Name: drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer
Uploaded: 2021-01-19T13:00:00
Duration: 5 min 52 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

UD, WFM og BR støttes av Center for Cellular Construction, et nasjonalt vitenskapsstiftelsessenter (NSF), under tilskuddsavtale DBI-1548297. BR støttes også gjennom en NSF CAREER-pris, 1553695.

<ol>
	<li>Zanella, F., Lorens, J., Link, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+content+screening:+seeing+is+believing.">High content screening: seeing is believing.</a> Trends in Biotechnology. 28 (5), 237-245 (2010).</li><li>Jennings, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila-a+versatile+model+in+biology+&amp;+medicine.">Drosophila-a versatile model in biology &amp; medicine.</a> Materials Today. 14 (5), 190-195 (2011).</li><li>Soares, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2D+and+3D-organized+cardiac+cells+shows+differences+in+cellular+morphology,+adhesion+junctions,+presence+of+myofibrils+and+protein+expression.">2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression.</a> PLoS One. 7 (5), 38147 (2010).</li><li>Bickle, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beautiful+cell:+high-content+screening+in+drug+discovery.">The beautiful cell: high-content screening in drug discovery.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 398 (1), 219-226 (2010).</li><li>Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microscopy+based+high+content+screening.">Microscopy based high content screening.</a> Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).</li><li>Mandal, A., Pinter, K., Drerup, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analyzing+Neuronal+Mitochondria+in-vivo+Using+Fluorescent+Reporters+in+Zebrafish.">Analyzing Neuronal Mitochondria in-vivo Using Fluorescent Reporters in Zebrafish.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 6 (144), 00144 (2018).</li><li>Bellen, H., Tong, C., Tsuda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=100+years+of+Drosophila+research+and+its+impact+on+vertebrate+neuroscience:+a+history+lesson+for+the+future.">100 years of Drosophila research and its impact on vertebrate neuroscience: a history lesson for the future.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11 (7), 514-522 (2010).</li><li>Letsou, A., Bohmann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+flies-big+discoveries:+nearly+a+century+of+Drosophila+genetics+and+development.">Small flies-big discoveries: nearly a century of Drosophila genetics and development.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 232 (3), 526-528 (2005).</li><li>Sullivan, W., Theurkauf, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cytoskeleton+and+morphogenesis+of+the+early+Drosophila+embryo.">The cytoskeleton and morphogenesis of the early Drosophila embryo.</a> Current Opinion in Cell Biology. 7 (1), 18-22 (1995).</li><li>Schejter, E., Wieschaus, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+elements+of+the+cytoskeleton+in+the+early+Drosophila+embryo.">Functional elements of the cytoskeleton in the early Drosophila embryo.</a> Annual Review of Cell Biology. 9 (1), 67-99 (1993).</li><li>Kellogg, D., Mitchison, T., Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Behavior+of+microtubules+and+actin+filaments+in+living+Drosophila+embryos.">Behavior of microtubules and actin filaments in living Drosophila embryos.</a> Development. 103 (4), 675-686 (1988).</li><li>Mavrakis, M., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+techniques+for+studying+Drosophila+embryo+development.">Fluorescence imaging techniques for studying Drosophila embryo development.</a> Current Protocols in Cell Biology. 39 (1), 4-18 (2008).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Koyama, C., Debec, A., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Diaz, U., Bergman, Z., Johnson, B., Edington, A., de Cruz, M., Marshall, W., Riggs, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubules+are+necessary+for+proper+Reticulon+localization+during+mitosis.">Microtubules are necessary for proper Reticulon localization during mitosis.</a> PLoS One. 14 (12), 0226327 (2019).</li><li>Shibata, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+reticulon+and+DP1/Yop1p+proteins+form+immobile+oligomers+in+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">The reticulon and DP1/Yop1p proteins form immobile oligomers in the tubular endoplasmic reticulum.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (27), 18892-18904 (2008).</li><li>Bergman, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatial+reorganization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis+relies+on+mitotic+kinase+cyclin+A+in+the+early+Drosophila+embryo.">Spatial reorganization of the endoplasmic reticulum during mitosis relies on mitotic kinase cyclin A in the early Drosophila embryo.</a> PloS One. 10 (2), 0117859 (2015).</li><li>Lu, L., Ladinsky, M., Kirchhausen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cisternal+organization+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">Cisternal organization of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 20 (15), 3471-3480 (2009).</li><li>Puhka, M., Vihinen, H., Joensuu, M., Jokitalo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endoplasmic+reticulum+remains+continuous+and+undergoes+sheet-to-tubule+transformation+during+cell+division+in+mammalian+cells.">Endoplasmic reticulum remains continuous and undergoes sheet-to-tubule transformation during cell division in mammalian cells.</a> The Journal of Cell Biology. 179 (5), 895-909 (2007).</li><li>Campos-Ortega, J., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (2013).</li><li>Sulivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Drosophila Protocols. , (2000).</li><li>Bainbridge, S., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster.">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> Development. 66, 57-80 (1981).</li><li>Bate, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitosis+and+Morphogenesis+in+the+Drosophila+Embryo.">Mitosis and Morphogenesis in the Drosophila Embryo.</a> The Development of Drosophila melanogaster. , (1993).</li><li>Uyen, T., Blake, R., Carol, K., Alain, D., William, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+study+of+centrosomes+in+Drosophila+during+embryogenesis.">Methods for the study of centrosomes in Drosophila during embryogenesis.</a> Methods in Cell Biology. 67, 113-123 (2001).</li><li>Voeltz, G., Prinz, W., Shibata, Y., Rist, J., Rapoport, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+class+of+membrane+proteins+shaping+the+tubular+endoplasmic+reticulum.">A class of membrane proteins shaping the tubular endoplasmic reticulum.</a> Cell. 124 (3), 573-586 (2006).</li><li>Zurek, N., Sparks, L., Voeltz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reticulon+short+hairpin+transmembrane+domains+are+used+to+shape+ER+tubules.">Reticulon short hairpin transmembrane domains are used to shape ER tubules.</a> Traffic. 12 (1), 28-41 (2011).</li><li>Kumar, D., Golchoubian, B., Belevich, I., Jokitalo, E., Schlaitz, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=REEP3+and+REEP4+determine+the+tubular+morphology+of+the+endoplasmic+reticulum+during+mitosis.">REEP3 and REEP4 determine the tubular morphology of the endoplasmic reticulum during mitosis.</a> Molecular Biology of the Cell. 30 (12), 1377-1389 (2019).</li><li>Park, S., Zhu, P., Parker, R., Blackstone, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hereditary+spastic+paraplegia+proteins+REEP1,+spastin,+and+atlastin-1+coordinate+microtubule+interactions+with+the+tubular+ER+network.">Hereditary spastic paraplegia proteins REEP1, spastin, and atlastin-1 coordinate microtubule interactions with the tubular ER network.</a> The Journal of Clinical Investigation. 120 (4), 1097-1110 (2010).</li><li>Loncar, D., Singer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+membrane+formation+during+the+cellularization+of+the+syncytial+blastoderm+of+Drosophila.">Cell membrane formation during the cellularization of the syncytial blastoderm of Drosophila.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 92 (6), 2199-2203 (1995).</li><li>Mazumdar, A., Mazumdar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+one+becomes+many:+Blastoderm+cellularization+in+melanogaster.">How one becomes many: Blastoderm cellularization in melanogaster.</a> Bioessay. 24, 1012-1022 (2002).</li><li>Yuan, K., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TALE-light+imaging+reveals+maternally+guided,+H3K9me2/3-independent+emergence+of+functional+heterochromatin+in+Drosophila+embryos.">TALE-light imaging reveals maternally guided, H3K9me2/3-independent emergence of functional heterochromatin in Drosophila embryos.</a> Genes &amp; Development. 30 (5), 579-593 (2016).</li><li>Walther, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatin+formation+in+Drosophila+requires+genome-wide+histone+deacetylation+in+cleavage+chromatin+before+mid-blastula+transition+in+early+embryogenesis.">Heterochromatin formation in Drosophila requires genome-wide histone deacetylation in cleavage chromatin before mid-blastula transition in early embryogenesis.</a> Chromosoma. 129 (1), 83-98 (2020).</li><li>McCleland, M., Shermoen, A., O'Farrell, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+replication+times+the+cell+cycle+and+contributes+to+the+mid-blastula+transition+in+Drosophila+embryos.">DNA replication times the cell cycle and contributes to the mid-blastula transition in Drosophila embryos.</a> Journal of Cell Biology. 187 (1), 7-14 (2009).</li><li>Tram, U., Riggs, B., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+and+Gastrulation+in+Drosophila+Embryos.">Cleavage and Gastrulation in Drosophila Embryos.</a> Encyclopedia of Life Sciences. , (2002).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Protokollen som er beskrevet her er svært allsidig og lett tilpasningsdyktig for å studere biologiske hendelser i en rekke stadier i Drosophila embryonal utvikling. Denne protokollen er godt egnet for å studere biologiske prosesser som oppstår over lange perioder. For eksempel kan studier avcellulærisering 29,30 eller dannelsen av heterochromatindomener i Drosophila31,32 ha nytte av å bruke metodene som er beskrevet i denne protokollen, siden disse prosessene oppstår over en lengre periode. I tillegg kan utvalgsstørrelsen økes ved å redusere forstørrelsen for å studere spørsmål som krever mindre optisk oppløsning, for eksempel tidspunktet mellom synkronedivisjoner 33 eller varigheten av gastrulation34.  På samme måte gjør et 20x mål at to embryoer kan avbildes i ett bildeplan. Metodene i denne protokollen gir en dynamisk plattform for å stille biologiske spørsmål ved hjelp av embryonal utvikling som modellsystem for kvantitativ analyse.
Det er tre kritiske trinn i denne protokollen. Etter dechorionation i 50% blekemiddel er det viktig at embryoer skylles og tørkes kraftig 5 ganger (2.3.4). Dette trinnet fjerner eventuelle rester små biter av chorion. Rester av chorion vil hindre synsfeltet når man avbilde embryoet. Når embryoene monteres på glassdeksleglasset (3,5), er det viktig å trykke embryoene på limet med jevnt trykk. Dette vil plassere embryoene på samme z-plan. Når du kutter opp mikroinjeksjonsnålen, er det viktig å trekke stempelet umiddelbart tilbake for å justere strømningshastigheten på nålen, ellers mister du alt injektor.
Vår studie var begrenset av to faktorer. Den første faktoren var ikke å ha en automatisert segmenteringsprosess. Vi designet imidlertid et manuelt segmenteringsskript ved hjelp av MATLAB; med en genetisk kodet spindelmarkør kan denne prosessen automatiseres. I fremtiden ønsker vi å produsere CNN-RFP21,Rtln1-GFP og CNN-RFP; ReepB-GFP transgene linjer for å muliggjøre automatisert spindelsegmentering. For mer informasjon om vår MATLAB script og analyse pipeline, se supplerende materialer av Diaz et al.15. For det andre var vi også begrenset av vårt oppkjøpsintervall på 35 s, som bare tillot oss å bilde 6 embryoer samtidig. Et lengre oppkjøpsintervall ville tillate oss å bilde flere embryoer samtidig. Selv om gjennomstrømningen av legemiddellevering kan øke ved å erstatte mikroinjeksjon med et gjennomdatatrinn, fant vi at dette var unødvendig siden vår prøvestørrelse allerede var begrenset av oppkjøpsintervall.
Mens denne protokollen ble brukt til å bilde Drosophila embryonic utvikling, den generelle tilnærmingen er tilpasningsdyktig for å studere embryonal utvikling i andre flercellede modellsystemer, som C. elegans,Kråkeboller, og Xenopus. Embryoer er svært nyttige for kvantitativ analyse siden de lett synkroniseres via innsamling eller befruktning. I tillegg beveger embryoer seg ikke eller svømmer bort fra et synsfelt, slik at bruk av en enkel flerpunktsanskaffelseskompatibel programvare for å produsere flere tidsforløpsvideoer for kvantitativ analyse. Selv om vi brukte en høyinnholdsanalysator i studien vår, kan ethvert omvendt mikroskopsystem som er i stand til flerpunktsoppkjøp, pares med metodene det refereres til her.
Lignende resultater kan oppnås ved hjelp av et flerpunktsoppkjøp som er i stand til omvendt konfokal mikroskop; Fordelene med en høyinnholdsanalysator dukker imidlertid opp når man øker utvalgsstørrelsen for å studere spørsmål som krever mindre oppløsning i tide. En åpenbar fordel med å bruke en høyinnholdsanalysator er muligheten til å bilde 4 separate lysbilder samtidig sammenlignet med 1 lysbilde på tradisjonelle systemer. Med et komplett sett med 4 lysbilder og 40 embryoer på hvert lysbilde, kan 160 embryoer avbildes over flere timer, så lenge oppkjøpsintervallet er minst 15 min mellom rammer. En annen viktig fordel med å bruke en høyinnholdsanalysator er at prøvene er helt forseglet fra eksterne lyskilder, noe som er nødvendig for fluorescensintensitetsbaserte målinger. Til slutt har høyinnholdsanalysatoren som brukes i studien vår et 5,5 megapikslers CMOS-kamera som gir et sjenerøst 221,87 μm synsfelt ved 60x forstørrelse. Dette større synsfeltet gjorde oss i stand til å bilde et halvt embryo per oppkjøpspunkt.

I løpet av de siste 30 årene har fremskritt innen bildeteknologi og molekylære sonder for levende celleavbildning avansert vår forståelse av cellens kompleksitet og indre arbeid. Medfølgende dette fremskrittet i teknologi er en større avhengighet av bruk av ex vivo cellekulturmodeller for innhenting av bildedata med høy gjennomstrømning. Cellekulturmodeller gir flere fordeler, inkludert kontroll av mikromiljøet gjennom mikrofluidiske systemer, og evnen til å bilde flere celler samtidig, slik at bruk av kvantitative tilnærminger som er nødvendige for screening med høy gjennomstrømning1,2. Det er imidlertid også betydelige ulemper forbundet med cellekulturmodeller i sammenheng med morfologiske studier, for eksempel todimensjonale glass- eller plastoverflater som produserer forvirrende effekter på cellemorfologi ogdens regulering 3,4,5. Disse effektene kan gi falske eller villedende data med hensyn til studiet av biologiske prosesser som regulerer cellulær morfologi.
Selv om alternativet har vært å studere cellulær morfologi i sammenheng med en intaktorganisme 6, forenkler få egnede intakte organismer høy gjennomstrømning kvantitativ levende celleavbildning på grunn av vanskeligheter med å holde hele organismer i live gjennom utavbildning, og utfordringer forbundet med avbildning inne i en stor flercellet organisme. Som et resultat har cellebiologiske studier i intakte organismer generelt fokusert på å observere en enkelt organisme over tid, noe som i stor grad begrenser prøvestørrelsen. I tillegg gjør denne engangsbegrensningen levende bildebehandling vanskelig og kostbart å ansette i form av en skjerm og begrenser muligheten til å bruke kvantitative analytiske verktøy siden antall prøver generelt er for lite. Dermed oppstår behovet for en flercellet modell organisme som kan brukes til høyinnholdsbaserte kvantitative tilnærminger.
Denne protokollen tilpasser Drosophila-embryoet for platebasert bildebehandling med høyt innhold for å generere eksperimentelle prøvestørrelser som er store nok til kvantitativ analyse. Drosophila melanogaster er kjent som den første modellen organisme. Forskning ved hjelp av Drosophila har ført til gjennombrudd i celle- og molekylærbiologi, inkludert overføring av genetisk informasjon, identifisering av cellesignalveier og genetiske krav til embryoniskutvikling 7,8,9. I tillegg har Drosophila embryoet blitt brukt til å utforske in vivo mikrotubule dynamikk under cellulærdivisjon 10,11,12. Bruken av mikroinjeksjon for å levere små molekyler og molekylære sonder gir timelig kontroll som gjør Drosophila embryonisk utvikling spesielt kraftig for sondering av cellulære prosesser in vivo13,14. Men å generere et betydelig antall eksperimentelle repetisjoner med en tradisjonell bildebehandling tilnærming er ekstremt arbeidskrevende og har begrenset bruk i høy gjennomstrømning bildeskjermer og kvantitativ analyse. Vår tilnærming gjør bruk av en høyinnholdsanalysator som vanligvis er reservert for enkeltcelleanalyse og tilpasser in vivo-bildeanalyse i syncytium av tidlig Drosophila embryo.
Denne protokollen ble brukt til å samle, iscenesette og mikroinjisere Drosophila embryoer for å utforske mekanismene som driver morfologiske endringer i endoplasmatisk retikuulum (ER) under mitosis15. Selv om mange studier har skissert den dynamiske naturen til ER under cellesyklusen16,17,18,19, har det vært vanskelig å sammenligne effekten av flere perturbasjoner over tid på ER morfologi. For å identifisere komponentene som driver endringer i ER morfologi på tvers av celledeling, ble metodene som er oppført i denne protokollen, brukt til å undersøke rollen som mikrotubuli og andre cytoskeletale faktorer på mititotisk ER-omorganisering ved hjelp av den kortikale synkrone delingen i det tidlige Drosophila-embryoet. Samlet sett, tilgjengeligheten av genetisk perturbasjon i Drosophila samfunnet, evnen til å mikroinjisere narkotika og molekylære sonder på nøyaktig tider under utviklingen, og den rimelige kostnaden ved å jobbe med Drosophila gjør denne tilnærmingen svært mottagelig for høy gjennomstrømning bildebasert screening. Metodene som er beskrevet her gjelder for å studere et bredt spekter av cellulære og utviklingsprosesser in vivo ved hjelp av Drosophila embryo20. Spesielt er denne protokollen godt tilpasset for å studere biologiske hendelser som oppstår over en lengre periode og innen 100 mikron av Drosophila embryo cortex.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:860px;" width="859">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">10 x 35mm Micro Dish</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td style="width:146px;">Cat #: 10799-192</td>
			<td style="width:206px;">N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">100% grape juice concentrate</td>
			<td style="width:314px;">Welch&#39;s, 100% Concentrate Grape Juice</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">250ml Erlenmeyer Flasks, Narrow Mouth</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 10536-914</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">3&#34; Non-Metallic Sieve No. 140</td>
			<td style="width:314px;">Gilson Company</td>
			<td>SV-165 #140</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">4 Slide Imaging Tray</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 400104</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">ACROS Organics , n-Heptane, 99+%, for spectroscopy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: AC411255000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Ethanol, 99.5%, ACS reagent, absolute, 200 proof</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat# : AC615095000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Acros Organics, Methyl 4-hydroxybenzoate, 99% . (methyl paraben )</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat#: AC126961000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Cover Slip, Rectangular, 25 x 75mm, #1 Float Glass</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-143-782</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Culture Well Silicone Sheet Material - 1.6mm thick</td>
			<td style="width:314px;">Grace Biolabs</td>
			<td>SKU: 664273</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">DWK Life Sciences Wheaton 20mL PET Liquid Scintillation Vials</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 03-341-71A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Embryo Collection Cage-Mini</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-105</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Eppendorf Microloader Pipette Tips</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Product Code: 10289651</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 15mL Conical Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 05-527-90</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Falcon 50mL Conical Centrifuge Tubes</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 14-432-22</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Fleischmann&#39;s, Active Dry Yeast</td>
			<td style="width:314px;">Fleischmann&#39;s</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Purchase at Grocery Store</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Grape Plates</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 27 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-133</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Halocarbon 700 Oil</td>
			<td style="width:314px;">Genesee Scientific</td>
			<td>Cat #: 59-131</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Heptane Glue</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Industrial Razor Blades (Surgical Carbon Steel) Single Edged No. 9</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 55411-050</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Parafilm M Laboratory Sealing Film, 4 inch x 250 foot Roll</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 50-998-944</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="100">
			<td height="100" style="height:100px;width:194px;">Scotch Double Sided Tape with Dispenser, Narrow Width, Engineered for Bonding, 1/2&#34; x 7 yds., 3/Pack Caddy</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: NC0879005</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Silica gel beads, desiccant ~ 2 - 5 mm</td>
			<td style="width:314px;">Millipore Sigma</td>
			<td>SKU: 1077351000</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Stainless Steel Spoon/Spatula</td>
			<td style="width:314px;">VWR</td>
			<td>Cat #: 470149-044</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">W.A. Hammond Drierite Indicating Absorbents</td>
			<td style="width:314px;">Fisher Scientific</td>
			<td>Cat #: 23-116582</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:194px;">Yeast Paste</td>
			<td style="width:314px;">REFFER TO RECIPE PREP</td>
			<td>N/A</td>
			<td>N/A</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:194px;">EQUIPMENT</td>
			<td style="width:314px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:194px;">Allegra X-12 Benchtop, Centrifuge</td>
			<td style="width:314px;">Beckman Coulter</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">You will need access to 15 ml conical centrifuge inserts.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:194px;">Autoclave</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Any autoclave will do fine.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">Drummond Nanoject II Microinjector.</td>
			<td style="width:314px;">Drummond Scientific</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">This is a mineral oil based injection system.</td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;width:194px;">GE Healthcare IN Cell Analyzer 6000.</td>
			<td style="width:314px;">GE healthcare</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">A fast confocal microscope capable of multipoint acquisition may be substituted.</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:194px;">Refrigerator (4C&#176;)</td>
			<td style="width:314px;">N/A</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">Fly media and yeast paste must be stored at (4C&#176;).</td>
		</tr>
		<tr height="106">
			<td height="106" style="height:106px;width:194px;">Zies Stemi 508 Stereo Microscope with Transillumination base 300 and overhead gooseneck lighting.</td>
			<td style="width:314px;">Zeiss Microscopy</td>
			<td>N/A</td>
			<td style="width:206px;">The transillumination base and gooseneck lighting are necessary.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

drosophila embryo preparation and microinjection for live cell microscopy performed using an automated high content analyzer

Moderne tilnærminger i kvantitativ levende celleavbildning har blitt et viktig verktøy for å utforske cellebiologi, ved å muliggjøre bruk av statistikk og beregningsmodellering for å klassifisere og sammenligne biologiske prosesser. Selv om cellekulturmodellsystemer er gode for høyinnholdsavbildning, tyder studier av cellemorfologi på at ex vivo-kulturer er begrenset til å rekafulere den morfologiske kompleksiteten som finnes i celler i levende organismer. Som sådan er det behov for et skalerbart høyt gjennomstrømningsmodellsystem for å bilde levende celler i en intakt organisme. Beskrevet her er en protokoll for bruk av en høyinnholdsbildeanalysator for samtidig å skaffe flere time-lapse videoer av embryonale Drosophila melanogaster utvikling under syncytial blastoderm scenen. Den syncytial blastoderm har tradisjonelt fungert som en stor in vivo modell for avbildning biologiske hendelser; Men å skaffe et betydelig antall eksperimentelle repliker for kvantitative og høy gjennomstrømming tilnærminger har vært arbeidsintensiv og begrenset av avbildning av et enkelt embryo per eksperimentell gjentakelse. Presentert her er en metode for å tilpasse bildebehandling og mikroinjeksjon tilnærminger for å passe et høyt innhold bildebehandlingssystem, eller et invertert mikroskop i stand til automatisert multipoint oppkjøp. Denne tilnærmingen muliggjør samtidig oppkjøp av 6-12 embryoer, avhengig av ønskede oppkjøpsfaktorer, innen en enkelt bildebehandlingsøkt.

Tilnærmingen som presenteres i denne protokollen ble brukt til å undersøke rollen som mikrotubuli i endoplasmaisk reticulum (ER) omorganisering under mitose i Drosophila embryo15. Under mitose viser strukturen til ER en dramatisk omorganisering, men kreftene som driver disse endringene, er dårlig forstått. Nylig ble en familie av ER-forming proteiner vist å fremme dannelsen av ER tubule25,26,27,28, som er kjent for sin nærhet med mikrotubuli28. For å studere rull med mikrotubuli på ER morfologi, ble metodene i protokollen brukt til å generere data for å kvantitativt sammenligne effekten av flere mikroinjiserte medikamentbehandlinger på ER-omorganisering under mitose. Kolkisin, som forhindrer ny mikrotubulimerisering, ble funnet å drastisk redusere omorganiseringen av ER under mitose som vist i figur 5 og figur 6. Videre, tilnærmingen beskrevet her aktivert produksjon av tidsavløp bildedata for 32 embryoer. Målinger av gjennomsnitt og maks intensitet ble produsert fra 12 800 interesseregioner ved hjelp av et tilpasset MATLAB-skript, som også genererte beskrivende og inferential statistikk som var avgjørende for sammenligninger mellom narkotikabehandlinger. På grunn av tilgjengeligheten av molekylære sonder og enkel mikroinjeksjoner, er metodene som er beskrevet her lett tilpasningsdyktige for å studere en rekke biologiske prosesser via fluorescensintensitetskvantifisering.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig5.jpg"> Figur 5: Representative bilder av Rtnl1-GFP og ReepB-GFP berikelse på spindelpolene under mitose. (A) 60x synsfelt av ReepB-GFP under mitose i cellesyklus 10. Den blå firkanten representerer synsfeltet som brukes til paneler B-E. Panel A behandles med et terskelbinært filter. Dette filteret ble ikke brukt på panel B-E siden det utelater data fra piksler under den angitte terskelen. (B, D) ReepB-GFP i kontroll, og i kolkisin. (C, E) Rtnl1-GFP i kontroll, og i kolkisin. Dette tallet er endret fra Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61589/61589fig6.jpg"> Figur 6: Kvantisering av Rtnl1-GFP og ReepB-GFP-berikelse på spindelpolene under mitose. 20 spindler og 20 cytoplasma-ROIer over 10 rammer ble analysert for 32 embryoer under følgende forhold. (A) 10% DMSO kontrollinjeksjoner for Rtnl1-GFP. Kontrollembryoer viste en 0,1 ganger økning i berikelse (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med ikke-injiserte prøver (p < 0,001 for alle prøver ved T210). (B)ReepB-GFP embryoer injisert med 10% DMSO for å tjene som kontroll. Kontrollembryoer viste en 0,1 ganger økning i berikelse (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med ikke-injiserte prøver (figur 1E; p < 0,001 for alle prøver ved T210). (C) Rtnl1-GFP embryoer injisert med 5 μM kolkisin. Her målte vi en reduksjon i Rtnl1-GFP-berikelse til spindler (p < 0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med kontroller (A) (p < 0,001 for alle prøver ved T210). (D)ReepB-GFP embryoer injisert med 5 μM kolkisin. Vi målte en reduksjon i ReepB-GFP-berikelse til spindler (p<0,001 for alle prøver ved T210) sammenlignet med kontroller (B) (p<0,001 for alle prøver ved T210). Dette tallet er endret fra Diaz et al.15. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61589/61589fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>1. Gjær Pasta21</td>
			<td>2. Drueplater21</td>
			<td>3. Heptane Lim24</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,1 Tilsett 7 gram aktiv tørr gjær til en 50 ml konisk. Tilsett 9 milliliter DI vann og bland til jevn utholdenhet med en metallspatel.</td>
			<td>2.1 Gjør løsningen a: Tilsett 6 gram agar til 140 ml DI-vann i en 250 ml kolbe og autoklav den.</td>
			<td>3.1 Fyll et hetteglass med glassscintillation med 50 tommer dobbeltsidig tape.</td>
		</tr>
<tr>
<td>1,1 Tilsett 7 gram aktiv tørr gjær til en 50 ml konisk. Tilsett 9 milliliter DI vann og bland til jevn utholdenhet med en metallspatel.</td>
			<td>2.2 Lag løsning b: Bland 0,1 gram metylparaben i 2 ml etanol, og tilsett deretter denne løsningen til 60 ml grapefruktjuicekonsentrat.</td>
			<td>3.2 Tilsett 20 ml heptane og forsegle glass scintillation hetteglass med parafilm. Roter over natten ved romtemperatur.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.3 Umiddelbart etter autoklaveringsoppløsning a, bland i løsning b og hell blandingen i 10 x 35mm pertiretter. (lager 35 drueplater)</td>
			<td>3.3 Fjern plasttapeavfall ved å overføre lim til 2 15 ml koniske rør og sentrifugering ved 3000 o/min i 15 minutter.</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td>2.4 La drueplatene stilles inn ved romtemperatur over natten med avplatelokk. Dekkplater med lokk og oppbevares i 4C° etter at de er innstilt.</td>
			<td>3.4 Overfør limsupernatant til 1,5 ml mikrocentrifugerør for oppbevaring.</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabell 1: Oppskrifter av medier og løsninger.

Watch this Scientific Journal Video about Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer at JoVE.com

Drosophila Embryo Preparation and Microinjection for Live Cell Microscopy Performed using an Automated High Content Analyzer

Presentert her er en protokoll for mikroinject og samtidig bilde flere Drosophila embryoer under embryonal utvikling ved hjelp av en plate-basert, høyt innhold imager.

Drosophila Embryo Forberedelse og Microinjection for Live Cell Mikroskopi Utført ved hjelp av en automatisert høyinnholdsanalysator

Modern approaches in quantitative live cell imaging have become an essential tool for exploring cell biology, by enabling the use of statistics and ...

Denne protokollen muliggjør et samtidig oppkjøp av flere embryoer i løpet av en bildeøkt. Mens prøveforberedelse er tilpasset flerpunktsoppkjøp ved hjelp av en høyinnholdsanalysator, kan prøver utarbeidet ved hjelp av denne protokollen avbildes på et hvilket som helst omvendt mikroskop som er i stand til flerpunktsinnhenting. For å begynne, organisere to rader med 15 til 20 embryoer på en ren del av flott plate ved hjelp av et eggplukkerverktøy.Juster embryoene på deres ventrale side i samme retning med hensyn til fremre og bakre ender. Fest en avstandsslipp på en dekkslips og strek 10 mikroliter heptant lim ned den eksponerte dekkglassglassinnsett. Mens limet tørker, bruk et barberblad til å kutte et rektangel rundt de to radene med embryoer.Klipp et annet rektangel ved siden av det første og fjern det andre rektangelet med en rett kantside av en slikkepott i rustfritt stål. Skyv forsiktig den rette kanten av slikkepotten under det første rektangelet og fjern den. Deretter plasserer du utskjæringen med embryoer på utsiden av en 3,5 centimeter rett.Under et stereomikroskop senker du et forberedt dekkslipp over embryoene og trykker forsiktig de to radene med embryoer på limet. Hvis du ikke utfører mikroinjeksjon, fyll silikonromsret halvveis til toppen med en-til-en halokarbonolje 700 til halokarbonolje 27. Linje de nederste kantene av en fire-slide plate adapter med dobbeltsidig tape.Dette hindrer at lysbildet beveger seg under bildebehandling. Pass på at du ikke plasserer båndet i banen til objektivobjektivet. Monter dekkglasset på fire-slide plate adapteren.Hvis mikroinjisering av embryoene, plasser dekkslippen med embryoer over et lysbilde for å hindre at bunnen av dekkslippen blir skitten under utsication og mikroinjeksjon. Uttørs embryoene i fem til 10 minutter, og dekk dem umiddelbart med en-til-en halokarbonolje 700 til halokarbonolje 27, og fyll silikonromleren halvveis til toppen. Legg to eller tre mikroinjeksjonsnåler med omtrent to mikroliter injektor ved hjelp av en utvidet lastspiss.Monter en nål på mikroinjektoren og trykk stempelet halvveis ned til spissen, noe som øker lufttrykket inne i glasskapillæren. Senk glassnålen på et glasssklie og kutt tuppen av nålen med en ny nummer ni barberhøvel, kutte i en 45 graders vinkel for å produsere en skarp åpen spiss. Injektoren skal strømme ned til bunnen av spissen uten å strømme ut av nålen.Tilsett forsiktig 20 mikroliter halokarbonolje over spissen av nålen og kutt den på nytt i en 45 graders vinkel. Injektoren skal begynne å strømme raskt, så husk å justere trykket ved å trekke stempelet tilbake. Bruk mikromanipulatoren til å plassere nålen i midten av synsfeltet.Løft deretter nålen og fjern glasssklie fra under den. Plasser embryoene på stereomikroskopstadiet, under mikroinjeksjonsnålen og fokuser på dem ved 50 ganger forstørrelse. Senk nålen til den kommer inn i samme fokusplan som embryoene.Flytte lysbildet med den ene hånden og betjene mikroinjektoren med den andre, injisere en rad med embryoer. Hev nålen og roter lysbildet 180 grader for å utsette den andre raden med embryoer for mikroinjeksjonsnålen. Senk nålen og injiser den andre raden med embryoer.Denne protokollen ble brukt til å undersøke rollen som mikrotubuli i endoplasmaisk reticulum omorganisering under mitose i Drosophila embryo. Effekten av flere mikroinjiserte medikamentell behandling på ER-omorganisering ble kvantitativt sammenlignet. Kolkisin, som forhindrer ny mikrotubulepolymerisering, ble funnet å drastisk redusere lokaliseringen av ER for å spindelpoler under mitose.Tidsforløp av bildedata ble innhentet for 32 embryoer. Målinger av gjennomsnitt og maks intensitet ble analysert fra 12 800 interesseområder ved hjelp av et egendefinert MATLAB-skript. Når du prøver denne protokollen for første gang, husk å ikke ta for lang tid på ett trinn, ellers risikerer du å gå glipp av utviklingsstadiet du vil bilde.Øv på denne protokollen trinnvis før du prøver eksperimenter. Vår metode for prøveforberedelse letter et samtidig oppkjøp av flere embryoer under ett eksperiment, og genererer dermed nok eksperimentelle repliker for kvantitativ analyse. Denne protokollen kan hjelpe utviklingsembryoologi overgang fra kvalitative til kvantitative bildeforsøk.Evnen til å bilde flere embryoer i en bildeøkt eliminerer også eksperimentell støy mellom repliker.

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Mikroinjeksjon og Electroporation i chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-scale Preparation of Drosophila Embryo Extracts for Proteomic Experiments

Medium-skala forberedelse av<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryoekstrakter for proteomiske eksperimenter

Analysis of protein-protein interactions (PPIs) has become an indispensable approach to study biological processes and mechanisms, such as cell signaling, ...

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule Cultivation for Live-cell Imaging of Zygote Polarization and Embryo Patterning in Arabidopsis thaliana

In Vitro Ovule dyrking for Live-celle Imaging av zygoten polarisering og Embryo mønstre Arabidopsis thaliana

In most flowering plants, the zygote and embryo are hidden deep in the mother tissue, and thus it has long been a mystery of how they develop dynamically; ...

High-resolution Episcopic Microscopy (HREM) - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

High-resolution Episcopic Microscopy HREM - Simple and Robust Protocols for Processing and Visualizing Organic Materials

Høyoppløselig episkopisk mikroskopi (HREM) - Enkle og robuste protokoller for behandling og visualisering av organiske materialer

We provide simple protocols for generating digital volume data with the high-resolution episcopic microscopy (HREM) method. HREM is capable of imaging ...

Live Cell Imaging of Chromosome Segregation During Mitosis

Levende celle Imaging av kromosom segregering under mitose

Chromosomes must be reliably and uniformly segregated into daughter cells during mitotic cell division. Fidelity of chromosomal segregation is controlled ...

Microinjection-based System for In Vivo Implantation of Embryonic Cardiomyocytes in the Avian Embryo

Microinjection-basert System for i Vivo implantering av embryonale Cardiomyocytes i Avian Embryo

Interpreting the relative impact of cell autonomous patterning versus extrinsic microenvironmental influence on cell lineage determination represents a ...

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging and Analysis of Muscle Contractions in Drosophila Embryo

Live Imaging og analyse av muskelsammentrekninger i Drosophila embryo

Coordinated muscle contractions are a form of rhythmic behavior seen early during development in Drosophila embryos. Neuronal sensory feedback circuits ...

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Thawing, Culturing, and Cryopreserving Drosophila Cell Lines

Tiner dyrking og Cryopreserving Drosophila linjer

There are currently over 160 distinct Drosophila cell lines distributed by the Drosophila Genomics Resource Center (DGRC). With genome engineering, the ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropic lys-ark mikroskopi og automatisert Cell Lineage analyser til katalog Caenorhabditis elegans embryogenesis med Subcellulære oppløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Preparation of Drosophila Larval and Pupal Testes for Analysis of Cell Division in Live, Intact Tissue

Utarbeidelse av Drosophila Larval og Pupal Testiklene for analyse av celledivisjon i Live, intakt vev

Experimental analysis of cells dividing in living, intact tissues and organs is essential to our understanding of how cell division integrates with ...