פי 0.1 בהעשרה (p<0.001 עבור כל הדגימות ב- T210) בהשוואה לדגימות שאינן מוזרקות (p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). (ב)עוברי ReepB-GFP מוזרקים עם 10% DMSO לשמש כשליטה. עוברי בקרה הראו עלייה של פי 0.1 בהעשרה (p<0.001 עבור כל הדגימות ב-T210) בהשוואה לדגימות שאינןמוזרקות (איור 1E; p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). (ג)עוברי Rtnl1-GFP מוזרקים עם 5 μM קולכיצין. כאן מדדנו הפחתה בהעשרת Rtnl1-GFP לתרשים (p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210) בהשוואה לפקדים (A) (p < 0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). (ד)עוברי ReepB-GFP מוזרקים עם 5 μM קולכיצין. מדדנו הפחתה בהעשרת ReepB-GFP לתרשים (p<0.001 עבור כל הדגימות ב- T210) בהשוואה לפקדים (B) (p<0.001 עבור כל הדגימות ב- T210). נתון זה שונה מדיאז ואח'15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. הדבק שמרים21</td>
			<td>2. צלחות ענבים21</td>
			<td>3. דבק הפטן24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 מוסיפים 7 גרם שמרים יבשים פעילים ל-50 מ"ל חסום. מוסיפים 9 מיליליטר של מי DI ומערבבים אפילו לקונסטרנס עם מרית מתכת.</td>
			<td>2.1 להפוך את הפתרון: להוסיף 6 גרם של אגר 140 מ"ל של מים DI בקבוקון 250 מ"ל autoclave זה.</td>
			<td>3.1 מלא בקבוקון מבריק זכוכית עם 50 אינץ' של סרט הדבקה דו-צדדי.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 מוסיפים 7 גרם שמרים יבשים פעילים ל-50 מ"ל חסום. מוסיפים 9 מיליליטר של מי DI ומערבבים אפילו לקונסטרנס עם מרית מתכת.</td>
			<td>2.2 להפוך את הפתרון b: לערבב 0.1 גרם של מתיל פרבן ב 2 מ"ל של אתנול, ואז להוסיף פתרון זה 60 מ"ל של מיץ אשכוליות להתרכז.</td>
			<td>3.2 הוסף 20 מ"ל של הפטן וזכוכית חותם בקבוקון מבריק עם פרפילם. סובבו למשך הלילה בטמפרטורת החדר.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 מיד לאחר תמיסת אוטומציה a, מערבבים בתמיסה ב' ושופכים את התערובת ל-10 x 35 מ"מ. (עושה 35 צלחות ענבים)</td>
			<td>3.3 להסיר פסולת קלטת פלסטיק על ידי העברת דבק לתוך 2 15 מ"ל צינורות חסונים צנטריפוגות ב 3000 סל"ד במשך 15 דקות.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 אפשרו ללחליות ענבים להגדיר בטמפרטורת החדר למשך הלילה עם מכסי צלחת כבויים. מכסים צלחות עם מכסים ומאחסנים ב-4C° לאחר ההגדרה.</td>
			<td>3.4 העבר דבק supernatant לתוך 1.5 מ"ל צינורות microcentrifuge לאחסון.</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: מתכונים של מדיה ופתרונות.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

מוצג כאן פרוטוקול microinject ובו זמנית תמונה עוברי Drosophila מרובים במהלך התפתחות עוברית באמצעות צלחת מבוססת, דימוי תוכן גבוה.

הכנת עובר Drosophila ומיקרו-היתוך למיקרוסקופיה של תאים חיים שבוצעו באמצעות מנתח תוכן גבוה אוטומטי

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

פרוטוקול זה מאפשר רכישה בו זמנית של עוברים מרובים בתוך מפגש הדמיה אחד. בעוד הכנת מדגם מותאם לרכישה מרובת נקודות באמצעות מנתח תוכן גבוה, דגימות שהוכנו באמצעות פרוטוקול זה ניתן לדמיין על כל מיקרוסקופ הפוך מסוגל רכישה מרובת נקודות. כדי להתחיל, לארגן שתי שורות של 15 עד 20 עוברים על קטע נקי של צלחת גדולה באמצעות כלי בורר ביצים.ליישר את העוברים בצד הגחוני שלהם באותו אוריינטציה ביחס לקצוות לפנים ו האחוריים. לדבוק רווח על כיסוי פס 10 microliters של דבק heptane במורד inset זכוכית coverslip חשוף. בזמן שהדבק מתייבש, השתמש בסכין גילוח כדי לחתוך מלבן סביב שתי שורות העוברים.חותכים מלבן שני ליד הראשון ומסירים את המלבן השני עם צד קצה ישר של מרית נירוסטה. בזהירות להחליק את הקצה הישר של המרית מתחת המלבן הראשון ולהסיר אותו. לאחר מכן, מניחים את החיתוך עם עוברים בצד החיצוני של צלחת 3.5 ס"מ.תחת מיקרוסקופ סטריאו, מנמיכים כיסוי מוכן מעל העוברים ולחיצה עדין על שתי שורות העוברים על הדבק. אם לא מבצעים microinjection, למלא את spacer סיליקון באמצע הדרך לפסגה עם אחד לאחד שמן halocarbon 700 לשמן halocarbon 27. מרווים את הקצוות התחתונים של מתאם לוח ארבע שקופיות עם סרט דו-צדדי.פעולה זו תמנע מהשקופית לנוע במהלך ההדמיה. הקפד לא למקם את הקלטת בנתיב של העדשה האובייקטיבית. תן את המכסה במתאם לוח ארבע השקופיות.אם microinjecting העוברים, למקם את coverslip עם עוברים מעל שקופית כדי למנוע את החלק התחתון של coverslip מלהיות מלוכלך במהלך ייעוד microinjection. לתעב את העוברים במשך חמש עד 10 דקות, ואז מיד לכסות אותם עם אחד לאחד שמן halocarbon 700 לשמן halocarbon 27, מילוי ספייסר סיליקון באמצע הדרך לפסגה. לטעון שתיים או שלוש מחטי microinjection עם כשני microliters של מזרק באמצעות קצה טעינה מורחבת.הר מחט על microinjector ולדכא את הבוכנה באמצע הדרך לקצה, להגדיל את לחץ האוויר בתוך נימי הזכוכית. מנמיכים את מחט הזכוכית על מגלשת זכוכית וחותכים את קצה המחט עם סכין גילוח מספר תשע חדש, חותכים בזווית של 45 מעלות כדי לייצר קצה פתוח חד. המזרק צריך לזרום למטה לתחתית הקצה מבלי לזרום מתוך המחט.בזהירות להוסיף 20 microliters של שמן halocarbon מעל קצה המחט לחתוך אותו מחדש נפתח בזווית של 45 מעלות. ההזרקה צריכה להתחיל לזרום במהירות, אז זכור להתאים את הלחץ על ידי נסיגת הבוכנה. השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את המחט במרכז שדה המבט.ואז להרים את המחט ולהסיר את מגלשת הזכוכית מתחתיו. מניחים את העוברים על שלב מיקרוסקופ סטריאו, מתחת למחט microinjection ולהתמקד בהם בהגדלה 50 פעמים. מנמיך את המחט עד שהיא מגיעה לאותו מישור מיקוד כמו העוברים.הזזת השקופית ביד אחת והפעלת המיקרו-מזרק ביד השנייה, מזריקים שורה אחת של עוברים. הרם את המחט וסובב את השקופית 180 מעלות כדי לחשוף את השורה השנייה של העוברים למחט microinjection. מנמיך את המחט ומזריק את שורת העוברים השנייה.פרוטוקול זה שימש לבחינת תפקידם של microtubules בארגון מחדש של רשתית אנדופלזמית במהלך מיטוזה בעובר Drosophila. ההשפעות של מספר טיפולים תרופתיים microinjected על ארגון מחדש של ER הושוו כמותית. קולצ'יץ'ין, המונע פולימריזציה חדשה של מיקרוטובול, נמצאה כדי להפחית באופן דרסטי את לוקליזציה של ה- ER לעמודי ציר במהלך מיטוזה.נתוני הדמיית זמן לשגות נרכש עבור 32 עוברים. מדידות ממוצעות ועוצמה מרבית נותחו מ- 12, 800 אזורי עניין באמצעות סקריפט MATLAB מותאם אישית. בעת ניסיון פרוטוקול זה בפעם הראשונה, זכור שלא להימשך זמן רב מדי בשלב אחד, אחרת אתה מסתכן בהחמצת השלב ההתפתחותי שברצונך לצלם.תרגל פרוטוקול זה צעד אחר צעד לפני שתנסה לבצע ניסויים כלשהם. שיטת הכנת הדגימה שלנו מאפשרת רכישה בו זמנית של עוברים מרובים במהלך ניסוי אחד, ובכך מייצרת מספיק שכפולים ניסיוניים לניתוח כמותי. פרוטוקול זה יכול לסייע במעבר עוברי התפתחותי מניסויי הדמיה איכותיים וכמותיים.היכולת לדמיין עוברים מרובים בתוך מפגש הדמיה אחד מבטלת גם רעש ניסיוני בין שכפולים.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

העובר Microinjection ו Electroporation ב chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

הכנה בינונית של<em&gt; תסיסנית</em&gt; עוברי תמציות עבור ניסויים פרוטאומיים

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

במבחנה ביצית טיפוח עבור Live-תא הדמיה של הזיגוטה קיטוב והמתבנת העובר ב תודרנית לבנה

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

מיקרוסקופיה אפיסקופית ברזולוציה גבוהה (HREM) - פרוטוקולים פשוטים ורב-עוצמה לעיבוד והדמיה של חומרים אורגניים

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

תא חי הדמיה של הפרדה בין כרומוזום במהלך מיטוזה

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-מערכת מבוססת עבור-Vivo השרשת Cardiomyocytes עובריים בתוך העובר העופות

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

הדמיה חיה וניתוח של התכווצויות שרירים בתוך העובר דרוזופילה

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

מפשיר Culturing, Cryopreserving שורות תאים דרוזופילה

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

הכנת מדרוזופילה זחל ופופל אשכים לניתוח חטיבת תאים בשידור חי, רקמה שלמה

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...