Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD、WFM、BRは、国立科学財団(NSF)科学技術センターであるセルラー建設センターが、助成金契約DBI-1548297の下で支援しています。BRはNSFキャリア賞、1553695を通じてもサポートされています。

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著者らは開示するものは何もない。

ここで説明するプロトコルは、ショウジョウバエ胚発生の様々な段階で生物学的事象を研究するための非常に汎用性が高く、容易に適応可能である。このプロトコルは、長期間にわたって発生する生物学的プロセスの研究に適しています。例えば、ショルバライゼーション29、30、またはショウジョウバエ31,32におけるヘテロクロマチンドメインの形成の研究は、これらのプロセスが長期間にわたって起こるので、このプロトコルに記載されている方法を利用することから利益を得ることができる。また、倍率を下げることでサンプルサイズを大きくすることができ、同期分割33間のタイミングや胃の持続時間34などの光学解像度を必要としない質問を研究することができる。 同様に、20倍の目的は、1つのイメージング平面内で2つの胚を画像化することを可能にする。このプロトコルの方法は、定量分析のためのモデルシステムとして胚発生を用いて生物学的な質問をする動的なプラットフォームを提供する。
このプロトコルには、3 つの重要な手順があります。50%漂白剤の後のデコールリオネーションは、胚を洗浄し、精力的に5回乾燥することが不可欠である(2.3.4)。このステップは、残った小さな絨毛を取り除きます。残った絨毛は、胚を画像化する際に視野を妨げる。胚をガラスカバースリップ(3.5)に取り付ける場合、胚を均一な圧力で接着剤に押し込むのが重要です。これにより、胚は同じz平面に配置されます。マイクロインジェクション針を切り開くとき、針の流量を調整するためにプランジャーをすぐに引き込むか、すべての注射剤を失うことが重要です。
我々の研究は2つの要因によって制限された。最初の要因は、自動セグメンテーションプロセスを持たないことでした。しかし、MATLABを使用して手動セグメンテーションスクリプトを設計しました。遺伝的にコードされたスピンドルマーカーを使用すると、このプロセスを自動化することができます。将来的には、CNN-RFP 21、Rtln1-GFP、CNN-RFPを生産したいと考えています。ReepB-GFP トランスジェニック ラインにより、スピンドルセグメンテーションを自動化できます。MATLAB スクリプトと分析パイプラインの詳細については、Diaz らの補足資料を参照してください。第二に、我々はまた、同時に6個の胚を画像化することができた35秒の取得間隔によって制限されました。より長い取得間隔は、私たちが同時により多くの胚をイメージすることができます。マイクロインジェクションをパーメレーションステップに置き換えることで薬剤送達スループットを高めることができますが、サンプルサイズはすでに取得間隔によって制限されているため、これは不要であることがわかりました。
このプロトコルは ショウジョウバエ胚 発生をイメージするために使用されたが、全体的なアプローチは 、C.エレガンス、ウニ、 ゼノプスなどの他の多細胞モデルシステムにおける胚発生を研究するために適応可能である。胚は、採取や受精によって容易に同期されるため、定量分析に非常に有用です。さらに、胚は視野から離れたり泳いだりすることはおかしくないため、単純なマルチポイント取得対応ソフトウェアを使用して定量分析のために複数のタイムラプスビデオを作成できます。我々は研究において高含有分析装置を用いたが、マルチポイント獲得が可能なあらゆる逆顕微鏡システムは、本明細書で言及される方法と対にすることができる。
同様の結果は、反転共焦点顕微鏡を使用して得ることができるマルチポイント取得を使用して得ることができます。しかし、高コンテンツ分析装置の利点は、サンプルサイズが増加し、時間の解像度が低い質問を研究する際に生じる。高コンテンツアナライザを使用する利点は、従来のシステムで 1 スライドと比較して、4 つのスライドを同時にイメージする機能です。各スライドに4枚のスライドと40個の胚のフルセットを使用すると、取得間隔がフレーム間に少なくとも15分である限り、160個の胚を数時間にわたって画像化することができます。高含有分析装置を使用するもう1つの重要な利点は、サンプルが蛍光強度ベースの測定に必要な外部光源から完全に遮断されることです。最後に、我々の研究で使用される高コンテンツ分析器は、60倍の倍率で寛大な221.87 μm視野を提供する5.5メガピクセルのCMOSカメラを備えています。この大きな視野は、取得ポイントごとに胚の半分を画像化することを可能にしました。

過去30年間、生細胞イメージングのためのイメージング技術と分子プローブの進歩は、細胞の複雑さと内部の働きの理解を深めてきました。この技術の前進に伴うことは、高スループットイメージングデータを取得するためのex vivo細胞培養モデルの使用に大きく依存しています。細胞培養モデルは、マイクロ流体系を介した微小環境の制御、および複数の細胞を同時に画像化する能力を含むいくつかの利点を提供し、ハイスループットスクリーニング1,2に必要な定量的アプローチの使用を可能にする。しかし、2次元ガラスやプラスチック表面など、細胞形態学的研究の文脈において、細胞培養モデルに関連する重大な欠点もあり、細胞形態とその調節3、4、5に交容する効果を生み出す。これらの効果は、細胞形態を調節する生物学的プロセスの研究に関して、偽または誤解を招くデータを提供することができます。
別の方法は、無傷の生物6の文脈で細胞形態を研究することであったが、少数の適切な無傷の生物は、イメージングを通じて生物全体を生き続けるのが難しいため、高スループット定量的な生細胞イメージングを促進し、大きな多細胞生物の中でのイメージングに関連する課題を促進する。その結果、無傷の生物の細胞生物学的研究は、一般的に、サンプルサイズを大幅に制限する単一の生物を観察することに焦点を当てています。さらに、この一時の動物の制限は、ライブイメージングが困難で、画面の形で採用するのにコストがかかり、サンプルの数が一般的に少なすぎるため、定量分析ツールを適用する能力を制限します。したがって、高含有量的アプローチに使用できる多細胞モデル生物の必要性が生じる。
このプロトコルは、ショウジョウバエ胚をプレートベースの高含量イメージングに適応させ、定量分析に十分な大きさの実験サンプルサイズを生成します。ショウジョウバエメラノガスターは、一般に最初のモデル生物として知られています。ショウジョウバエを用いた研究は、遺伝情報の伝達、細胞シグナル伝達経路の同定、および胚発生7、8、9の遺伝的要件を含む細胞および分子生物学におけるブレークスルーを導いた。さらに、ショウジョウバエ胚は、細胞分裂10、11、12の間に生体内微小管ダイナミクスを探索するために使用されてきた。微小分子および分子プローブを送達するためのマイクロインジェクションの使用は、ショウジョウバエ胚発生を生体内13,14で細胞プロセスを探査する上で特に強力な時間制御を提供する。しかし、従来のイメージングアプローチでかなりの数の実験反復を生成することは非常に労力がかかり、高スループットのイメージング画面や定量分析での使用が制限されています。我々のアプローチは、一般的に単一細胞分析のために予約された高含有分析器を利用し、初期のショウジョウバエembryoのシンジチウムにおける生体内イメージング解析に適応する。
このプロトコルは、ショウジョウバエ胚を収集、ステージ、およびマイクロインジェクトして、有糸分裂15の間にエンドプラスミクスレチクルム(ER)の形態変化を駆動するメカニズムを探索するために使用された。多くの研究は、細胞周期16、17、18、19の間にERの動的性質を概説しているが、ER形態に対する時間の経過に及ぼす複数の摂動の影響を比較することは困難であった。細胞分裂全体にわたってER形態の変化を促進する成分を同定するために、このプロトコルに記載されている方法は、ショウジョウバエ初期胚における皮質合分分裂を用いた有糸性ER再編成における微小管および他の細胞骨格因子の役割を調査するために使用された。一緒に言えば、ショウジョウバエコミュニティ内の遺伝的摂動の可用性、開発中の正確な時期に薬物および分子プローブをマイクロ注入する能力、およびショウジョウバエとの作業の安価なコストは、このアプローチを高スループット画像ベースのスクリーニングに非常に受け入れやすい。ここで説明する方法は、ショウジョウバエ胚20を用いて生体内での多種多様な細胞および発達過程を研究するために適用可能である。具体的には、このプロトコルは、ショウジョウバエ胚皮質の100ミクロン以内に長期間にわたって発生する生物学的事象を研究するために十分に適応される。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

定量的な生細胞イメージングにおける最新のアプローチは、生物学的プロセスを分類して比較するために統計と計算モデリングを使用することによって、細胞生物学を探求するための不可欠なツールとなっています。細胞培養モデルシステムは高含有イメージングに最適ですが、細胞形態の高スループット研究は、生物内の細胞に見られる形態学的複雑さを再現する上で、ex vivo培養が限られていることを示唆しています。そのため、無傷の生物の中で生きている細胞をイメージするために、スケーラブルな高スループットモデルシステムが必要です。ここで説明する高コンテンツ画像分析装置を用いて、同期性芽胚期の胚性 ショウジョウバエメラノガスター 発生の複数のタイムラプスビデオを同時に取得するためのプロトコルを説明する。同期性ブラソデアルは、伝統的に生物学的事象をイメージングするための素晴らしいin vivoモデルとして機能してきました。しかし、定量的およびハイスループットアプローチのためのかなりの数の実験複製を得る作業は、実験反復ごとに単一の胚のイメージングによって、労力を要し、制限されている。ここで提示される高内容の画像化システム、または自動マルチポイント獲得が可能な任意の逆顕微鏡に合わせて画像化およびマイクロインジェクションアプローチを適応させる方法を提示する。このアプローチにより、単一のイメージングセッション内で、望ましい取得因子に応じて6~12個の胚を同時に取得できます。

このプロトコルで提示されるアプローチは、ショウジョウバエ胚15における有糸分裂の間に小管(ER)再編成における微小管の役割を調べるために用いた。有糸分裂の間、ERの構造は劇的な再編成を示すが、これらの変化を駆動する力は十分に理解されていない。最近、ER形成タンパク質のファミリーは、微小管28との近接性で知られているERチューブ25、26、27、28の形成を促進することが示された。ER形態に対する微小管のロールを研究するために、プロトコルで提供される方法を用いて、ミトーシス中のER再編成に及ぼすいくつかのマイクロインジェクション薬物治療の効果を定量的に比較するデータを生成した。新しい微小管重合を防止するコルヒチンは、図5および図6に示すように、有糸分裂時のERの再編成を大幅に減少させることがわかった。さらに、ここで説明するアプローチは、32個の胚のタイムラップイメージングデータの生成を可能にした。平均および最大強度の測定は、カスタムMATLABスクリプトを使用して12,800の関心領域から生成され、薬物治療間の比較を行う上で不可欠な記述的および没収的な統計も生成しました。分子プローブの入手可能性とマイクロインジェクションの容易さのために、ここで説明する方法は、蛍光強度定量を介して様々な生物学的プロセスを研究するために容易に適応可能である。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> 図5:有糸分裂中のスピンドル極におけるRtnl1-GFPおよびReepB-GFP濃縮の代表的な画像。(A)細胞周期10における有糸分裂時のReepB-GFPの視野の60倍の視野。青い四角形は、パネル B-E に使用される視野を表します。パネル A は、しきい値バイナリ フィルターを使用して処理されます。このフィルターは、設定されたしきい値より下のピクセルからデータを除外するため、パネル B-E には適用されませんでした。(B,D)コントロールで、コルヒチンでリープB-GFP。(C,E)制御中のRtnl1-GFP、およびコルヒチン中。この図は、Diazら15から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> 図6:有糸分裂中のスピンドル極におけるRtnl1-GFPおよびReepB-GFP濃縮の定量10フレームにわたって20本の紡錘と20個の細胞質ROIを、以下の条件で32個の胚について分析した。(A)Rtnl1-GFPのDMSO対照注射は、対照胚が非注入サンプル(T210のすべてのサンプルに対してp<0.001)と比較して濃縮(T210で全サンプルのp<0.001)の0.1倍の増加を示した(T210のすべてのサンプルに対して0.001)。(B) ReepB-GFP胚に10%DMSOを注入し、コントロールとして機能させる。対照胚は、非注入サンプルと比較して濃縮(T210のすべてのサンプルに対してp<0.001)の0.1倍の増加を示した(図1E;p<0.001 T210のすべてのサンプルに対して)。(C) 5 μMコルチチンを注入したRtnl1-GFP胚。ここでは、コントロール(A)(T210のすべてのサンプルに対してP<0.001)のスピンドルへのRtnl1-GFP濃縮の減少を測定しました(T210のすべてのサンプルに対してp<0.001)。(D) 5 μMコルヒチンを注入した ReepB-GFP 胚。ReepB-GFPのスピンドルへの濃縮(T210のすべてのサンプルのp<0.001)の減少を、コントロール(B)(T210のすべてのサンプルでp<0.001)と比較して測定しました。この図は、Diazら15から変更されています。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. イーストペースト21</td>
			<td>2. ぶどうプレート21</td>
			<td>3. ヘプタングルー24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 50 ml円錐形に7グラムの活性ドライイーストを加える。9ミリリットルのDI水を加え、金属ヘラでコンスタンシーまで混ぜます。</td>
			<td>2.1 ソリューションを作る:250mlフラスコでDI水の140mlに寒天の6グラムを追加し、それをオートクレーブ。</td>
			<td>3.1 ガラスシンチレーションバイアルに50インチの両面テープを入れます。</td>
		</tr>
<tr>
<td>1.1 50 ml円錐形に7グラムの活性ドライイーストを加える。9ミリリットルのDI水を加え、金属ヘラでコンスタンシーまで混ぜます。</td>
			<td>2.2 溶液bを作る:エタノールの2mlにメチルパラベンの0.1グラムを混ぜ、その後、グレープフルーツジュース濃縮物の60mlにこの溶液を追加します。</td>
			<td>3.2 20mlのヘプタンを加え、パラフィルムでガラスシンチレーションバイアルをシールします。室温で一晩回転させます。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 オートクレーブ処理液aの直後に、溶液bを混ぜ、10 x 35mmペルティ皿に混合物を注ぎます。(35個のブドウ皿を作る)</td>
			<td>3.3 15ml円錐形チューブに接着剤を移し、3000 RPMで遠心分離機を15分間取り除きます。</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 ブドウプレートをプレート蓋を外して一晩室温に設定できるようにします。蓋付きプレートを覆い、セット後4C°で保管します。</td>
			<td>3.4 接着剤の上清を1.5mlマイクロ遠心チューブに移して保管します。</td>
		</tr>
</tbody></table>表1:メディアとソリューションのレシピ

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Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

ここで提示されるプロトコルは、プレートベースの高含有画像を使用して胚発生時に複数 のショウジョウバエ 胚をマイクロインジェクトし、同時に画像化するプロトコルです。

ショウジョウバエ胚の調製と、自動高コンテンツアナライザを用いた生細胞顕微鏡のための微小注入

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

このプロトコルは、1つのイメージングセッション内で複数の胚を同時に取得することを可能にする。サンプル調製は高含有アナライザーを用いてマルチポイント取得に適合しているが、このプロトコルを用いて調製したサンプルは、マルチポイント取得が可能な任意の反転顕微鏡で画像化することができる。まず、卵ピッカーツールを使用して、素晴らしいプレートのきれいなセクションに15〜20個の胚の2列を整理します。前部および後端に対して同じ方向に彼らの腹側の胚を合わせる。スペーサーをカバースリップに付着させ、露出したカバースリップガラスのインセットにヘプタンを10マイクロリットル引き上げてください。接着剤が乾燥している間、カミソリの刃を使用して、2列の胚の周りに長方形をカットします。最初の長方形の横に 2 つ目の長方形を切り、ステンレススチールヘラの直線エッジ側で 2 番目の長方形を削除します。最初の長方形の下にヘラのまっすぐな端を慎重にスライドさせて取り除きます。次に、3.5センチメートル皿の外側に胚を入れた切り抜きを置きます。ステレオ顕微鏡の下で、調製したカバースリップを胚の上に下げ、2列の胚を接着剤に静かに押し込みます。マイクロインジェクションを行わない場合は、シリコーンスペーサーを上に途中で1対1のハロカーボンオイル700をハロカーボンオイル27で充填する。4 スライド プレート アダプタの下端に両面テープを並べます。これにより、イメージング中にスライドが移動するのを防ぐことができます。テープを対物レンズのパスに入れないようにしてください。カバースリップを4スライドプレートアダプターに取り付けます。胚をマイクロインジェクトする場合は、乾燥およびマイクロインジェクション中にカバースリップの底が汚れないように、スライドの上に胚を含むカバースリップを置きます。胚を5〜10分間乾燥させ、その後すぐに1対1のハロカーボンオイル700をハロカーボンオイル27で覆い、シリコーンスペーサーを上の途中で満たす。拡張ローディングチップを使用して、約2マイクロリットルの注射剤を使用して2つまたは3つのマイクロインジェクション針をロードします。マイクロインジェクターに針を取り付け、先端の途中でプランジャーを押し下げ、ガラス毛細血管内部の空気圧を上昇させます。ガラスの針をガラススライドに下げ、針の先端を新しい9番のカミソリで切り、45度の角度で切断して鋭い開いた先端を作ります。注射剤は、針から流れ出ることなく、先端の底まで流れ落ちるべきです.針の先端に20マイクロリットルのハロカーボンオイルを慎重に加え、45度の角度で開き直します。注射剤は急速に流れ始める必要がありますので、プランジャーを引き込み、圧力を調整することを忘れないでください。マイクロマニピュレータを使用して、針を視野の中心に配置します。その後、針を持ち上げ、その下からガラススライドを取り外します。マイクロインジェクション針の下に、ステレオ顕微鏡のステージに胚を置き、50倍の倍率でそれらに焦点を当てます。それは胚と同じ焦点面に入るまで針を下げます。片手でスライドを移動し、マイクロインジェクターをもう一方の手で操作し、一列の胚を注入する。針を上げてスライドを180度回転させ、胚の2列目をマイクロインジェクション針に露出させます。針を下げ、胚の2列目を注入する。このプロトコルは、ショウジョウバエ胚における有糸分裂の間に小管の小管の役割を調べるために使用された。ER再編成に対するいくつかのマイクロ注入薬物治療の効果を定量的に比較した。新しい微小管重合を防ぐコルヒチンは、有糸分裂時にスピンドル極へのERの局在を大幅に減少させることがわかった。32個の胚に対してタイムラプス画像データを取得した。平均および最大強度の測定値は、カスタム MATLAB スクリプトを使用して、関心のある 12,800 領域から分析されました。このプロトコルを初めて試す際は、1 つのステップで時間がかかりすぎないようにしてください。実験を行う前に、このプロトコルを段階的に実行してください。我々のサンプル調製方法は、1回の実験中に複数の胚を同時に取得することを容易にし、定量分析のための十分な実験複製を生成する。このプロトコルは、発達発生学が定性的なものから定量的な画像化実験に移行するのを助けることができる。1回のイメージングセッション内で複数の胚を画像化する機能は、複製間の実験的ノイズも排除します。

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

脊索動物における胚のマイクロインジェクションやエレクトロポレーション<em&gt;カタユウレイボヤ</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

中規模の<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;プロテオーム実験のための胚抽出物

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

体外受精卵の Live 細胞イメージング偏光とシロイヌナズナの胚パターン形成の胚珠培養

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

高分解能断層顕微鏡（HREM） - 有機材料の処理および可視化のための簡単で堅牢なプロトコル

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

細胞分裂時の染色体分配の生きているセルイメージ投射

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

鳥胚胚心筋細胞の生体内注入にマイクロインジェクション ベース システム

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

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ショウジョウバエ胚における筋収縮のライブイメージングと解析

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

解凍、養殖、ショウジョウバエ細胞をトウキョウ

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

生きた無傷組織における細胞分裂解析のためのショウジョウバエ・ラーバルとプパル精巣の調製

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...