Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

यूडी, डब्ल्यूएफएम और बीआर को अनुदान समझौते डीबीआई-1548297 के तहत एक राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन (एनएसएफ) विज्ञान और प्रौद्योगिकी केंद्र, सेलुलर निर्माण केंद्र द्वारा समर्थित किया जाता है। बीआर को एनएसएफ करियर अवार्ड, 1553695 के माध्यम से भी समर्थन दिया जाता है।

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लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

यहां वर्णित प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास में विभिन्न चरणों में जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अत्यधिक बहुमुखी और आसानी से अनुकूलनीय है। यह प्रोटोकॉल लंबे समय तक होने वाली जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूल है। उदाहरण के लिए, सेलुलराइजेशन29, 30या ड्रोसोफिला31 में हेट्रोक्रोमेटिन डोमेन केगठनके अध्ययन,32 इस प्रोटोकॉल में वर्णित तरीकों का उपयोग करने से लाभान्वित हो सकते हैं क्योंकि ये प्रक्रियाएं विस्तारित अवधि में होती हैं। इसके अलावा, नमूना आकार को उन प्रश्नों का अध्ययन करने के लिए आवर्धन को कम करके बढ़ाया जा सकता है जिन्हें कम ऑप्टिकल रिज़ॉल्यूशन की आवश्यकता होती है, जैसे कि सिंक्टियल डिवीजनों33 या गैस्ट्रुलेशन34की अवधि के बीच का समय।  इसी तरह, एक 20x उद्देश्य दो भ्रूण के लिए एक इमेजिंग विमान के भीतर छवि के लिए अनुमति देता है । इस प्रोटोकॉल में तरीके मात्रात्मक विश्लेषण के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में भ्रूणीय विकास का उपयोग कर जैविक प्रश्न पूछने के लिए एक गतिशील मंच प्रदान करते हैं।
इस प्रोटोकॉल में 3 महत्वपूर्ण कदम हैं। 50% ब्लीच में पोस्ट डिकेरेशन यह जरूरी है कि भ्रूण को 5 बार (2.3.4) से धोया और सूख जाए। यह कदम कोरियन के किसी भी बचे हुए छोटे टुकड़े को हटा देता है। जब भ्रूण इमेजिंग देखने के क्षेत्र में बाधा डालती है बचा हुआ chorion । जब कांच कवरलिप (३.५) पर भ्रूण बढ़ते, यह एक समान दबाव के साथ गोंद पर भ्रूण प्रेस करने के लिए महत्वपूर्ण है । इससे भ्रूण एक ही जेड प्लेन पर जगह देगा। माइक्रोइंजेक्शन सुई को खोलते समय, सुई के प्रवाह दर को समायोजित करने के लिए तुरंत प्लंजर को वापस लेना महत्वपूर्ण है या आप अपने सभी इंजेक्टेंट खो देंगे।
हमारा अध्ययन दो कारकों से सीमित था । पहले कारक एक स्वचालित विभाजन प्रक्रिया नहीं था । हमने मैटलैब का उपयोग करके एक मैनुअल सेगमेंटेशन स्क्रिप्ट तैयार की है, हालांकि; एक आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड स्पिंडल मार्कर के साथ इस प्रक्रिया को स्वचालित किया जा सकता है। भविष्य में हम सीएनएन-आरएफपी21,Rtln1-GFP और सीएनएन-RFP का उत्पादन करना चाहते हैं; स्वचालित धुरी विभाजन को सक्षम करने के लिए ReepB-GFP ट्रांसजेनिक लाइनें। हमारे MATLAB स्क्रिप्ट और विश्लेषण पाइपलाइन के बारे में अधिक जानकारी के लिए, Diaz एट अल15की पूरक सामग्री का उल्लेख है । दूसरे, हम भी ३५ एस है, जो केवल हमें एक साथ 6 भ्रूण छवि की अनुमति के हमारे अधिग्रहण अंतराल से सीमित थे । एक लंबा अधिग्रहण अंतराल हमें एक साथ अधिक भ्रूण छवि के लिए अनुमति होगी । हालांकि दवा वितरण थ्रूपुट को माइक्रोइंजेक्शन को पार करने के कदम के साथ बदलकर बढ़ाया जा सकता है, लेकिन हमने पाया कि यह अनावश्यक है क्योंकि हमारे नमूना आकार पहले से ही अधिग्रहण अंतराल तक सीमित था।
जबकि इस प्रोटोकॉल का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास की छवि के लिए किया गया था, समग्र दृष्टिकोण अन्य बहुकोशिकीय मॉडल प्रणालियों में भ्रूणीय विकास का अध्ययन करने के लिए अनुकूलनीय है, जैसे सी एलिगेंस,सी आशीन, और ज़ेनोपस। भ्रूण मात्रात्मक विश्लेषण के लिए बेहद उपयोगी होते हैं क्योंकि वे आसानी से संग्रह या निषेचन के माध्यम से सिंक्रोनाइज्ड होते हैं। इसके अलावा, भ्रूण देखने के क्षेत्र से दूर नहीं जाते हैं या तैरते हैं, जिससे मात्रात्मक विश्लेषण के लिए कई बार चूक वीडियो का उत्पादन करने के लिए एक सरल मल्टीपॉइंट अधिग्रहण सक्षम सॉफ्टवेयर का उपयोग सक्षम होता है। यद्यपि हमने अपने अध्ययन में एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग किया, मल्टीपॉइंट अधिग्रहण में सक्षम किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप प्रणाली को यहां उल्के तरीकों के साथ जोड़ा जा सकता है।
इसी तरह के परिणाम एक बहुबिंदु अधिग्रहण सक्षम उल्टे कंफोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके प्राप्त किया जा सकता है; हालांकि, एक उच्च सामग्री विश्लेषक के फायदे उभरने के रूप में एक नमूना आकार बढ़ जाती है सवाल है कि समय में कम संकल्प की आवश्यकता का अध्ययन करने के लिए । एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक स्पष्ट लाभ पारंपरिक प्रणालियों पर 1 स्लाइड की तुलना में एक साथ 4 अलग स्लाइड छवि की क्षमता है । प्रत्येक स्लाइड पर 4 स्लाइड और 40 भ्रूण का एक पूरा सेट के साथ, 160 भ्रूण कई घंटों में छवि की जा सकती है, जब तक अधिग्रहण अंतराल फ्रेम के बीच कम से कम 15 मिनट है। एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक और महत्वपूर्ण लाभ यह है कि नमूनों को किसी भी बाहरी प्रकाश स्रोतों से पूरी तरह से बंद कर दिया जाता है, जो फ्लोरेसेंस तीव्रता-आधारित माप के लिए आवश्यक है। अंत में, हमारे अध्ययन में उपयोग किए जाने वाले उच्च सामग्री विश्लेषक में 5.5 मेगापिक्सल सीएमओएस कैमरा है जो 60x आवर्धन पर उदार 221.87 माइक्रोन क्षेत्र प्रदान करता है। देखने के इस बड़े क्षेत्र ने हमें अधिग्रहण बिंदु के अनुसार आधा भ्रूण छवि के लिए सक्षम बनाया ।

पिछले 30 वर्षों में, इमेजिंग प्रौद्योगिकियों और लाइव सेल इमेजिंग के लिए आणविक जांच में प्रगति ने कोशिका की जटिलता और आंतरिक कामकाज की हमारी समझ को उन्नत किया है। प्रौद्योगिकी में इस प्रगति के साथ उच्च थ्रूपुट इमेजिंग डेटा के अधिग्रहण के लिए पूर्व वीवो सेल संस्कृति मॉडल के उपयोग पर अधिक निर्भरता है। सेल कल्चर मॉडल माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम के माध्यम से माइक्रोएनवायरमेंट का नियंत्रण और एक साथ कई कोशिकाओं को छवि देने की क्षमता सहित कई फायदे प्रदान करते हैं, जिससे उच्च थ्रूपुट स्क्रीनिंग1,2के लिए आवश्यक मात्रात्मक दृष्टिकोणों का उपयोग सक्षम होता है। हालांकि, रूपात्मक अध्ययनों के संदर्भ में सेल संस्कृति मॉडल से जुड़े महत्वपूर्ण नुकसान भी हैं, जैसे कि दो-आयामी ग्लास या प्लास्टिक की सतहें सेल आकृति विज्ञान और इसके विनियमन3,4,5पर भ्रामक प्रभाव पैदा करती हैं। ये प्रभाव सेलुलर आकृति विज्ञान को विनियमित करने वाली जैविक प्रक्रियाओं के अध्ययन के संबंध में झूठे या भ्रामक डेटा प्रदान कर सकते हैं।
यद्यपि विकल्प एक अक्षुण्ण जीव6के संदर्भ में सेलुलर आकृति विज्ञान का अध्ययन करने के लिए किया गया है, कुछ उपयुक्त अक्षुण्ण जीव पूरे जीवों को इमेजिंग के माध्यम से जीवित रखने में कठिनाइयों के कारण उच्च थ्रूपुट मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग की सुविधा प्रदान करते हैं, और एक बड़े बहुकोशिकीय जीव के अंदर इमेजिंग से जुड़ी चुनौतियां। नतीजतन, अक्षुण्ण जीवों में सेल जैविक अध्ययन ने आम तौर पर समय के साथ एक ही जीव को देखने पर ध्यान केंद्रित किया है, जो नमूना आकार को बहुत सीमित करता है। इसके अलावा, यह एक-पशु-एट-ए-टाइम सीमा लाइव इमेजिंग को स्क्रीन के रूप में नियोजित करने के लिए मुश्किल और महंगा बनाती है और मात्रात्मक विश्लेषणात्मक उपकरण लागू करने की क्षमता को प्रतिबंधित करती है क्योंकि नमूनों की संख्या आम तौर पर बहुत छोटी होती है। इस प्रकार, एक बहुकोशिकीय मॉडल जीव की आवश्यकता उत्पन्न होती है जिसका उपयोग उच्च सामग्री आधारित मात्रात्मक दृष्टिकोणों के लिए किया जा सकता है।
यह प्रोटोकॉल मात्रात्मक विश्लेषण के लिए काफी बड़े प्रयोगात्मक नमूना आकार उत्पन्न करने के लिए प्लेट-आधारित उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण को अनुकूलित करता है। ड्रोसोफिला मेलानोगैस्टर को आमतौर पर पहले मॉडल जीव के रूप में जाना जाता है। ड्रोसोफिला का उपयोग करके किए गए शोध से कोशिका और आणविक जीव विज्ञान में सफलताएं मिली हैं, जिनमें आनुवंशिक जानकारी का संचरण, कोशिका संकेत रास्ते की पहचान और भ्रूण विकास की आनुवंशिक आवश्यकताएं7,8, 9शामिल हैं। इसकेअलावा सेलुलर डिवीजन10, 11, 12के दौरान वीवो माइक्रोट्यूबुले डायनेमिक्स में एक्सप्लोर करने के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण का इस्तेमाल किया गया है । छोटे अणुओं और आणविक जांच को वितरित करने के लिए माइक्रोइंजेक्शन का उपयोग अस्थायी नियंत्रण प्रदान करता है जो ड्रोसोफिला भ्रूणीय विकास को विशेष रूप से वीवो13,14में सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच के लिए शक्तिशाली बनाता है । हालांकि, पारंपरिक इमेजिंग दृष्टिकोण के साथ प्रयोगात्मक दोहराता की एक महत्वपूर्ण संख्या पैदा करना बेहद श्रम गहन है और उच्च थ्रूपुट इमेजिंग स्क्रीन और मात्रात्मक विश्लेषण में सीमित उपयोग है। हमारा दृष्टिकोण एक उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करता है जो आमतौर पर एकल सेल विश्लेषण के लिए आरक्षित होता है और शुरुआती ड्रोसोफिला ईएमब्रेओ के सिंक्टियम में वीवो इमेजिंग विश्लेषण में अनुकूलित होता है।
इस प्रोटोकॉल का उपयोग माइटोसिस15के दौरान एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) में रूपात्मक परिवर्तनों को चलाने वाले तंत्रों का पता लगाने के लिए, मंच और माइक्रोजेक्ट ड्रोसोफिला भ्रूण एकत्र करने के लिए किया गया था। यद्यपि कई अध्ययनों ने कोशिकाचक्र16, 17,18,19केदौरानईआर की गतिशील प्रकृति को रेखांकित किया है, लेकिन ईआर आकृति विज्ञान पर समय भर में कई क्षोभ के प्रभावों की तुलना करना मुश्किल रहा है। कोशिका विभाजन में ईआर आकृति विज्ञान में परिवर्तन करने वाले घटकों की पहचान करने के लिए, इस प्रोटोकॉल में सूचीबद्ध तरीकों का उपयोग प्रारंभिक ड्रोसोफिला भ्रूण में कॉर्टिकल सिंक्टियल डिवीजन का उपयोग करके मिटोटिक ईआर पुनर्गठन पर माइक्रोट्यूबुल और अन्य साइटोस्केलेल कारकों की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। एक साथ लिया, ड्रोसोफिला समुदाय के भीतर आनुवंशिक क्षोभ की उपलब्धता, विकास के दौरान सटीक समय पर दवाओं और आणविक जांच को माइक्रोजेक्ट करने की क्षमता, और ड्रोसोफिला के साथ काम करने की सस्ती लागत इस दृष्टिकोण को उच्च थ्रूपुट छवि-आधारित स्क्रीनिंग के लिए अत्यधिक उत्तरदायी बनाती है। यहां वर्णित विधियां ड्रोसोफिला भ्रूण20का उपयोग करके वीवो में विभिन्न प्रकार की सेलुलर और विकासात्मक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए लागू हैं । विशेष रूप से, यह प्रोटोकॉल जैविक घटनाओं का अध्ययन करने के लिए अच्छी तरह से अनुकूलित है जो एक विस्तारित अवधि में और ड्रोसोफिला भ्रूण कॉर्टेक्स के 100 माइक्रोन के भीतर होते हैं।

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	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

मात्रात्मक लाइव सेल इमेजिंग में आधुनिक दृष्टिकोण जैविक प्रक्रियाओं को वर्गीकृत करने और तुलना करने के लिए सांख्यिकी और कम्प्यूटेशनल मॉडलिंग के उपयोग को सक्षम करके सेल जीव विज्ञान की खोज के लिए एक आवश्यक उपकरण बन गए हैं। यद्यपि सेल संस्कृति मॉडल सिस्टम उच्च सामग्री इमेजिंग के लिए महान हैं, सेल आकृति विज्ञान के उच्च थ्रूपुट अध्ययन बताते हैं कि पूर्व वीवो संस्कृतियां जीवित जीवों के भीतर कोशिकाओं में पाई जाने वाली रूपात्मक जटिलता को पुनः प्राप्त करने में सीमित हैं। इस प्रकार, एक अक्षुण्ण जीव के भीतर जीवित कोशिकाओं को छवि देने के लिए एक स्केलेबल उच्च थ्रूपुट मॉडल प्रणाली की आवश्यकता होती है। यहां वर्णित एक उच्च सामग्री छवि विश्लेषक का उपयोग करने के लिए एक साथ सिंकाइटियल ब्लास्टोडर्म चरण के दौरान भ्रूण ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर विकास के कई समय-चूक वीडियो प्राप्त करने के लिए एक प्रोटोकॉल है। सिंक्टियल ब्लास्टोडर्म ने पारंपरिक रूप से जैविक घटनाओं इमेजिंग के लिए वीवो मॉडल में एक महान के रूप में कार्य किया है; हालांकि, मात्रात्मक और उच्च थ्रूपुट दृष्टिकोणों के लिए प्रयोगात्मक प्रतिकृति की एक महत्वपूर्ण संख्या प्राप्त करना श्रम गहन और प्रयोगात्मक दोहराने के प्रति एक भ्रूण की इमेजिंग द्वारा सीमित किया गया है। यहां प्रस्तुत एक उच्च सामग्री इमेजिंग सिस्टम, या स्वचालित मल्टीपॉइंट अधिग्रहण में सक्षम किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप के अनुरूप इमेजिंग और माइक्रोइंजेक्शन दृष्टिकोण को अनुकूलित करने की एक विधि है। यह दृष्टिकोण एक ही इमेजिंग सत्र के भीतर वांछित अधिग्रहण कारकों के आधार पर 6-12 भ्रूण के एक साथ अधिग्रहण को सक्षम बनाता है।

इस प्रोटोकॉल में प्रस्तुत दृष्टिकोण का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण15में माइटोसिस के दौरान एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर) पुनर्गठन में माइक्रोट्यूबुल की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। माइटोसिस के दौरान, ईआर की संरचना एक नाटकीय पुनर्गठन प्रदर्शित करता है, हालांकि, इन परिवर्तनों को चलाने वाली ताकतों को खराब समझा जाता है। हाल ही में, ईआर आकार देने वाले प्रोटीन के एक परिवार को ईआर ट्यूबल 25 , 26,27,28केगठनको बढ़ावा देने के लिए दिखाया गया था, जो माइक्रोट्यूबुल्स28के साथ उनके करीब निकटता के लिए जानाजाताहै। ईआर आकृति विज्ञान पर माइक्रोट्यूबुल्स के रोल का अध्ययन करने के लिए, प्रोटोकॉल में प्रदान किए गए तरीकों का उपयोग माइटोसिस के दौरान ईआर पुनर्गठन पर कई माइक्रोइंजेक्टेड दवा उपचारों के प्रभावों की मात्रात्मक रूप से तुलना करने के लिए डेटा उत्पन्न करने के लिए किया गया था। कोल्चिसिन, जो नए माइक्रोट्यूबुले बहुलीकरण को रोकता है, को माइटोसिस के दौरान ईआर के पुनर्गठन को काफी कम करने के लिए पाया गया जैसा कि चित्र 5 और चित्रा 6में दिखाया गया है। इसके अलावा, यहां वर्णित दृष्टिकोण ३२ भ्रूण के लिए समय गोद इमेजिंग डेटा के उत्पादन में सक्षम । एक कस्टम मैटलैब स्क्रिप्ट का उपयोग करके ब्याज के 12,800 क्षेत्रों से औसत और अधिकतम तीव्रता माप का उत्पादन किया गया था, जिसने दवा उपचार के बीच तुलना करने के लिए वर्णनात्मक और अनुमानित आंकड़े भी उत्पन्न किए थे। आणविक जांच की उपलब्धता और माइक्रोइंजेक्शन की आसानी के कारण, यहां वर्णित तरीकों को फ्लोरेसेंस तीव्रता मात्राकरण के माध्यम से विभिन्न जैविक प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए आसानी से अनुकूलनीय हैं।
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> चित्रा 5: माइटोसिस के दौरान धुरी डंडे पर RTnl1-GFP और ReepB-GFP संवर्धन के प्रतिनिधि छवियां । (A)सेल चक्र 10 में माइटोसिस के दौरान रीप्ब-जीएफपी के दृश्य का 60x क्षेत्र। ब्लू स्क्वायर पैनल बी-ई के लिए उपयोग किए जाने वाले दृश्य के क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करता है। पैनल ए को थ्रेसहोल्ड बाइनरी फ़िल्टर के साथ संसाधित किया जाता है। यह फ़िल्टर पैनल बी-ई पर लागू नहीं किया गया था क्योंकि इसमें सेट सीमा से नीचे पिक्सल से डेटा शामिल नहीं है. (B,D) नियंत्रण में ReepB-GFP, और कोलचिसिन में। (C,E) नियंत्रण में RTnl1-GFP, और कोल्चिसिन में। इस आंकड़े को डियाज़ एट अल15से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> चित्र 6: माइटोसिस के दौरान धुरी ध्रुवों पर RTnl1-GFP और ReepB-GFP संवर्धन का परिमाण। निम्नलिखित स्थितियों में 32 भ्रूणों के लिए 10 फ्रेम में 20 स्पिंडल और 20 साइटोप्लाज्म आरओआई का विश्लेषण किया गया। (A)RTnl1-GFP के लिए 10% DMSO नियंत्रण इंजेक्शन । नियंत्रण भ्रूण गैर इंजेक्शन नमूनों (पी एंड एलटी; ०.००१ टी 210 में सभी नमूनों के लिए) की तुलना में संवर्धन में ०.१ गुना वृद्धि (पी एंड एलटी; ०.००१) दिखाया । (ख)ReepB-GFP भ्रूण नियंत्रण के रूप में सेवा करने के लिए 10% DMSO के साथ इंजेक्शन । नियंत्रण भ्रूण ने टी-210 में सभी नमूनों के लिए संवर्धन (पीएंड एलटी;0.001) में 0.1 गुना वृद्धि दिखाई, जबकि टी-210 में सभी नमूनों के लिए गैर-इंजेक्शननमूनों (चित्रा 1E;पी एंड एलटी; 0.001) की तुलना में। (ग)Rtnl1-GFP भ्रूण 5 μM Colchicine के साथ इंजेक्शन । यहां हमने टी210 में सभी नमूनों के लिए नियंत्रण (ए) (पी एंड एलटी; 0.001) की तुलना में टी210 में सभी नमूनों के लिए स्पिंडल (पी एंड एलटी; 0.001) के लिए RTnl1-GFP संवर्धन में कमी मापी। (घ)ReepB-GFP भ्रूण 5 μM Colchicine के साथ इंजेक्शन । हमने टी-210 में सभी नमूनों के लिए नियंत्रण (बी) (पीएंडटी;001) की तुलना में स्पिंडल (टी-210 में सभी नमूनों के लिए पीएंडटी;0.001) के लिए ReepB-GFP संवर्धन में कमी मापी। इस आंकड़े को डियाज़ एट अल15से संशोधित किया गया है । <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. खमीर पेस्ट21</td>
			<td>2. अंगूर प्लेटें21</td>
			<td>3. हेप्टेन गोंद24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 50 मिलीलीटर शंकु के लिए 7 ग्राम सक्रिय शुष्क खमीर जोड़ें। डीआई पानी के 9 मिलीलीटर जोड़ें और एक धातु स्पैटुला के साथ भी स्थिरता के लिए मिश्रण।</td>
			<td>2.1 समाधान एक बनाओ: 250 मिलीलीटर फ्लास्क में 140 मिलीलीटर डीआई पानी में 6 ग्राम एगर जोड़ें और इसे ऑटोक्लेव करें।</td>
			<td>3.1 50 इंच के दो तरफा टेप के साथ एक ग्लास प्रस्फुटन शीशी भरें।</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 50 मिलीलीटर शंकु के लिए 7 ग्राम सक्रिय शुष्क खमीर जोड़ें। डीआई पानी के 9 मिलीलीटर जोड़ें और एक धातु स्पैटुला के साथ भी स्थिरता के लिए मिश्रण।</td>
			<td>2.2 समाधान बी बनाएं: इथेनॉल के 2 मिलीलीटर में 0.1 ग्राम मिथाइल पैराबेन मिलाएं, फिर इस समाधान को 60 मिलीलीटर अंगूर का रस ध्यान से जोड़ें।</td>
			<td>3.2 पैराफिल्म के साथ 20 मिलीलीटर हेप्टेन और सील ग्लास प्रस्फुटन शीशी जोड़ें। कमरे के तापमान पर रात भर घुमाएं।</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 ऑटोक्लेविंग समाधान ए के तुरंत बाद, समाधान बी में मिलाएं और मिश्रण को 10 x 35 मिमी perti व्यंजनों में डालें। (35 अंगूर प्लेटें बनाता है)</td>
			<td>3.3 2 15 मिलीलीटर शंकु नलियों में गोंद स्थानांतरित करके प्लास्टिक टेप मलबे को हटा दें और 15 मिनट के लिए 3000 आरपीएम पर अपकेंद्रित्र करें।</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 अंगूर की प्लेटों को प्लेट ढक्कन के साथ रात भर कमरे के तापमान पर सेट करने की अनुमति दें। ढक्कन के साथ प्लेटों को कवर करें और सेट करने के बाद 4C ° में स्टोर करें।</td>
			<td>3.4 भंडारण के लिए गोंद सुपरनेट को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में स्थानांतरित करें।</td>
		</tr>
</tbody></table>तालिका 1: मीडिया और समाधान के व्यंजनों।

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Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

यहां प्रस्तुत एक प्लेट आधारित, उच्च सामग्री इमेजर का उपयोग करके भ्रूण के विकास के दौरान माइक्रोजेक्ट और साथ ही इमेज मल्टीपल ड्रोसोफिला भ्रूण के लिए एक प्रोटोकॉल है।

लाइव सेल माइक्रोस्कोपी के लिए ड्रोसोफिला भ्रूण तैयारी और माइक्रोइंजेक्शन एक स्वचालित उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करके किया जाता है

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

यह प्रोटोकॉल एक इमेजिंग सत्र के भीतर कई भ्रूणों के एक साथ अधिग्रहण को सक्षम बनाता है। जबकि नमूना तैयारी को उच्च सामग्री विश्लेषक का उपयोग करके बहु-बिंदु अधिग्रहण के लिए अनुकूलित किया जाता है, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके तैयार किए गए नमूनों को बहु-बिंदु अधिग्रहण में सक्षम किसी भी उल्टे माइक्रोस्कोप पर इमेज किया जा सकता है। शुरू करने के लिए, एक अंडा बीनने उपकरण का उपयोग कर महान थाली के एक साफ खंड पर 15 से 20 भ्रूण की दो पंक्तियों का आयोजन ।पूर्वकाल और पीछे के सिरों के संबंध में एक ही अभिविन्यास में उनके वेंट्रल साइड पर भ्रूण को संरेखित करें। उजागर कवरस्लिप ग्लास इनसेट नीचे हेप्टेन गोंद के एक कवरस्लिप और लकीर 10 माइक्रोलीटर पर एक स्पेसर का पालन करें। जबकि गोंद सूख जाता है, भ्रूण की दो पंक्तियों के चारों ओर एक आयत को काटने के लिए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें।पहले के बगल में एक दूसरा आयत काटें और दूसरा आयत को स्टेनलेस स्टील स्पैटुला के सीधे किनारे के साथ हटा दें। ध्यान से पहले आयत के नीचे स्पैटुला के सीधे किनारे स्लाइड करें और इसे हटा दें। फिर, 3.5 सेंटीमीटर डिश के बाहरी किनारे पर भ्रूण के साथ कटआउट रखें।एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत, भ्रूण पर एक तैयार कवरस्लिप कम और धीरे गोंद पर भ्रूण की दो पंक्तियों प्रेस । माइक्रोइंजेक्शन नहीं होने पर सिलिकॉन स्पेसर को एक-से-एक हेलोकार्बन ऑयल 700 से हेलोकार्बन ऑयल 27 के साथ टॉप पर आधे रास्ते भर दें। दो तरफा टेप के साथ एक चार स्लाइड प्लेट एडाप्टर के नीचे किनारों लाइन ।इससे इमेजिंग के दौरान स्लाइड को आगे बढ़ने से रोका जा सकेगा। सुनिश्चित करें कि टेप को ऑब्जेक्टिव लेंस के रास्ते में न रखें। चार स्लाइड प्लेट एडाप्टर पर कवरस्लिप माउंट।यदि भ्रूण को माइक्रोइंजेक्टिंग करते हैं, तो कवरस्लिप को एक स्लाइड पर भ्रूण के साथ रखें ताकि कवरस्लिप के नीचे को नीचे बनने से रोका जा सके। भ्रूण को पांच से 10 मिनट के लिए डेसिकेट करें, फिर तुरंत उन्हें एक-से-एक हेलोकार्बन तेल 700 से हेलोकार्बन तेल 27 तक कवर करें, सिलिकॉन स्पेसर को आधे रास्ते से शीर्ष पर भरें। एक विस्तारित लोडिंग टिप का उपयोग करके इंजेक्टेंट के लगभग दो माइक्रोलीटर के साथ दो या तीन माइक्रोइंजेक्शन सुई लोड करें।माइक्रोइंजेक्टर पर एक सुई माउंट और टिप करने के लिए आधे रास्ते प्लंजर दबाना, कांच केशिका के अंदर हवा के दबाव में वृद्धि । कांच की सुई को एक ग्लास स्लाइड पर कम करें और एक नए नंबर नौ रेजर के साथ सुई की नोक को काटें, एक तेज खुली नोक का उत्पादन करने के लिए 45 डिग्री कोण पर काटें। इंजेक्टेंट को सुई से बाहर बहने के बिना टिप के नीचे तक प्रवाहित करना चाहिए।ध्यान से सुई की नोक पर हेलोकार्बन तेल के 20 माइक्रोलीटर जोड़ें और इसे 45 डिग्री कोण पर फिर से काटें। इंजेक्टेंट को तेजी से प्रवाहित करना शुरू कर देना चाहिए, इसलिए प्लंजर को वापस लेकर दबाव को समायोजित करना याद रखें। देखने के क्षेत्र के केंद्र में सुई की स्थिति के लिए माइक्रोमैनीपुलेटर का उपयोग करें।इसके बाद सुई को उठाकर उसके नीचे से ग्लास स्लाइड निकाल लें। भ्रूण को माइक्रोइंजेक्शन सुई के नीचे स्टीरियो माइक्रोस्कोप स्टेज पर रखें और 50 गुना आवर्धन पर उन पर ध्यान केंद्रित करें। सुई कम जब तक यह भ्रूण के रूप में एक ही ध्यान विमान में आता है ।एक हाथ से स्लाइड चलती है और दूसरे के साथ माइक्रोइंजेक्टर का संचालन, भ्रूण की एक पंक्ति सुई । सुई उठाएं और स्लाइड 180 डिग्री घुमाएं भ्रूण की दूसरी पंक्ति को माइक्रोइंजेक्शन सुई में बेनकाब करें। सुई को कम करें और भ्रूण की दूसरी पंक्ति इंजेक्ट करें।इस प्रोटोकॉल का उपयोग ड्रोसोफिला भ्रूण में माइटोसिस के दौरान एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम पुनर्गठन में माइक्रोट्यूबुल्स की भूमिका की जांच करने के लिए किया गया था। ईआर पुनर्गठन पर कई माइक्रोइंजेक्टेड दवा उपचार के प्रभाव की मात्रात्मक रूप से तुलना की गई। कोल्चिसिन, जो नए माइक्रोटुबुल पॉलीमराइजेशन को रोकता है, को माइटोसिस के दौरान स्पिंडल डंडे के लिए ईआर के स्थानीयकरण को काफी कम करने के लिए पाया गया था।समय चूक इमेजिंग डेटा ३२ भ्रूण के लिए प्राप्त किया गया था । कस्टम मैटलैब स्क्रिप्ट का उपयोग करके ब्याज के 12, 800 क्षेत्रों से मतलब और अधिकतम तीव्रता माप का विश्लेषण किया गया था। पहली बार इस प्रोटोकॉल का प्रयास करते समय, याद रखें कि किसी भी एक कदम पर बहुत लंबा समय न लें, अन्यथा आप अपने विकास के चरण को याद करने का जोखिम उठाते हैं जिसे आप छवि बनाना चाहते हैं।किसी भी प्रयोग का प्रयास करने से पहले इस प्रोटोकॉल का कदम-दर-कदम अभ्यास करें। नमूना तैयारी की हमारी विधि एक प्रयोग के दौरान कई भ्रूणों के एक साथ अधिग्रहण की सुविधा देती है, इस प्रकार मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रयोगात्मक प्रतिकृति पैदा होती है। यह प्रोटोकॉल गुणात्मक से मात्रात्मक इमेजिंग प्रयोगों के लिए विकासात्मक भ्रूणविज्ञान संक्रमण में मदद कर सकता है।एक इमेजिंग सत्र के भीतर कई भ्रूण छवि की क्षमता भी प्रतिकृति के बीच प्रयोगात्मक शोर समाप्त ।

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

भ्रूण Microinjection और electroporation कोरडेट में<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

मध्यम स्तर की तैयारी<em&gt; ड्रोसोफिला</em&gt; प्रोट्योमिक प्रयोगों के लिए भ्रूण निष्कर्ष

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

इन विट्रो Arabidopsis थालियाना में युग्मनज ध्रुवीकरण और भ्रूण के नमूनों की लाइव-सेल इमेजिंग के लिए बीजांड खेती

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

उच्च संकल्प एपिस्कोपिक माइक्रोस्कोपी (एचआरईएम) - प्रसंस्करण और दृश्यमान कार्बनिक सामग्री के लिए सरल और मजबूत प्रोटोकॉल

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

बँटवारा के दौरान गुणसूत्र अलगाव की लाइव सेल इमेजिंग

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-आधारित प्रणाली के लिए Vivo में भ्रूण Cardiomyocytes के प्रत्यारोपण में एवियन भ्रूण

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

लाइव इमेजिंग और Drosophila भ्रूण में मांसपेशी संकुचन का विश्लेषण

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

गल, Culturing, और Cryopreserving Drosophila सेल लाइनों

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

समदैशिक प्रकाश-शीट माइक्रोस्कोपी और स्वचालित कोशिका वंश का विश्लेषण करने के लिए सूचीपत्र caभयावहता हैडिटिस एलिगेंस भ्रूणोद्भव subcellular संकल्प के साथ

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

लाइव, बरकरार ऊतक में सेल डिवीजन के विश्लेषण के लिए ड्रोसोफिला लार्वा और पुपल टेस्ट की तैयारी

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...