Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM e BR sono supportati dal Center for Cellular Construction, un Centro scientifico e tecnologico della National Science Foundation (NSF), in base alla licenza di sovvenzione DBI-1548297. BR è anche supportato attraverso un premio NSF CAREER, 1553695.

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	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è altamente versatile e facilmente adattabile per lo studio di eventi biologici in una varietà di fasi dello sviluppo embrionale di Drosophila. Questo protocollo è adatto per lo studio di processi biologici che si verificano per lunghi periodi di tempo. Ad esempio, gli studi sulla cellularizzazione29,30 o sulla formazione di domini di eterocromatina in Drosophila31,32 potrebbero trarre vantaggio dall'utilizzo dei metodi descritti in questo protocollo poiché questi processi si verificano per un lungo periodo di tempo. Inoltre, la dimensione del campione può essere aumentata diminuendo l'ingrandimento per studiare domande che richiedono meno risoluzione ottica, come la tempistica tra le divisioni sinciziali33 o la durata della gastrulazione34.  Allo stesso modo, un obiettivo 20x consente di immaginare due embrioni all'interno di un piano di imaging. I metodi di questo protocollo forniscono una piattaforma dinamica per porre domande biologiche utilizzando lo sviluppo embrionale come sistema modello per l'analisi quantitativa.
Ci sono 3 passaggi critici in questo protocollo. Dopo la dechorionation nella candeggina al 50% è imperativo che gli embrioni siano risciacquati e asciugati vigorosamente 5 volte (2.3.4). Questo passaggio rimuove tutti i piccoli pezzi rimanenti di chorion. Il chorion avanzi ostacolerà il campo visivo quando si imaging l'embrione. Quando si montano gli embrioni sul coperchio del vetro (3.5), è importante premere gli embrioni sulla colla con pressione uniforme. Questo posizionerà gli embrioni sullo stesso piano z. Quando si apre l'ago di microiniezione, è importante ritrarre immediatamente lo stantuffo per regolare la portata dell'ago o si perderà tutto l'iniettore.
Il nostro studio è stato limitato da due fattori. Il primo fattore non era avere un processo di segmentazione automatizzato. Tuttavia, abbiamo progettato uno script di segmentazione manuale utilizzando MATLAB; con un marcatore del mandrino geneticamente codificato questo processo potrebbe essere automatizzato. In futuro vorremmo produrre CNN-RFP21, Rtln1-GFP e CNN-RFP; Linee transgeniche ReepB-GFP per consentire la segmentazione automatica del mandrino. Per ulteriori informazioni sulla nostra pipeline di script e analisi MATLAB, fare riferimento ai materiali supplementari di Diaz etal. In secondo luogo, siamo stati limitati anche dal nostro intervallo di acquisizione di 35 s, che ci ha permesso di immagine di 6 embrioni solo contemporaneamente. Un intervallo di acquisizione più lungo ci permetterebbe di immagine di più embrioni contemporaneamente. Sebbene la produttività della somministrazione di farmaci possa essere incrementata sostituendo la microiniezione con una fase di permeazione, abbiamo riscontrato che ciò non era necessario poiché la nostra dimensione del campione era già limitata dall'intervallo di acquisizione.
Mentre questo protocollo è stato utilizzato per immaginare lo sviluppo embrionale di Drosophila, l'approccio generale è adattabile per studiare lo sviluppo embrionale in altri sistemi modello multicellulari, come C. elegans,Sea Urchins e Xenopus. Gli embrioni sono estremamente utili per l'analisi quantitativa poiché sono facilmente sincronizzati tramite raccolta o fecondazione. Inoltre, gli embrioni non si allontanano o nuotano lontano da un campo visivo, consentendo l'uso di un semplice software in grado di acquisizione multipunto per produrre più video time lapse per l'analisi quantitativa. Sebbene abbiamo utilizzato un analizzatore ad alto contenuto nel nostro studio, qualsiasi sistema di microscopio invertito in grado di acquisizione multipunto può essere abbinato ai metodi di cui al presente documento.
Risultati simili possono essere ottenuti utilizzando un microscopio confocale invertito in grado di acquisizione multipunto; tuttavia, i vantaggi di un analizzatore ad alto contenuto emergono man mano che si aumentano le dimensioni del campione per studiare domande che richiedono meno risoluzione nel tempo. Un ovvio vantaggio nell'utilizzo di un analizzatore ad alto contenuto è la possibilità di immagini di 4 diapositive separate contemporaneamente rispetto a 1 diapositiva su sistemi tradizionali. Con un set completo di 4 diapositive e 40 embrioni su ogni diapositiva, 160 embrioni possono essere imageati in diverse ore, purché l'intervallo di acquisizione sia di almeno 15 minuti tra i fotogrammi. Un altro importante vantaggio dell'utilizzo di un analizzatore ad alto contenuto è che i campioni sono completamente sigillati da qualsiasi fonte di luce esterna, necessaria per misurazioni basate sull'intensità della fluorescenza. Infine, l'analizzatore ad alto contenuto utilizzato nel nostro studio ha una fotocamera CMOS da 5,5 megapixel che fornisce un generoso campo visivo di 221,87 μm con ingrandimento 60x. Questo campo visivo più ampio ci ha permesso di immagine di mezzo embrione per punto di acquisizione.

Negli ultimi 30 anni, i progressi nelle tecnologie di imaging e nelle sonde molecolari per l'imaging di cellule vive hanno fatto progredire la nostra comprensione della complessità e del funzionamento interno della cellula. Ad accompagnare questo progresso tecnologico c'è una maggiore dipendenza dall'uso di modelli di coltura cellulare ex vivo per l'acquisizione di dati di imaging ad alta produttività. I modelli di coltura cellulare offrono diversi vantaggi, tra cui il controllo del microambiente attraverso sistemi microfluidici e la capacità di immagini simultanee di più cellule, consentendo l'uso di approcci quantitativi necessari per lo screening adalta produttività 1,2. Tuttavia, ci sono anche svantaggi significativi associati ai modelli di coltura cellulare nel contesto di studi morfologici, come superfici bidimensionali in vetro o plastica che producono effetti confondenti sulla morfologia cellulare e la suaregolazione 3,4,5. Questi effetti possono fornire dati falsi o fuorvianti per quanto riguarda lo studio dei processi biologici che regolano la morfologia cellulare.
Sebbene l'alternativa sia stata studiare la morfologia cellulare nel contesto di un organismo intatto6, pochi organismi intatti adatti facilitano l'imaging quantitativo di cellule vive ad alta produttività a causa delle difficoltà nel mantenere in vita interi organismi attraverso l'imaging e delle sfide associate all'imaging all'interno di un grande organismo multicellulare. Di conseguenza, gli studi biologici cellulari su organismi intatti si sono generalmente concentrati sull'osservazione di un singolo organismo nel tempo, il che limita notevolmente la dimensione del campione. Inoltre, questa limitazione di un animale alla volta rende l'imaging dal vivo difficile e costoso da impiegare sotto forma di schermo e limita la capacità di applicare strumenti analitici quantitativi poiché il numero di campioni è generalmente troppo piccolo. Pertanto, sorge la necessità di un organismo modello multicellulare che può essere utilizzato per approcci quantitativi basati su alto contenuto.
Questo protocollo adatta l'embrione Drosophila per l'imaging ad alto contenuto a base di lastre per generare campioni sperimentali abbastanza grandi da essere analisi quantitative. Drosophila melanogaster è comunemente noto come il primo organismo modello. La ricerca sulla Drosophila ha portato a progressi nella biologia cellulare e molecolare, tra cui la trasmissione di informazioni genetiche, l'identificazione delle vie di segnalazione cellulare e i requisiti genetici dello sviluppo embrionale7,8,9. Inoltre, l'embrione di Drosophila è stato utilizzato per esplorare la dinamica dei microtubuli in vivo durante la divisionecellulare 10,11,12. L'uso della microiniezione per fornire piccole molecole e sonde molecolari fornisce un controllo temporale che rende lo sviluppo embrionale di Drosophila particolarmente potente per sondare i processi cellulari in vivo13,14. Tuttavia, generare un numero significativo di ripetizioni sperimentali con un approccio di imaging tradizionale è estremamente laborioso e ha un uso limitato negli schermi di imaging ad alta produttività e nell'analisi quantitativa. Il nostro approccio si avvale di un analizzatore ad alto contenuto tipicamente riservato all'analisi a singola cella e adatta l'analisi di imaging in vivo nel sincrezio della prima Drosophila embryo.
Questo protocollo è stato utilizzato per raccogliere, stadio e microiniettare embrioni di Drosophila per esplorare i meccanismi che guidano i cambiamenti morfologici nel Reticolo Endoplasmatico (ER) durante la mitosi15. Sebbene molti studi abbiano delineato la natura dinamica del TI durante il ciclocellulare 16,17,18,19, è stato difficile confrontare gli effetti delle perturbazioni multiple nel tempo sulla morfologia ER. Per identificare i componenti che guidano i cambiamenti nella morfologia ER attraverso la divisione cellulare, i metodi elencati in questo protocollo sono stati utilizzati per sondare il ruolo dei microtubuli e di altri fattori citoscheletrici sulla riorganizzazione mitotica dell'ER usando la divisione sincrite corticale nel primo embrione di Drosophila. Nel complesso, la disponibilità di perturbazioni genetiche all'interno della comunità Drosophila, la capacità di microiniettare farmaci e sonde molecolari in momenti precisi durante lo sviluppo e il costo economico di lavorare con Drosophila rendono questo approccio altamente suscettibile allo screening basato su immagini ad alta produttività. I metodi qui descritti sono applicabili per lo studio di un'ampia varietà di processi cellulari e di sviluppo in vivo utilizzando l'embrione Drosophila 20. In particolare, questo protocollo è ben adattato per studiare gli eventi biologici che si verificano per un lungo periodo e entro 100 micron dalla corteccia embrionale drosophila.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

I moderni approcci nell'imaging quantitativo di cellule vive sono diventati uno strumento essenziale per esplorare la biologia cellulare, consentendo l'uso di statistiche e modelli computazionali per classificare e confrontare i processi biologici. Sebbene i sistemi modello di coltura cellulare siano ottimi per l'imaging ad alto contenuto, studi ad alta produttività della morfologia cellulare suggeriscono che le colture ex vivo sono limitate nel riassumere la complessità morfologica che si trova nelle cellule all'interno di organismi viventi. Come tale, è necessario un sistema scalabile di modelli ad alta produttività per immagini le cellule viventi all'interno di un organismo intatto. Descritto qui è un protocollo per l'utilizzo di un analizzatore di immagini ad alto contenuto per acquisire contemporaneamente più video time-lapse di sviluppo embrionale drosophila melanogaster durante lo stadio blastoderma sinciteale. Il blastoderma sincreziale è tradizionalmente servito come un grande modello in vivo per l'imaging di eventi biologici; tuttavia, ottenere un numero significativo di repliche sperimentali per approcci quantitativi e ad alta produttività è stato laborioso e limitato dall'imaging di un singolo embrione per ripetizione sperimentale. Presentato qui è un metodo per adattare gli approcci di imaging e microiniezione per adattarsi a un sistema di imaging ad alto contenuto o a qualsiasi microscopio invertito in grado di acquisizione multipunto automatizzata. Questo approccio consente l'acquisizione simultanea di 6-12 embrioni, a seconda dei fattori di acquisizione desiderati, all'interno di una singola sessione di imaging.

L'approccio presentato in questo protocollo è stato utilizzato per esaminare il ruolo dei microtubuli nella riorganizzazione del reticolo endoplasmatico (ER) durante la mitosi nell'embrione Drosophila 15. Durante la mitosi, la struttura del ER mostra una drammatica riorganizzazione, tuttavia, le forze che guidano questi cambiamenti sono poco comprese. Recentemente, una famiglia di proteine modellanti ER ha dimostrato di promuovere la formazione di ER tubule25,26,27,28, che sono noti per la loro vicinanza con i microtubuli28. Per studiare il rotolo di microtubuli sulla morfologia ER, i metodi previsti dal protocollo sono stati utilizzati per generare dati per confrontare quantitativamente gli effetti di diversi trattamenti farmacologici microiniettati sulla riorganizzazione dell'E.E. durante la mitosi. La colchicina, che impedisce la nuova polimerizzazione dei microtubuli, è stata trovata per ridurre drasticamente la riorganizzazione del ER durante la mitosi, come mostrato nella figura 5 e nella figura 6. Inoltre, l'approccio qui descritto ha permesso la produzione di dati di imaging time laps per 32 embrioni. Misurazioni di intensità media e massima sono state prodotte da 12.800 regioni di interesse utilizzando uno script MATLAB personalizzato, che ha anche generato statistiche descrittive e inferenziali vitali per effettuare confronti tra trattamenti farmacologici. A causa della disponibilità di sonde molecolari e della facilità delle microiniezioni, i metodi qui descritti sono facilmente adattabili per studiare una varietà di processi biologici attraverso la quantificazione dell'intensità della fluorescenza.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figura 5: Immagini rappresentative dell'arricchimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP ai poli del mandrino durante la mitosi. (A) campo visivo 60x di ReepB-GFP durante la mitosi nel ciclo cellulare 10. Il quadrato blu rappresenta il campo visivo utilizzato per i pannelli B-E. Il pannello A viene elaborato con un filtro binario di soglia. Questo filtro non è stato applicato ai pannelli B-E poiché esclude i dati dai pixel al di sotto della soglia impostata. (B,D) ReepB-GFP in controllo e in colchicina. (C,E) Rtnl1-GFP in controllo e in colchicina. Questa cifra è stata modificata da Diaz etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figura 6: Quantificazione dell'arricchimento rtnl1-GFP e ReepB-GFP ai poli del mandrino durante la mitosi. 20 mandrini e 20 ROM di citoplasma su 10 fotogrammi sono stati analizzati per 32 embrioni nelle seguenti condizioni. (A) Le iniezioni di controllo DMSO al 10% per rtnl1-GFP. (B) Embrioni ReepB-GFP iniettati con il 10% di DMSO per fungere da controllo. Gli embrioni di controllo hanno mostrato un aumento di 0,1 volte dell'arricchimento (p<0,001 per tutti i campioni a T210) rispetto ai campioni non iniettati(figura 1E; p < 0,001 per tutti i campioni a T210). (C) Embrioni di Rtnl1-GFP iniettati con 5 μM di colchicina. Qui abbiamo misurato una riduzione dell'arricchimento Rtnl1-GFP in mandrini (p < 0,001 per tutti i campioni a T210) rispetto ai controlli (A) (p < 0,001 per tutti i campioni a T210). (D) Embrioni reepB-GFP iniettati con colchicina da 5 μM. Abbiamo misurato una riduzione dell'arricchimento ReepB-GFP in mandrini (p<0,001 per tutti i campioni a T210) rispetto ai controlli (B) (p<0.001 per tutti i campioni a T210). Questa cifra è stata modificata da Diaz etal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Pasta dilievito 21</td>
			<td>2. Piattid'uva 21</td>
			<td>3. Colla epta24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Aggiungere 7 grammi di lievito secco attivo a un conico da 50 ml. Aggiungere 9 millilitri di acqua DI e mescolare anche alla costanza con una spatola metallica.</td>
			<td>2.1 Rendere la soluzione a: Aggiungere 6 grammi di agar a 140 ml di acqua DI in un pallone da 250 ml e autoclave.</td>
			<td>3.1 Riempire una fiala a scintillazione in vetro con 50 pollici di nastro a doppia parte.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 Aggiungere 7 grammi di lievito secco attivo a un conico da 50 ml. Aggiungere 9 millilitri di acqua DI e mescolare anche alla costanza con una spatola metallica.</td>
			<td>2.2 Rendere la soluzione b: Mescolare 0,1 grammi di parabeni metile in 2 ml di etanolo, quindi aggiungere questa soluzione a 60 ml di concentrato di succo di pompelmo.</td>
			<td>3.2 Aggiungere 20 ml di eptano e sigillare la flaconcino a scintillazione del vetro con parafilm. Ruotare durante la notte a temperatura ambiente.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Subito dopo la soluzione di autoclave a, mescolare nella soluzione b e versare la miscela in piatti perti da 10 x 35 mm. (produce 35 piatti d'uva)</td>
			<td>3.3 Rimuovere i detriti di nastro di plastica trasferendo la colla in 2 tubi conici da 15 ml e centrifugando a 3000 giri/min per 15 minuti.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 Lasciare che i piatti d'uva si mettano a temperatura ambiente durante la notte con i coperchi del piatto spenti. Coprire le piastre con coperchi e conservare in 4C° dopo il set.</td>
			<td>3.4 Trasferire il supernatante colla in tubi microcentrifuge da 1,5 ml per lo stoccaggio.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabella 1: Ricette di media e soluzioni.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Presentato qui è un protocollo per microiniettare e contemporaneamente immaginire più embrioni di Drosophila durante lo sviluppo embrionale utilizzando un imager a base di piastre e ad alto contenuto.

Preparazione e microiniezione dell'embrione Drosophila per microscopia a cellule vive eseguita utilizzando un analizzatore automatizzato ad alto contenuto

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Questo protocollo consente l'acquisizione simultanea di più embrioni all'interno di una sessione di imaging. Mentre la preparazione del campione è adattata per l'acquisizione multi-punto utilizzando un analizzatore ad alto contenuto, i campioni preparati utilizzando questo protocollo possono essere immagini su qualsiasi microscopio invertito in grado di acquisizione multi-punto. Per iniziare, organizza due file da 15 a 20 embrioni su una sezione pulita di grande piatto usando uno strumento di selezione delle uova.Allineare gli embrioni sul loro lato ventrale nello stesso orientamento rispetto alle estremità anteriore e posteriore. Aderire a un distanziale su un coverslip e striare 10 microlitri di colla eptano lungo l'inserto in vetro coverslip esposto. Mentre la colla si asciuga, usa una lama di rasoio per tagliare un rettangolo intorno alle due file di embrioni.Tagliare un secondo rettangolo accanto al primo e rimuovere il secondo rettangolo con un lato dritto di una spatola in acciaio inossidabile. Far scorrere con cura il bordo dritto della spatola sotto il primo rettangolo e rimuoverlo. Quindi, posizionare il ritaglio con embrioni sul lato esterno di un piatto di 3,5 centimetri.Al microscopio stereo, abbassare un coverslip preparato sugli embrioni e premere delicatamente le due file di embrioni sulla colla. Se non si esegue la microiniezione, riempire il distanziale in silicone a metà strada verso l'alto con olio di alocarbonio uno-a-uno da 700 a olio di alocarbonio 27. Allineare i bordi inferiori di un adattatore a piastra a quattro diapositive con nastro fronte-doppio.Ciò impedirà alla diapositiva di muoversi durante l'imaging. Assicurarsi di non posizionare il nastro nel percorso dell'obiettivo. Montare il coverslip sull'adattatore a quattro vetrini.Se si microiniettano gli embrioni, posizionare il coverslip con embrioni su uno scivolo per evitare che il fondo del coverslip si sporchi durante l'essiccazione e la microiniezione. Essiccare gli embrioni per cinque-10 minuti, quindi coprirli immediatamente con olio di alocarbonio uno-a-uno 700 all'olio di alocarbonio 27, riempiendo il distanziale in silicone a metà strada verso l'alto. Caricare due o tre aghi di microiniezione con circa due microlitri di iniettore utilizzando una punta di carico estesa.Montare un ago sul microiniettore e deprimere lo stantuffo a metà della punta, aumentando la pressione dell'aria all'interno del capillare di vetro. Abbassare l'ago di vetro su uno scivolo di vetro e tagliare la punta dell'ago con un nuovo rasoio numero nove, tagliando con un angolo di 45 gradi per produrre una punta aperta affilata. L'iniettore dovrebbe scorrere verso il basso della punta senza scorrere fuori dall'ago.Aggiungere con cura 20 microlitri di olio di alocarbonio sulla punta dell'ago e tagliarlo di nuovo aperto con un angolo di 45 gradi. L'iniettore dovrebbe iniziare a fluire rapidamente, quindi ricorda di regolare la pressione ritraendo lo stantuffo. Utilizzare il micromanipolatore per posizionare l'ago al centro del campo visivo.Quindi sollevare l'ago e rimuovere lo scivolo di vetro da sotto di esso. Posizionare gli embrioni sullo stadio del microscopio stereo, sotto l'ago di microiniezione e concentrarsi su di essi a 50 volte l'ingrandimento. Abbassare l'ago fino a quando non entra nello stesso piano di messa a fuoco degli embrioni.Spostando la diapositiva con una mano e operando il microiniettore con l'altra, iniettare una fila di embrioni. Sollevare l'ago e ruotare lo scivolo di 180 gradi per esporre la seconda fila di embrioni all'ago di microiniezione. Abbassare l'ago e iniettare la seconda fila di embrioni.Questo protocollo è stato utilizzato per esaminare il ruolo dei microtubuli nella riorganizzazione del reticolo endoplasmatico durante la mitosi nell'embrione Drosophila. Gli effetti di diversi trattamenti farmacologici microiniettati sulla riorganizzazione del ER sono stati confrontati quantitativamente. La colchicina, che impedisce la nuova polimerizzazione dei microtubuli, è stata trovata per ridurre drasticamente la localizzazione del ER ai poli del mandrino durante la mitosi.Sono stati acquisiti dati di imaging time lapse per 32 embrioni. Le misurazioni della media e dell'intensità massima sono state analizzate da 12.800 regioni di interesse utilizzando uno script MATLAB personalizzato. Quando si tenta questo protocollo per la prima volta, ricordarsi di non richiedere troppo tempo su un solo passaggio, altrimenti si rischia di perdere la fase di sviluppo che si desidera immagini.Esercitati passo dopo passo con questo protocollo prima di tentare qualsiasi esperimento. Il nostro metodo di preparazione del campione facilita l'acquisizione simultanea di più embrioni durante un esperimento, generando così abbastanza repliche sperimentali per l'analisi quantitativa. Questo protocollo può aiutare la transizione dell'embriologia dello sviluppo da esperimenti di imaging qualitativi a esperimenti di imaging quantitativo.La possibilità di immaginare più embrioni all'interno di una sessione di imaging elimina anche il rumore sperimentale tra le repliche.

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